熒光定量PCR測定HBV DNA測量不確定度評定的探討

蔣玲麗，王雪亮，肖艷群，王華梁

(上海市臨床檢驗中心，200126)

實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是目前國內乙型肝炎病毒(HBV)檢測應用最廣泛的方法。臨床對HBV患者體內病毒復制水平或臨床抗病毒治療效果判斷普遍憑借臨床經驗，HBV DNA降低1～2個數量級被認為抗病毒治療有效，但這種經驗方法缺乏實驗數據支撐，1個可靠的檢測結果還必須依賴不確定度為臨床提供準確的參考[1]。測量不確定度代表測量結果的分散性，是1個反映測量結果質量的參數。近年來，不確定度概念逐漸引入臨床檢驗醫學領域。不確定度通常可通過“模式辦法”和“經驗辦法[2]”來評定。對于臨床實驗室檢驗，影響檢驗結果或與檢驗結果有關的因素很多，其測量不確定度評定仍存在許多有待澄清的問題。臨床實驗室中不確定度的合理評定和應用，仍需要一定的實踐、探討和一定的約定。本單位承擔著上海市醫療結構臨床基因擴增檢驗實驗室的質量監管、指導和服務職能，探討既簡便又可信的評定PCR測定HBV DNA不確定度方法對臨床實驗室開展相關工作具有借鑒意義。本文參考文獻[3]采用“經驗辦法”對實驗室的HBV DNA項目測量不確定度進行了評定，探討其可行性。

材料和方法

一、材料

1.檢測儀器 瑞士Roche公司的lightcycler實時熒光定量檢測儀、杭州博日HB-100型恒溫金屬浴、德國Biofuge-Fresc O高速冷凍離心機。

2.檢測試劑 上海科華生物工程股份有限公司生產，批號20111212。嚴格按照試劑說明書操作。

3.樣品 取2例臨床確診乙型肝炎患者血清，用于批內重復性實驗。取上海市地區性室內質控品2個濃度，批號1201，用于批間重復性實驗。

二、方法

1.測量不確定度的評定程序 利用實驗室提供的方法學性能驗證數據評定A類不確定度，分別用參加衛生部臨床檢驗中心和美國病理學家協會(CAP)組織的HBV DNA室間質評數據評定B類不確定度;本研究中所有不確定度分量全部采用標準不確定度(即標準差)表示;分別評定測量觀測值個數n=1、2、3 3種情況下的合成不確定度和擴展不確定度。

2.不確定度A類評定 實驗室可提供的方法性能參數包括批內重復性和批間重復性。(1)批內重復性分析:以不同濃度水平的2例乙型肝炎患者血清標本，重復檢測20次，計算2個濃度水平的批內標準差[s(w)];由批內重復性引起的不確定度為測量觀測值個數;(2)批間重復性分析:根據HBV DNA室內質控物高低2個濃度2012年23批次室內質控數據，分別求得2個濃度水平的批間標準差[s(b)];由批間重復性引起的不確定度。

3.不確定度B類評定 室間質量評價活動。根據本室參加2012年衛生部臨床檢驗中心和CAP HBV DNA室間質評結果，統計每個結果與靶值的差值(dn)，計算差值的平均值(dm)及其標準差由 u(bias)的大小來估計由方法偏倚(系統效應)導致的不確定度。另外，由于超出測定范圍樣品稀釋導致的不確定度亦歸不確定度B類統計，樣品稀釋檢測不在本研究范圍。

4.合成不確定度和擴展不確定度的評定根據公式確定合成不確定度擴展不確定度(U)為uc乘以包含因子(k)，取P=95%置信區間時

5.每次實驗均做室內質控，當質控結果在控時，實驗數據才能采用，否則，應重新進行檢測。

三、統計學方法

所有統計均將初始濃度值QDNA進行對數轉化為LGQ后計算。統計結果小數點后保留4位有效數字。

結 果

一、PCR測定HBV DNA 2種濃度水平，計算由批內重復性和批間重復性導致的不確定度分量見表1。

表1 批內和批間重復性引起的不確定度分量

二、PCR測定HBV DNA，通過2012年參加的衛生部和CAP反饋的室間數據，計算由方法偏倚因素引起的不確定度結果見表2。

三、PCR測定HBV DNA合成不確定度與擴展不確定度評定。見表3和表4。

討 論

由7個國際著名學術組織頒布的在計量學上有深遠影響的標準“測量不確定度表示導則(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，簡稱GUM)”，對測量不確定度評定與表示的一般規則作出了規定和說明[4]。用于實驗室認可的國際標準主要是ISO17025和ISO15189，中國合格評定國家認可委員會(CNAS)等同采用這些標準(CNAS-CL01和CNAS-CL02)，用于中國實驗室認可。2個標準均要求測量結果的不確定度。隨著實驗室認可的逐漸推廣，不確定度概念逐漸引入醫學實驗室和臨床檢驗醫學領域。PCR是目前國內HBV DNA檢測應用最廣泛的方法。在臨床應用中，同一實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同一標本檢測結果的差異，已成為困擾臨床醫師、患者及實驗室技術人員的普遍問題。臨床醫生提出檢測結果的不一致究竟是患者病毒載量的真正變化還是由檢測系統本身引起的差異，應該加以辨別。臨床實驗室必須在充分了解PCR測定的不確定性的基礎上，采取相應質控措施，才能確保實驗結果的準確性，而不致出現判斷失誤。

表2 方法偏倚不確定度

表3 合成不確定度與擴展不確定度(衛生部室間數據評定)

表4 合成不確定度與擴展不確定度(CAP室間數據評定)

目前國內PCR測定主要依靠手工進行核酸提取，整個操作步驟繁多。有國內學者指出PCR測定HBV DNA的不確定度來源包括:模板制備過程中的標本濃縮和核酸提取來源的不確定度、擴增反應體系來源的不確定度、數據處理的不確定度、相關儀器設備(如熱循環儀和移液器等)的不確定度[5]。根據不確定度來源計算每一組分的不確定度，稱為“模式辦法”;對臨床實驗室來說，不易掌握[6]，在實際的應用過程中也不可行。國內有學者提出簡化的不確定度來源計算方式，即“經驗辦法”，以此制定符合臨床實驗室實際操作的不確定度評定方法[2，7]。我們實驗室采用“經驗辦法”對HBV DNA項目的不確定度評定進行了探討。首先，收集了實驗室開展HBV DNA檢測項目之前就需完成的批內不精密度、批間不精密度等性能驗證的數據。通過這些數據進行不確定度 A類評定，本實驗室104～105和106～107U/mL計算的批內不精密度分別為3.13%和1.42%，批間不精密度分別為 4.23% 和 3.52%(未在文中列出)，上海市各醫療機構的PCR實驗室每月上報至本中心的室內質控數據，HBV DNA濃度為104～105和106～107IU/mL，其室內質控不精密度在3%～5%之間，說明本實驗室性能驗證的數據可以接受，代表了目前大多數實驗室的不精密度水平。由此評定的A類不確定度從表1可以看出，在n=1時HBV DNA的檢測濃度在104～105和106～107IU/mL時，評定得到的u(w)分別為0.136 9 和0.084 3，u(b)分別為0.205 3 和0.236 7;這也和文獻[3]計算的數據比較接近。這說明本實驗室評定的A類不確定度和其他實驗室接近。

另外，本實驗室同時參加了衛生部臨床檢驗中心和CAP組織的室間質評，通過室間質評數據評定B類不確定度，以此來估計由方法偏倚(系統效應)導致的不確定度。由于室間質評的頻次和數據較少，在評定B類不確定度時，我們未按檢測樣品濃度分組統計。2012年衛生部臨床檢驗中心共組織2次室間質評，通過7個陽性標本計算得到的方法偏倚導致的B類不確定度為0.099 7;2012年CAP組織3次室間質評，通過5個陽性標本計算得到的方法偏倚導致的B類不確定度為0.430 8;通過2個不同機構組織的室間質評數據評定B類不確定度數據差異較大。從表3和表4可以看出，當HBV DNA的檢測濃度在104～105和 106～107IU/mL，n=1，k=1.96時，通過衛生部室間質評數據計算，其擴展不確定度分別為0.521 6和0.529 8;通過CAP室間質評數據計算，其擴展不確定度分別為0.973 1和0.977 5。同一實驗室，通過不同機構的室間數據來源評定B類不確定度，其得出的擴展不確定度竟相差0.451 5～0.447 7。主要原因在于:2個機構對HBV DNA項目的評價方式不同，CAP組織HBV DNA室間質評項目以方法組的均值作為靶值;衛生部臨檢中心采用溯源至國家標準品得出的檢測值作為靶值，并不對檢測試劑進行分組，而不同品牌試劑檢測結果存在較大差異。由此可見，雖然采用“經驗辦法”評定 PCR測定 HBV DNA的不確定度簡便易行，但采用室間質評數據評定不能反映實驗室真實的測量不確定度。如果使用HBV DNA國家標準物質評定B類不確定度，可避免由于評價方式的不同造成的B類不確定度的差異。在日常檢驗工作中應用標準物質，將極大的改善不同實驗室間檢驗結果的可比性，從而逐步實現不同實驗室間檢驗結果有條件的互認[8]。目前，已有國內學者[9]提出采用測定國家標準物質評定不確定度，并指出在同一實驗室內或不同實驗室間HBV DNA測定結果進行比較或互認時，引入“不確定度報告”使結果具有可比性。上海市臨床檢驗中心是上海市衛生局授權開展全市醫療機構臨床實驗室質量監管、指導和服務的技術支撐單位，對實驗室不確定度的評定進行探討將對臨床實驗室開展相關工作具有一定借鑒作用。本實驗室將在后續的研究中采用國家標準物質檢測，力求尋找一種臨床實驗室既簡便又可信的評定PCR測定HBV DNA的不確定度的方法。

綜上所述，“經驗辦法”評定PCR測定HBV DNA的不確定度雖然簡便易行，但利用室間質評數據評定，由于其評價方式不同不能準確真實地反映實驗室不確定度。可以進一步探討采用檢測國家標準物質數據評定PCR測定HBV DNA的不確定度。

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