多重RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳法檢測BCR-ABL融合基因

呂曉楠，葉輝銘，2，顧 龍，曾驥孟

(1.廈門大學藥學院轉化醫(yī)學中心，福建廈門361005;2.廈門大學附屬中山醫(yī)院臨檢中心，福建廈門361004)

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是第一個將染色體異常與特定的腫瘤類型聯(lián)系在一起的惡性血液性疾病，占成人白血病的15%，在我國年發(fā)病率為0.36/10萬人[1]。超過95%以上的CML患者由于染色質異常產生基因融合(如BCR-ABL)，染色體顯帶分析為t(9;22)(q34;q11)，即費城染色體(philadelphia chromosome，Ph)[2]。融合基因編碼一種酪氨酸激酶，誘導多種致癌性的信號通路，這是CML發(fā)病的主要分子機制之一。因BCR和ABL基因斷裂點不同，產生多種多樣的融合形式，臨床上最常見的是e1a2、e13a2 和 e14a2[2]。CML 的治療方案也多是針對Ph陽性細胞系或BCR-ABL蛋白本身進行的，例如利用靶向藥物伊馬替尼(Imatinib)來抑制BCA-ABL通路[3]。因此BCR-ABL融合基因的檢測對于CML的分型診斷、分子機制研究以及治療方案選擇、預后判斷等都有著重要意義。

目前融合基因的檢測方法主要有染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)以及逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR，RT-PCR)等。染色體核型分析雖是臨床上常規(guī)檢測手段，但對樣本和技術要求高，檢測靈敏度低，尤其對于微小染色體易位難以檢測出，故臨床上通常還需要分子生物學等手段來進一步驗證[4]。FISH雖可清晰的辨認各染色體結構異常，但價格昂貴，操作繁瑣，假陽性率較高(＞10%)，且當Ph陽性細胞數(shù)＜10%時即不適用[5]。相對于前兩者，PCR擴增法對于樣本要求不高，且具有檢測快速，敏感度高等優(yōu)點。因此，我們擬采用RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳技術一次性檢測BCR-ABL融合基因多種融合形式(如e1a2、e13a2、e14a2)，以期建立一種快速、簡單、有效的檢測方法，用以CML輔助診斷、分型、預后判斷以及療效評價等。

材料和方法

一、對象

血液樣本均來源于廈門大學附屬中山醫(yī)院，其中融合基因陽性模板構建樣本來自體檢中心健康體檢者，研究病例來自血液科2010年至2013年住院的CML患者50例，男34例，女16例，年齡15～85歲，全部病例經(jīng)過臨床血象、骨髓象等形態(tài)學檢測初步確診，且均進行了染色體核型分析，診斷標準參照血液病診斷及療效標準，具體見表1[6-8]。正常對照組為18名健康體檢者，男10名，女8名，年齡18～70歲。

表1 CML的診斷標準

二、方法

1.血液樣本RNA提取和cDNA模板第一鏈合成 CML患者及體檢者外周抗凝全血5mL，采集后盡快進行RNA抽提，以防時間過長或反復凍融后損壞RNA的品質。設備為MagCoreHF16全自動核酸抽提儀及其配套全血RNA抽提試劑盒(廈門芮寶生醫(yī)股份公司)，操作嚴格按儀器和試劑盒說明書;并用TransScript cDNA第一鏈合成試劑盒(北京全式金公司)進行反轉錄后，將cDNA模板分裝，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.BCR-ABL融合基因陽性模板構建 采用重疊延伸PCR法[9]構建BCR-ABL的3種融合形式，作為陽性對照品。遵循其原理步驟，我們以正常血液cDNA(無BCR-ABL融合基因)為模板，采用TransGen高保真酶熱啟動酶FastPfu(北京全式金公司)，首先分別擴增ABL和BCR基因，產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳、對目的片段切膠、用膠回收試劑盒(上海生工)回收，再以2種回收的產物為模板(保持使用量均等)，在同1個PCR反應體系里進行融合擴增。每個目標產物設置2個平行，1個陰性對照，陰性對照里不加模板，以檢測PCR體系中的試劑是否被污染。將回收的PCR產物連接到 TransGen pEASY-Blunt載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選單克隆進行測序驗證。

3.引物設計 BCR基因以其在NCBI中的登錄號NM_004327上的mRNA序列為準，ABL基因則以文獻中常見的登錄號X16416上的mRNA序列為準。擴增所需引物(表2、表3)的設計均通過軟件 Primer Premier v 5.00進行，并經(jīng) BLAST比對確認其特異性。設計好的引物由上海生工合成，回來后進行稀釋，分裝成多管保存在－20℃，避免反復凍融。

表2 構建陽性模板的引物設計

表3 檢測融合基因的多重引物設計

4.多重RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測體系的建立與優(yōu)化 初始反應體系:10×PCR緩沖液2.5μL，2.5 mmol Mg2+2μL，2.5 mmol dNTPs 2μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.5μL，5 U/μL TaqDNA 聚合酶 0.4μL，cDNA 模板 5μL，加雙蒸水，補足反應總體積為25μL。PCR擴增條件:95℃ 1 min;95℃ 30 s，66～61℃ 30 s(每個循環(huán)降低1℃)，72 ℃ 20 s，5 個循環(huán);95 ℃ 30 s，61 ℃30 s，72℃ 20 s，25個循環(huán)。影響多重RT-PCR反應的因素很多[10]，如退火溫度、酶用量、引物對的濃度等。本研究采用了退火溫度Touchdown的PCR反應程序[11]，故在此不再進行退火溫度的優(yōu)化，主要對后兩種影響因素進行了條件實驗，在其它參數(shù)不變的情況下，依次改變1個參數(shù):(1)優(yōu)化酶用量:從1.0 ～2.5 U，每梯度相差 0.5U;(2)引物濃度:從 0.08 ～ 0.2 μmol/L，每濃度梯度相差0.04 μmol/L。通過考察是否有引物二聚體產生、存在特異引物等選擇最佳反應體系。檢測體系采用了毛細管電泳檢測(BIOptic's Qsep100 DNA-CE，臺灣)[12]，使用的是熔融態(tài)成型的二氧化硅毛細管柱，內徑75μL，柱長150 mm，緩沖液為 Mops-Tris(pH 值 7.55)。上樣體積0.5μL，25℃下4 kV 15 s電動進樣，8 kV恒壓電泳，在590 nm處檢測激光誘導的溴化乙錠的發(fā)射波長。

5.多重RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測體系的性能評估 (1)靈敏度分析:將構建的陽性模板(e1a2、e13a2和e14a2)質粒均進行10倍梯度稀釋，即稀釋成100～107拷貝/μL 8個濃度梯度，在優(yōu)化的PCR條件下進行反應，分析該方法最低檢測拷貝。每個濃度梯度作2個平行反應，每次實驗均設置1個陰性對照(以滅菌超純水為模板);(2)特異性分析:檢測18名健康體檢者外周血融合基因，觀察此方法的特異性;(3)模擬分析:將構建成功的 BCR-ABL融合模板(e1a2、e13a2、e14a2，105 拷貝/μL)分別與正常人血液cDNA(50 ng/μL)進行混合，模擬自建方法檢測臨床陽性樣本的情況。

6.多重RT-PCR體系檢測臨床樣本的BCRABL融合基因 用自建的多重RT-PCR結合毛細管電泳技術平行檢測50例CML患者患者。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用McNemar檢驗和一致性檢驗分析，評價建立的多重RT-PCR法的陽性率以及與熒光定量PCR法結果總符合率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、成功構建BCR-ABL融合基因陽性模板

通過重疊延伸法，第1次PCR分別得到擴增產物BCR-1/2/3(468/142/217 bp)和ABL-1/2/3(291/295/297 bp)，第2次融合擴增PCR反應得到 BCR-ABL基因的 3種融合形式，即 e1a2(724bp)，e13a2(398bp)，e14a2(473bp)。2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1、2。以超純水作為陰性對照。

圖1 融合形式e1a2模板構建電泳圖

圖2 融合形式e13a2和e14a2模板構建電泳圖

二、多重RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測體系的建立與優(yōu)化

分別設置的1.0～2.5 U的酶用量梯度以及0.08 ～ 0.2 μmol/L 的引物濃度梯度結果顯示BCR-ABL融合基因PCR體系中最佳酶和引物用量分別為 0.2μL 和 0.3μL。因此，建立的多重RT-PCR最佳反應體系為:10 PCR緩沖液2.5μL，2.5 mmol Mg2+2μL，2.5 mmol dNTPs 2μL，10 μmol/L 上下游共 3 條引物各 0.3μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，構建的陽性模板 cDNA 5μL，加雙蒸水，補足反應總體積為 25μL。PCR擴增產物分別進行毛細管電泳結果與2%瓊脂糖電泳，電泳結果一致，但毛細管電泳能夠準確的計算出產物長度，進樣量少，操作自動化，方便臨床大批量樣本快速、準確、直觀的檢測。

三、檢測性能評價

1.靈敏度分析 將 e1a2、e13a2和 e14a2 3種模板以10倍梯度稀釋，系列稀釋樣本檢測結果見圖3。e1a2本法的最低檢測限為102拷貝/μL，e13a2和e14a2均為103拷貝/μL。

2.特異性分析 18名健康體檢者外周血標本中均未檢測到BCR-ABL融合基因，表明本法具有良好的特異性。

3.模擬分析 陽性模板與正常人血液混合后的模擬樣本檢測結果如圖4，3～6號混合標本電泳出現(xiàn)的條帶與預期一致，正常血液無陽性電泳結果。

圖3 靈敏度分析電泳結果

圖4 模擬血液環(huán)境中檢測到的e1a2、e13a2、e14a2毛細管電泳圖

四、臨床樣本檢測

應用自建的多重RT-PCR聯(lián)合毛細管電泳方法對50例CML的患者外周血進行融合基因檢測，BCR-ABL融合基因陽性率為86.0%(43/50)，其中e13a2型20.0%、e14a2型66.0%，陽性率較低與本組病例中包括6例復診者有關。與骨髓細胞培養(yǎng)染色體核型分析比較，本方法檢測BCRABL融合基因的陽性符合率為97.6%(41/42)，陰性符合率為75.0%(6/8)，總符合率為94.0%(47/50)，2種方法具有較高的一致性(Kappa=0.765，P ＞0.05)(表 4)。

以1例CML患者為例，其檢測結果見圖5。患者的電泳結果與e14a2陽性對照模板處于一個位置，即表示此CML患者存在BCR-ABL融合基因的e14a2融合形式。檢測中以正常血液為陰性對照，確保此方法特異性;以構建的陽性模板為陽性對照;以超純水做模板為空白對照，以排除試劑污染。

表4 2種方法檢測BCR-ABL融合基因結果比較

圖5 檢測患者樣本融合基因的色譜圖

討 論

目前，臨床實驗室進行白血病診斷分型需要聯(lián)合通過形態(tài)學(morphology，M)、免疫學(immunology，I)、細胞遺傳學(cytogenetics，C)和分子生物學(molecular biology，M)檢查，即MICM 分型系統(tǒng)。就CML而言，由于超過95%患者具有費城染色體，故細胞遺傳學方法如核型分析即為初始判斷CML的常規(guī)手段。然而，這個方法樣本要求高，靈敏度低(一般在5%以上)，無法檢測到細微的染色體易位(約占所有患者的5%)[13]，故臨床上還需要輔助手段來進一步驗證。

早期檢測融合基因的PCR法常將多重PCR與巢式PCR結合，該類方法靈敏度(10－4～10－5)高，在微小殘留性疾病的監(jiān)測上具有重要意義[4，14]，但是由于進行2次 PCR 反應很容易造成污染導致假陽性，且操作相對繁瑣、費時。熒光定量PCR技術具有可定量，自動化程度較高，靈敏度高等優(yōu)點，在一些大型醫(yī)療應用上較廣泛，但目前用于白血病BCR-ABL融合基因分析的熒光PCR法多為單項目檢測，檢測儀器昂貴和試劑的成本高也限制了其臨床應用。本研究的目的在于建立一種快速、簡單、成本低且能有效檢測BCRABL融合基因的方法，主要用以作為臨床早期判斷費城染色體的輔助手段。本研究設計的檢測體系只需在1個PCR反應管里，即可同時檢測多種BCR-ABL融合基因亞型，操作更加方便，且極大的降低了試劑成本。此外，本研究采用毛細管電泳作為檢測系統(tǒng)，自動化程度高，可一次性快速檢測大批量的樣本，樣本量消耗少(進樣量最小為0.5μL)，能同時生成電泳圖以及色譜圖，通過分析軟件可直接讀出樣本擴增長度，若結合自動判讀程序，可直接判斷出具體的BCR-ABL融合基因亞型。本法可在3 h內完成從標本核酸提取到電泳出結果，給出檢測報告，完全滿足臨床檢測要求。初步的性能分析顯示建立的PCR法其檢測靈敏度高、特異性好;模擬樣本顯示其具有多重檢測能力，可1次性檢測出臨床上多種融合亞型共存的患者;與骨髓細胞染色體核型分析一致性好。

費城染色體的形成即是位于9號染色體上q34區(qū)的ABL基因3端斷裂片段連接到22號染色體上q11區(qū)的BCR基因5端斷裂處，融合形成新型基因BCR-ABL。BCR和ABL基因斷裂點并不止一種，故會產生不同的融合形式，最常見的就是ABL基因內含子1和BCR基因內含子1、13或者14位置斷裂后融合形成的轉錄子e1a2、e13a2或 e14a2。其中 e1a2編碼 190-kD蛋白 P190，e13a2和e14a2編碼1種210-kD蛋白，即 P210，這2種融合形式在CML細胞中以1種存在或共存(5%)[2]。這些融合形式編碼的融合蛋白都是一種酪氨酸激酶，但因其結構的差異使得它們在臨床特征，對藥物的反應性以及預后方面并不相似，因此清晰的區(qū)分各融合形式對于藥物選擇以及療效評價方面都具有重要意義。染色體核型分析技術雖可辨別出染色體異常現(xiàn)象，但卻并不清楚具體異常，PCR法則可針對不同的融合模板進行引物設計來具體區(qū)分。融合模板通常可從細胞或質粒中獲得，但一種陽性細胞系只對應一種融合形式，故多種融合模板檢測需要足夠的細胞系，這無疑增加了實驗的成本。因此，本研究采用了重疊PCR法來構建融合基因陽性模板(e1a2、e13a2和e14a2)，其原理見圖6。它的特點就是在2條基因連接處的引物設計中添加了能夠與對方基因互補配對的堿基序列尾巴，從而通過堿基互補配對原則將兩條基因連接起來，且連接處無添加額外堿基。所以構建融合基因模板的引物設計尤為重要，根據(jù)這3種融合形式(e1a2、e13a2和e14a2)具體的融合點，才能獲得準確的融合模板。根據(jù)本研究的方案，可設計出各種可能融合模式的檢測方法，用于CML分子發(fā)病機制研究。

圖6 重疊延伸PCR法原理

本法在CML診斷分型、藥物選擇上具有實際應用價值，但在微小殘留性疾病監(jiān)測上還有待進一步研究。課題組正不斷搜集各類、各期CML樣本，包括典型和非典型的，初/復診、復發(fā)型等。在后續(xù)工作中，將以所構建的各融合基因(e1a2、e13a2、e14a2)模板穩(wěn)定轉染到陰性HL-60細胞系中，與正常血液混合后采用本方法定性、定量檢測每mL血液中的異常細胞數(shù)，為本方法在微小殘留性疾病的分析和檢測監(jiān)測上提供進一步的性能評價。此外，費城染色體雖是CML的標志，存在于95%以上的CML患者中，但在急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，急性髓性細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者中也有顯著的發(fā)生率。其中e1a2主要存在于70%Ph+ALL 以及少數(shù) CML、AML 細胞中[15]，e13a2和e14a2則主要存在于95%以上的CML和25%以上的Ph+ALL細胞中[16]。因此，本研究建立的多重RT-PCR方法同樣也適用于BCRABL陽性的ALL以及AML患者的早期診斷。總之，本研究建立了一種快速、簡便、價廉的多重RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因常見亞型的方法，該方法適合臨床上CML的輔助診斷、分子分型和治療方案選擇。

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