SYSMEX XN－1000全自動血液分析儀計數有核紅細胞的準確性評價

王也飛，周 怡，丁 磊，夏文權，胡翊群

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗系，上海200025)

有核紅細胞(nucleated red blood cell，NRBC)即幼稚紅細胞。健康成年人外周血中無NRBC，但在胎兒外周血、新生兒或幼兒血液中可少量出現。成年人外周血中出現NRBC時，多為病理狀態，常見于一些溶血性貧血、急性大量失血、嚴重的組織缺氧、急慢性白血病、惡性腫瘤、骨髓纖維化癥等多種疾病。血液中的NRBC多為晚幼紅細胞，也可見中幼紅細胞或更幼稚的紅細胞(如紅血病、紅白血病)[1]。目前，多種血液分析儀已能對NRBC出現的陽性標本進行提示和計數。國際實驗血液學專家委員會及國內專家提出，對于出現NRBC的血液標本，應進行顯微鏡鏡檢，以避免NRBC干擾白細胞計數結果[2-3]。我們采用SYSMEX XN-1000全自動模塊式血液體液分析儀(簡稱XN-1000)對外周血標本進行NRBC的檢測，并與傳統的顯微鏡形態學鏡檢方法(簡稱鏡檢法)及流式細胞術(flow cytometry，FCM)進行對比，對XN-1000在NRBC檢測方面的性能進行評價。

材料和方法

一、標本來源

選取上海瑞金醫院溶血性貧血確診患者以及瑞金醫院門診檢驗科Beckamn Coulter LH750全自動血液分析儀提示檢測出NRBC患者的血液標本共66例[真空采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝靜脈血2 mL]。

二、儀器與試劑

XN-1000及其配套試劑由日本Sysmex公司提供;BD FACS CANTO-II流式細胞儀及其配套熒光抗體標記試劑[CD45 FITC(BD 555482)，PI(Sigma Chemical Co.PN#P-4170)]由美國BD公司和Sigma公司提供，;EDTA-K2真空采血管(紫蓋);OLYMPUS光學顯微鏡;瑞氏染液等。

三、NRBC計數方法

1.XN-1000檢測 NRBC XN-1000有 WNR通道(即WBC/BASO和NRBC通道)，針對白細胞數檢測增加了NRBC的修正功能。在該通道中進行白細胞計數、白細胞分類、嗜堿性粒細胞計數和NRBC計數。所用試劑之一的Lysercell WNR，其中的表面活性劑使紅細胞溶血的同時，透過白細胞的細胞膜。白細胞的外形和內部構造因各自的細胞特性而異。利用散射光(FSC、SSC)可捕捉其形態的差異，憑此將嗜堿性粒細胞和其它的白細胞區別;另一試劑Fluorocell WNR，對白細胞及NRBC的核酸和細胞器進行熒光染色。在Lysercell WNR試劑中白細胞比NRBC的染色部位多，在Fluorocell WNR試劑中其熒光強度也比NRBC強。根據熒光量的差異，將NRBC和其他的白細胞區別和計數(見圖1，由Sysmex公司提供)，得到NRBC絕對數(×109/L)及NRBC百分率(NRBC%)，記錄上述數據。

圖1 Sysmex XN-1000檢測NRBC

2.FCM檢測有核紅細胞[4-6]對待測抗凝全血標本進行相關處理后予以CD45/PI染色。碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一種常用的對DNA染色的細胞核熒光染色劑。PI不能透過完整的細胞膜，但能透過凋亡中晚期的細胞和死細胞的膜而將細胞核染紅。PI在540 nm綠色光激發下，在600 nm紅色光處發出明亮的熒光;CD45-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體設門圈出白細胞，NRBC具有CD45－/PI+的特點與白細胞CD45+/PI+及細胞碎片CD45－/PI－相區別(圖2)。

圖2 FCM檢測NRBC結果分析

3.鏡檢法 取5μL外周血，做厚薄均勻的血涂片并進行瑞氏染色，然后在血膜體尾交界細胞分布均勻處用油鏡分類400個白細胞，同時計數所見的 NRBC 數[7]。

四、統計學方法

采用SPSS 13.0和MedCalc統計軟件對檢測結果進行配對樣本t檢驗、線性回歸分析及受試者工作特征(ROC)曲線分析。按照H26-A2建議，方法比較散點圖用Bland-Altman偏移散點圖，相關性統計采用 Passing-Bablok回歸法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、XN-1000與鏡檢法計數NRBC百分率的相關性

對XN-1000和鏡檢法每分類100個白細胞所計數的NRBC百分率(NRBC%)結果采用Passing-Bablok回歸法進行相關性分析。結果顯示二者之間呈良好的線性相關。XN-1000測定值(Y)對鏡檢法測定值(X)的直線回歸方程為Y=－0.057 95+1.016 6X，r=0.927，P ＜ 0.05，見圖 3，兩者的Bland-Altman偏移散點圖見圖4。XN-1000與鏡檢法結果進行配對樣本t檢驗，差異無統計學意義(P=0.205)。

二、FCM與鏡檢法計數NRBC%的相關性

對FCM和鏡檢法所計數的NRBC%采用Passing-Bablok回歸法進行相關性分析。FCM測定值(Y)對鏡檢法測定值(X)的直線回歸方程為Y=0.050 0+1.321 8X，r=0.956，P ＜0.05。FCM與鏡檢結果進行配對樣本t檢驗，差異無統計學意義(P=0.563)。

圖3 XN-1000與鏡檢法計數NRBC%的相關性

圖4 XN-1000與鏡檢法計數NRBC%的Bland-Altman偏移散點圖

三、XN-1000與FCM計數NRBC%的相關性

對XN-1000與FCM所計數的NRBC%采用Passing-Bablok回歸法進行相關性分析。XN-1000測定值(Y)對FCM測定值(X)的直線回歸方程為Y= －0.116 9+0.779 3X，r=0.994，P ＜0.05。

2種方法與鏡檢法結果比較的ROC曲線見圖5。XN-1000診斷敏感度為60.0%，診斷特異性為 95.7%，曲線下面積(AUC)為0.732，檢測的參考值臨界點為0.4;FCM診斷敏感度為70.0%，診斷特異性為89.7%，AUC 為0.838，檢測的參考值臨界點為0.8;以鏡檢法為金標準計數 NRBC%，FCM和XN-1000 2種方法檢測結果差異無統計學意義(P=0.316)。

圖5 XN-1000、FCM與鏡檢法結果比較的ROC曲線

討 論

本研究比較了XN-1000、FCM及鏡檢法NRBC的檢測結果。由于大部分標本選擇了異常細胞較為單一的溶血性貧血患者的EDTA-K2抗凝靜脈血，其中含其他異常細胞較少，因此在形態學方面干擾也較少，所得結果的可靠性應較為理想。少部分標本選自瑞金醫院門診檢驗科BECKMANCOULTER LH750全自動血液分析儀初篩為陽性的患者。

對上述標本總結發現，外周血中出現NRBC患者主要來自以下幾個典型科室:血液科47.4%，兒科10.3%、感染科 6.4%、腎臟科 5.1%、皮膚科3.8%。其原因可能是:正常情況下新生兒或幼兒血液中存在NRBC，而成人體內出現NRBC多與溶血性貧血、急慢性白血病、感染等有關[8]。通過進一步研究發現，白血病、貧血者外周血易出現NRBC。當臨床疑為血液病或已確診為血液病患者，復查血細胞計數時應選擇NRBC計數，以免漏診[9]。有些標本外周血中白細胞極度減低，這對血液分析儀、流式細胞儀及手工法的測定產生一定誤差。由本研究XN-1000和鏡檢法的計算方法可知，NRBC%得到需用WBC絕對計數值，上述原因也間接影響了NRBC%結果準確性。

通過對測定結果的統計分析顯示，XN-1000在測定NRBC方面與鏡檢法結果差異無統計學意義(P＞0.05)，二者線性擬合情況也較好。以鏡檢法為金標準，XN-1000檢測NRBC的診斷敏感度為 60.0%，診斷特異性為 95.7%，AUC為0.732。從上述情況來看，XN-1000檢測NRBC有較高的診斷特異性。然而也有文獻對手工操作的“金標準”有質疑。因其檢測細胞數量少，人為主觀性較大，部分標本客觀存在白細胞數目極度減低的客觀原因，有時作為對照的鏡檢法也無法完全得到十分準確的結果 。多數文獻中，手工法NRBC%測定通過計數100個白細胞，同時計數所見的NRBC數來計算得到。本研究為了使結果更加準確，基本上每張涂片在盡可能的情況下已計數到400個白細胞，但仍不能排除誤差的客觀存在。加之在血液分析儀、流式細胞儀操作時，儀器本身對細胞熒光標記、檢測方面的精度差異，導致了上述現象存在。

目前，運用流式細胞儀測定NRBC相關數據不作為臨床檢驗的常規方法。本研究引入了FCM，旨在從另一個方面對XN-1000的測定結果進行比對;同時，鑒于鏡檢法因計數細胞總數遠低于全自動血液分析儀，故要比較這2種在方法學上完全不同而造成精密度差異較大的方法，可能不夠恰當。因此，用FCM來替換鏡檢法進行細胞計數，從而能達到和全自動血液分析儀相似的精密度[10]。從統計結果來看，FCM與鏡檢法的測定結果差異亦無統計學意義(P＞0.05)，二者線性相關較好(r=0.956)，r值高于 XN-1000與鏡檢法的 r值(0.927)。FCM的診斷敏感性為70.0%，但特異性卻較 XN-1000差，為 89.7%，AUC為0.838，檢測參考值臨界點為 0.8。XN-1000與FCM的檢測結果具有極佳的相關性。從兩者的ROC曲線來看，其AUC均在0.7～0.9之間，表示測定具有一定的準確性。其中FCM檢測結果具有更大的AUC，為0.838。若不考慮操作可行性、檢測成本等因素，FCM是比血液分析儀更好的方法。XN-1000的靈敏度(真陽性率)為60.0%，低于 FCM，但特異性為 95.7%，高于FCM，其檢測參考值臨界點為0.4。這2種方法的臨界點均較靠近左上角，說明假陽性和假陰性的總數較少，準確性較高。

外周血中出現NRBC是多種疾病過程中可出現的一種病理狀態，進行NRBC檢測有較為廣泛臨床意義。XN-1000測定外周血NRBC的特異性和準確性較高，方法簡便，值得在臨床推廣。

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