二葉式主動脈瓣畸形相關(guān)GATA5基因突變譜分析

徐 蕾，袁 方，李若谷，王 倩，鄭洪珍，楊奕清

(上海交通大學附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科，上海200030)

先天性二葉式主動脈瓣畸形(bicuspid aortic valve，BAV)是人類最常見的先天性心臟病，其在一般人群中的發(fā)病率約為0.5% ～2.0%，男性發(fā)病率較女性高，男女之比約為3∶1[1]。BAV 患者容易出現(xiàn)許多嚴重并發(fā)癥，如主動脈瓣反流、主動脈瓣狹窄、主動脈擴張甚至主動脈瘤、主動脈夾層、血栓形成和感染性心內(nèi)膜炎等[2-3]，明顯增加了患者的病殘率和病死率。遺傳流行病學研究發(fā)現(xiàn)BAV具有顯著的家族聚集性，BAV患者一級親屬的患病率在9% ～24%，遺傳度可高達89%，提示遺傳缺陷是BAV的重要病因[4]。通過連鎖分析和候選基因分析，目前已經(jīng)定位了至少4個BAV基因座并發(fā)現(xiàn)了多個 BAV相關(guān)基因，如NOTCH1和KCNJ2[5-6]。然而大部分BAV患者的致病基因仍有待于識別。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心臟轉(zhuǎn)錄因子基因GATA5在心血管發(fā)育方面起著重要作用[7]。動物實驗表明，小鼠敲除GATA5基因可導致BAV[8]。在人類，GATA5基因突變可導致心臟間隔缺損、法洛四聯(lián)癥、右室雙流出道和BAV等心血管結(jié)構(gòu)缺陷以及心房顫動等[9-14]。然而，BAV相關(guān)GATA5基因突變譜仍有待進一步研究。

材料和方法

一、對象

選取2011年1月至2013年6月上海交通大學附屬胸科醫(yī)院就診、無血緣關(guān)系的先天性BAV患者150例，其中男81例，女69例，年齡32～65歲;另同期選取200名無血緣關(guān)系的健康對照者作為正常對照組，其中男106名，女94名，年齡30～62歲。所有對象均為中國漢族人，均知情同意。臨床評估包括詳細病史、全面體檢以及心臟超聲和心電圖檢查。

二、方法

1.標本采集 所有對象均采集外周靜脈血3 mL，置于含有0.5 mL抗凝劑(枸櫞酸、枸櫞酸鈉、葡萄糖混合液)的試管中，混勻后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.基因組DNA的抽提 使用基因組DNA(genomic DNA，gDNA)抽提試劑盒(美國Promega公司)，按照操作說明書自全部研究對象的外周靜脈血標本抽提gDNA。

3.擴增GATA5基因編碼區(qū)和剪接點的引物設計及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中GATA5基因的 gDNA序列(登陸號:NT_011362)，利用Primer 3.0軟件計算機輔助在線設計6對引物以擴增GATA5基因的6個編碼外顯子(外顯子2～7)及其2側(cè)的部分內(nèi)含子。引物序列見表1[13]，引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 擴增GATA5基因編碼外顯子和剪接點的引物序列

4.GATA5基因目的片段的擴增 以研究對象的gDNA為模板，采用HotStar Taq DNA聚合酶等聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑(德國Qiagen公司)，分別使用上述6對引物在ABI PE9700熱循環(huán)儀(美國ABI公司)上通過PCR擴增目的基因片段。使用QIAquick凝膠回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化擴增產(chǎn)物。

5.GATA5基因目的DNA片段的測序 使用Big Dye Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒(美國ABI公司)在ABI PRISM 3130 XL型DNA分析儀(美國ABI公司)上對每一純化的PCR產(chǎn)物進行測序。測序引物同上述用于特定區(qū)域擴增的引物。使用5.1版本DNA測序分析軟件(美國ABI公司)分析測序結(jié)果并將所測序列與GenBank中的已知GATA5序列(登陸號:NM_080473)進行比對以識別基因變異。對于所識別的基因變異，檢索PubMed和SNP 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)以及萬方數(shù)據(jù)庫(http://www.wanfangdata.com.cn)以明確是否已有報道。

6.多物種GATA5蛋白序列比對分析 采用在線分析程序 MUSCLE V3.6(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對比分析多物種 GATA5蛋白氨基酸序列。

7.GATA5突變的致病性預測 使用在線程序MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)預測所識別的GATA5突變的致病性，并給出正確預測的概率值(該值越接近1表示預測的正確性越高)。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、GATA5基因突變分析

臨床評估發(fā)現(xiàn)BAV組均無明顯的BAV傳統(tǒng)危險因素，如母親孕期服用藥物、病毒感染以及接觸毒物或放射線照射等。通過測序分析發(fā)現(xiàn)150例BAV患者中有2例患者發(fā)現(xiàn)了2種GATA5雜合錯義突變，突變率約為1.33%;在正常對照組中均未發(fā)現(xiàn)這2種GATA5基因突變。經(jīng)檢索PubMed數(shù)據(jù)庫、SNP數(shù)據(jù)庫以及萬方數(shù)據(jù)庫，這2種GATA5基因突變均無報道，提示為新突變。

具體而言，在1例57歲男性散發(fā)性BAV患者中，其GATA5基因編碼核苷酸序列第657位的鳥嘌呤(guanine，G)變?yōu)榘奏?cytosine，C)，即c.657G＞C突變，導致GATA5基因編碼氨基酸序列第219位的蛋氨酸(methionine，M)變?yōu)楫惲涟彼?isoleucine，I)，即 p.M219I突變。GATA5 基因c.657G＞C突變及其對照序列見圖1。

注:箭頭所指分別為GATA5基因野生型純合子G/G和突變型雜合子G/C序列

在另1例46歲女性散發(fā)性BAV患者中，其GATA5基因編碼核苷酸序列第866位的C變?yōu)樾叵汆奏?thymine，T)，即 c.866C ＞T突變，導致GATA5基因編碼氨基酸序列第289位的蘇氨酸(threonine，T)變?yōu)?I，即 p.T289I突變。GATA5 基因c.866C＞T突變及其對照序列見圖2。

GATA5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與顯示BAV相關(guān)基因突變的示意圖見圖3。

二、被改變氨基酸保守性分析

多物種GATA5蛋白序列比對顯示被改變氨基酸在進化上均完全保守，提示這些氨基酸在GATA5功能上十分重要。見圖4。

圖2 GATA5基因c.866C＞T突變及其對照序列

圖3 標示BAV相關(guān)突變位點的GATA5蛋白質(zhì)結(jié)示意圖

圖4 多物種GATA5蛋白氨基酸序列比對結(jié)果

三、所識別的GATA5基因突變的致病性分析

經(jīng)MutationTaster預測，所識別的GATA5基因變異c.657G＞C和c.866C＞T均為致病性突變，預測正確的概率值分別為0.999 999 991 295 232和0.999 999 996 908 734。在 MutationTaster數(shù)據(jù)庫中，沒有報道本研究所發(fā)現(xiàn)的GATA5基因變異，進一步表明這些GATA5基因變異是新突變。

討 論

本研究在2例無血緣關(guān)系的家族史陰性的BAV患者發(fā)現(xiàn)了2種新的GATA5基因突變p.M219I和 p.T289I，這些突變不存在于 200 名無血緣關(guān)系的健康對照者中。多物種GATA5蛋白序列比對顯示被改變的氨基酸在進化上完全保守，計算機功能模擬分析提示這些突變具有致病性。因此，GATA5基因突變很可能是這2例BAV患者發(fā)病的分子病因，但確切的致病機制和致病性的大小仍有待于研究。

人類GATA5基因定位于20q13.33，編碼一種由397個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，在心臟發(fā)育期間調(diào)節(jié)多個靶基因的表達，包括心房利鈉肽、α-肌凝蛋白重鏈、β-肌凝蛋白重鏈、心肌肌鈣蛋白C和心肌肌鈣蛋白 I[15-16]。因此，GATA5基因突變很可能通過影響這些對心血管正常發(fā)育至關(guān)重要的靶基因的表達而促發(fā)心血管畸形。

GATA5基因缺陷對心血管畸形的誘導作用已經(jīng)被一些動物實驗證實。在斑馬魚中，GATA5基因敲除可因心內(nèi)膜和心肌分化遷移障礙而導致胚胎死亡[17]。在小鼠中，GATA5基因敲除或心內(nèi)膜細胞特異性失活GATA5均可導致BAV，外顯率可達 25%[8]。另外，GATA5和 GATA4或 GATA5和GATA6雙基因敲除雜合子小鼠在胚胎期或出生后不久即死亡，主要是由于心臟流出道發(fā)育嚴重缺陷如右室雙流出道、室間隔缺損等[18]。這些實驗結(jié)果表明GATA5基因?qū)π难芟到y(tǒng)的正常發(fā)育具有關(guān)鍵調(diào)控作用。

GATA5基因變異與人類BAV的關(guān)系以前也有報道。Padang等[12]對100例無血緣關(guān)系的BAV患者的GATA5基因的編碼外顯子和其兩側(cè)的部分內(nèi)含子進行了測序分析，結(jié)果在4例患者發(fā)現(xiàn)了4種 GATA5基因錯義突變，即 p.Q3R、p.S19W、p.Y142H 和 p.G166S，突變率為 4%。這些新發(fā)現(xiàn)的GATA5基因突變的致病作用大小及其機制也有待研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了BAV相關(guān)GATA5基因新突變，揭示了BAV新的分子病因，這不僅有助于揭示BAV新的分子機制，也有助于BAV患者的危險分層、早期預防和個體化治療。

[1]Go AS，Mozaffarian D，Roger VL，et al.Heart disease and stroke statistics-2013 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation，2013，127(1):e6-e245.

[2]Siu SC，Silversides CK.Bicuspid aortic valve disease[J].J Am Coll Cardiol，2010，55(25):2789-2800.

[3]Alegret JM，Ligero C，Vernis JM，et al.Factors related to the need for surgery after the diagnosis of bicuspid aortic valve:one center's experience under a conservative approach[J].Int J Med Sci，2013，10(2):176-182.

[4]Cripe L，Andelfinger G，Martin LJ，et al.Bicuspid aortic valve is heritable[J].J Am Coll Cardiol，2004，44(1):138-143.

[5]Garg V，Muth AN，Ransom JF，et al.Mutations in NOTCH1 cause aortic valve disease[J].Nature，2005，437(7056):270-274.

[6]Andelfinger G，Tapper AR，Welch RC，et al.KCNJ2 mutation results in Andersen syndrome with sexspecific cardiac and skeletal muscle phenotypes[J].Am J Hum Genet，2002，71(3):663-668.

[7]Peterkin T，Gibson A，Loose M，et al.The roles of GATA-4，-5 and-6 in vertebrate heart development[J].Semin Cell Dev Biol，2005，16(1):83-94.

[8]Laforest B，Andelfinger G，Nemer M.Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve[J].J Clin Invest，2011，121(7):2876-2887.

[9]Jiang JQ，Li RG，Wang J，et al.Prevalence and spectrum of GATA5 mutations associated with congenital heart disease[J].Int J Cardiol，2013，165(3):570-573.

[10]Wei D，Bao H，Zhou N，et al.GATA5 loss-of-function mutation responsible for the congenital ventriculoseptal defect[J].Pediatr Cardiol，2013，34(3):504-511.

[11]Wei D，Bao H，Liu XY，et al.GATA5 loss-of-function mutations underlie tetralogy of fallot[J].Int J Med Sci，2013，10(1):34-42.

[12]Padang R，Bagnall RD，Richmond DR，et al.Rare non-synonymous variations in the transcriptional activation domains of GATA5 in bicuspid aortic valve disease[J].J Mol Cell Cardiol，2012，53(2):277-281.

[13]Yang YQ，Wang J，Wang XH，et al.Mutational spectrum of the GATA5 gene associated with familial atrial fibrillation[J].Int J Cardiol，2012，157(2):305-307.

[14]Wang XH，Huang CX，Wang Q，et al.A novel GATA5 loss-of-function mutation underlies lone atrial fibrillation[J].Int J Mol Med，2013，31(1):43-50.

[15]Nemer G，Qureshi ST，Malo D，et al.Functional analysis and chromosomal mapping of Gata5，a gene encoding a zinc finger DNA-binding protein[J].Mamm Genome，1999，10(10):993-999.

[16]Pikkarainen S，Tokola H，Kerkel? R，et al.GATA transcription factors in the developing and adult heart[J].Cardiovasc Res，2004，63(2):196-207.

[17]Heicklen-Klein A，McReynolds LJ，Evans T.Using the zebrafish model to study GATA transcription factors[J].Semin Cell Dev Biol，2005，16(1):95-106.

[18]Laforest B，Nemer M.GATA5 interacts with GATA4 and GATA6 in outflow tract development[J].Dev Biol，2011，358(2):368-378.