血清異常凝血酶原檢測(cè)在原發(fā)性肝癌臨床診斷中的應(yīng)用

濮玨彪，王學(xué)鋒，彭奕冰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200025)

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma)是全世界最常見(jiàn)的腹部癌癥之一，是第五大癌癥，占癌癥死亡人數(shù)的第3位[1]。肝癌的診斷主要依賴(lài)于影像學(xué)檢查和肝組織病理活檢等方法，較難普查，為肝癌的早期診斷和篩查帶來(lái)了困難。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)被認(rèn)為是肝癌診斷和預(yù)后判斷的首選血清標(biāo)志物，但長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐表明，AFP的特異性和敏感性都不盡如人意。因此，探尋新的血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)于早期診斷和預(yù)防肝細(xì)胞癌具有重要的意義。血清異常凝血酶原又稱(chēng)維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)，也被稱(chēng)為脫-γ-羧基凝血酶原(Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)，其 γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)中1個(gè)或多個(gè)谷氨酸殘基不完全羧化為γ-羧基谷氨酸，導(dǎo)致其失去正常凝血功能。PIVKA-Ⅱ在原發(fā)性肝癌患者的血清中陽(yáng)性率高，被認(rèn)為是1種特異性強(qiáng)的原發(fā)性肝癌標(biāo)志物[2]。本研究檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者和非原發(fā)性肝癌者血清AFP和PIVKA-Ⅱ水平，探討其在原發(fā)性肝癌臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為尋找更好的原發(fā)性肝癌實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)提供有價(jià)值的依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集來(lái)自瑞金醫(yī)院2012年3至6月住院患者及健康體檢者血清365例，其中原發(fā)性肝癌患者血清100例，非原發(fā)性肝癌患者血清265例。原發(fā)性肝癌患者血清標(biāo)本要求是來(lái)源于由病理學(xué)診斷或臨床診斷[3]為原發(fā)性肝癌但未行手術(shù)切除的住院患者。非原發(fā)性肝癌患者血清標(biāo)本要求是來(lái)源于病理學(xué)診斷或臨床診斷為無(wú)原發(fā)性肝癌的患者或健康人群，且未行手術(shù)切除時(shí)的血清標(biāo)本，其中包括慢性肝病59例、消化系統(tǒng)腫瘤50例、繼發(fā)性肝癌50例、其它肝臟病變56例和正常對(duì)照50名。

因維生素K和華法林等會(huì)影響血清中PIVKA-Ⅱ的含量，所以正在使用這2種藥物的研究對(duì)象的標(biāo)本予以剔除。

二、方法

1.標(biāo)本要求 排除明顯溶血、脂血、黃疸或微生物污染等的標(biāo)本，標(biāo)本采集后室溫保存不超過(guò)8 h或2～8℃保存不超過(guò)7 d，標(biāo)本－20℃凍存不超過(guò)1個(gè)月或－80℃凍存不超過(guò)6個(gè)月。

2.試驗(yàn)方法 血清AFP采用羅氏Cobas e601全自動(dòng)免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，參考范圍為＜20 ng/mL;PIVKA-Ⅱ采用酶化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，儀器為L(zhǎng)UMIPULSE G1200全自動(dòng)免疫分析儀(已獲中國(guó)上市許可證)，參考范圍為 ＜40 mAU/mL。所用試劑均為原裝試劑盒，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。測(cè)定過(guò)程中所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制文件進(jìn)行。在試驗(yàn)標(biāo)本檢測(cè)前、檢測(cè)中、檢測(cè)后分別進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。分析不同疾病組間PIVKA-Ⅱ和AFP水平，發(fā)現(xiàn)其數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布，因此采用中位數(shù)和四分位數(shù)描述不同組間腫瘤標(biāo)志物表達(dá)的差異。采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較不同組間AFP和PIVKA-Ⅱ水平，計(jì)算各血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的敏感性、特異性、正確指數(shù)、符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值，同時(shí)繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線確定AFP和PIVKA-Ⅱ合適的參考范圍，并且對(duì)所有標(biāo)本和原發(fā)性肝癌標(biāo)本AFP和PIVKA-Ⅱ檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行直線相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同疾病組間AFP和PIVKA-Ⅱ結(jié)果分析

原發(fā)性肝癌組患者AFP和PIVKA-Ⅱ水平均明顯高于其它疾病組和正常對(duì)照組 (P＜0.01)。與正常對(duì)照組相比，繼發(fā)性肝癌、慢性肝病和其它肝臟病變組的AFP水平偏高 (P＜0.01)，但明顯低于原發(fā)性肝癌組。而在PIVKA-Ⅱ的檢測(cè)結(jié)果中，與正常對(duì)照組相比，只有原發(fā)性肝癌組PIVKA-Ⅱ水平明顯升高 (P＜0.01)，繼發(fā)性肝癌、慢性肝病、其它肝臟病變和消化系統(tǒng)腫瘤組其數(shù)值均沒(méi)有明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 不同疾病組血清AFP和PIVKA-Ⅱ檢測(cè)結(jié)果比較 [中位數(shù)(四分位數(shù))]

二、AFP和PIVKA-Ⅱ單獨(dú)診斷原發(fā)性肝癌的診斷學(xué)評(píng)價(jià)

AFP、PIVKA-Ⅱ判斷原發(fā)性肝癌的臨界值分別為20 ng/mL和40 mAU/mL。由表2可知，與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相比，AFP共有77例不符，其中37例為假陰性，40例為假陽(yáng)性;PIVKA-Ⅱ有53例不符，其中26例假陰性，27例假陽(yáng)性。為進(jìn)一步分析這2個(gè)指標(biāo)的診斷學(xué)價(jià)值，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別計(jì)算了其特異性、敏感性、正確指數(shù)、符合率、Kappa值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，見(jiàn)表3。PIVKA-Ⅱ的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于AFP，其敏感性和特異性都達(dá)到了74.00%和89.81%，Kappa值為0.636，說(shuō)明其與金標(biāo)準(zhǔn)相比一致性較好。

三、ROC曲線分析及最佳臨界點(diǎn)確定

以敏感性為縱坐標(biāo)、1－特異性為橫坐標(biāo)分別繪制AFP和PIVKA-Ⅱ的ROC曲線，見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，AFP和PIVKA-Ⅱ曲線下面積分別為0.789和0.873(P 均 ＜0.05)，說(shuō)明這 2 項(xiàng)指標(biāo)在原發(fā)性肝癌的診斷中均有較高的意義。此外，PIVKA-Ⅱ曲線下面積明顯大于 AFP，提示在本研究中，前者的診斷價(jià)值高于后者。

表2 AFP、PIVKA-Ⅱ單獨(dú)和聯(lián)合診斷結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)比較

表3 AFP、PIVKA-Ⅱ單獨(dú)和聯(lián)合診斷的評(píng)價(jià)指標(biāo)

圖1 AFP和PIVKA-Ⅱ診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

為了滿(mǎn)足敏感性和特異性相對(duì)最優(yōu)，將最接近ROC曲線左上角的點(diǎn)定位最佳臨界點(diǎn)，即正確指數(shù)(敏感性+特異性－1)最大的點(diǎn)為臨界點(diǎn)。通過(guò)計(jì)算，AFP的最佳臨界點(diǎn)為25.97 ng/mL，此時(shí)敏感性為63.00%，特異性為84.91%;PIVKA-Ⅱ的最佳臨界點(diǎn)為42.5 mAU/mL，此時(shí)敏感性為74.00%，特異性為 89.81%，均高于 AFP。

四、AFP和PIVKA-Ⅱ聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的診斷學(xué)評(píng)價(jià)

聯(lián)合診斷1指AFP和PIVKA-Ⅱ檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性定義為陽(yáng)性，聯(lián)合診斷2指AFP和PIVKA-Ⅱ檢測(cè)結(jié)果只要有1項(xiàng)為陽(yáng)性即為陽(yáng)性。聯(lián)合診斷1作為判斷原發(fā)性肝癌的標(biāo)準(zhǔn)，其診斷特異性可高達(dá)98.49%，以聯(lián)合診斷2作為判斷原發(fā)性肝癌的標(biāo)準(zhǔn)，其診斷敏感性可高達(dá)81.00%。由此可知，相比單獨(dú)診斷，聯(lián)合診斷大大地提高了診斷效能。見(jiàn)表3。

五、PIVKA-Ⅱ和AFP的相關(guān)性分析

對(duì)全部標(biāo)本和原發(fā)性肝癌標(biāo)本分別做了AFP、PIVKA-Ⅱ的相關(guān)性分析，在全部標(biāo)本中，2項(xiàng)指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.157(P=0.003)，說(shuō)明兩者相關(guān)程度很低;在原發(fā)性肝癌標(biāo)本中，2項(xiàng)指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.097(P=0.339)，說(shuō)明兩者無(wú)相關(guān)性。

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，原發(fā)性肝癌的診斷主要依賴(lài)于影像學(xué)檢查、肝穿刺和血清AFP檢測(cè)等。AFP作為首個(gè)臨床上廣泛應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的血清腫瘤標(biāo)志物，為臨床診斷做出了巨大貢獻(xiàn)。近年來(lái)，AFP敏感性和特異性的局限性引起了臨床和檢驗(yàn)人員的注意，特別是AFP陰性的原發(fā)性癌患者有逐年上升的趨勢(shì)[3]。本研究中AFP的敏感性和特異性分別為63.00%和84.91%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為61.17%，單項(xiàng)AFP用于診斷原發(fā)性肝癌的結(jié)果并不理想。

隨著蛋白組學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，對(duì)肝癌腫瘤標(biāo)志物的研究取得了很大的進(jìn)展。但是，大多數(shù)肝癌的標(biāo)志物還只處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，如高爾基蛋白73[4]、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3[5]、某些生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子等。這些腫瘤標(biāo)志物在實(shí)驗(yàn)室的研究過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系[6]。然而由于他們本身檢測(cè)方法的局限或敏感性和特異性的局限性，限制了他們的臨床應(yīng)用價(jià)值。如高爾基蛋白73在前期的研究成果中發(fā)現(xiàn)其對(duì)于診斷原發(fā)性肝癌的敏感性和特異性均大于AFP，但目前只有免疫印跡法的檢測(cè)試劑問(wèn)世，該法耗時(shí)耗力并且重復(fù)性和精確度較差[6]。

PIVKA-Ⅱ是一個(gè)已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段的腫瘤標(biāo)志物，目前已有商品化的自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(LUMIPULSE?PIVKA-Ⅱ)上市。分析研究PIVKA-Ⅱ檢測(cè)在原發(fā)性肝癌診斷中的臨床價(jià)值，更有利于提高原發(fā)性肝癌的診斷水平。本研究選取100例原發(fā)性肝癌患者和265例非原發(fā)性肝癌患者血清檢測(cè)其PIVKA-Ⅱ水平，結(jié)果表明PIVKA-Ⅱ在診斷原發(fā)性肝癌的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均優(yōu)于AFP。PIVKA-ⅡROC曲線下面積高于AFP，表明其診斷價(jià)值高于血清AFP。當(dāng)PIVKA-Ⅱ診斷臨界點(diǎn)設(shè)為42.5 mAU/mL時(shí)，其診斷特異性可以提高到89.81%。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致。因此，血清PIVKA-Ⅱ是一個(gè)值得推廣和應(yīng)用的肝癌腫瘤標(biāo)志物。

在實(shí)際臨床檢測(cè)中，由于單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)敏感性和特異性有一定的局限性，聯(lián)合診斷成為1個(gè)提高診斷效能的重要方法。有研究表明，腫瘤標(biāo)志物AFP和癌胚抗原(carcinoem-bryonic antigen，CEA)聯(lián)合檢測(cè)使原發(fā)性肝癌的檢測(cè)率提高到84.2%，遠(yuǎn)高于單項(xiàng)指標(biāo)在原發(fā)性肝癌中的檢出率[8]。在本研究中，采用的2種PIVKA-Ⅱ和AFP聯(lián)合診斷方案，使診斷原發(fā)性肝癌的特異性和敏感性分別提高到98.49% 和81.00%，遠(yuǎn)高于之前的研究結(jié)果[8]。因此，PIVKA-Ⅱ在聯(lián)合檢測(cè)原發(fā)性肝癌中也具有重要的價(jià)值。

綜上所述，血清PIVKA-Ⅱ?qū)υl(fā)性肝癌具有很好的輔助診斷價(jià)值，與血清AFP聯(lián)合檢測(cè)同時(shí)提高了診斷敏感性和特異性。血清PIVKA-Ⅱ可稱(chēng)為臨床診斷肝細(xì)胞癌的重要指標(biāo)。

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