慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子變化及與肝功能指標(biāo)的關(guān)系

郭永紅，周 云，張 穎，何 瑜，紀(jì)光晰，馬志遠(yuǎn)，成 程，范 超，張凌云，賈戰(zhàn)生

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病診療中心，陜西西安710038;2.河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院感染科，河南新鄉(xiāng)453000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)所致的急性肝衰竭，即慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure ACHBLF)，屬于慢性乙型重型肝炎的范疇。ACHBLF在慢性重型肝炎中占多數(shù)，起病較急，預(yù)后兇險，病死率高達(dá)70%[1]。ACHBLF的發(fā)病機制極為復(fù)雜，其中病毒感染啟動的機體各種免疫和炎癥應(yīng)答占據(jù)了重要地位，但具體機制尚未完全闡明[2-3]。

輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)通過輔助或誘導(dǎo)其它免疫細(xì)胞活化，在機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Th細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同可分為Th1和Th2細(xì)胞亞群，正常機體Th1/Th2類細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)，病理情況下出現(xiàn)失衡。有研究表明，Th1/Th2失衡在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持續(xù)感染及介導(dǎo)肝細(xì)胞免疫損傷中起重要作用[4]。目前對于ACHBLF患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞因子的研究較少，且多數(shù)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測。該法雖操作簡單、經(jīng)濟，但1次只能檢測1種細(xì)胞因子，樣本需求量大，無法反映細(xì)胞因子之間的關(guān)系。流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)(cytometric bead array，CBA)可以同時檢測多重細(xì)胞因子，精確性高、可重復(fù)性好、高通量，具有較好的精確度和敏感性[5]。本研究利用CBA檢測ACHBLF患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平，探討ACHBLF Th1/Th2細(xì)胞因子的變化及其與若干肝功能衰竭指標(biāo)的關(guān)系。

材料和方法

一、研究對象

收集2012年8至12月在唐都醫(yī)院感染科就診的ACHBLF患者33例，其中男28例，女5例，年齡(44.3±4.3)歲，診斷符合2012年版《肝衰竭診療指南》[1]。CHB患者20例，其中男16例，女4例，年齡(40.1±3.7)歲，所有患者入院次日清晨取空腹靜脈血檢測肝功能、血液學(xué)、HBV血清學(xué)標(biāo)志物、HBV DNA等相關(guān)指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)為合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等感染，酒精性肝病，藥物性肝病，自身免疫性疾病和惡性腫瘤。另取15名健康志愿者血清作為健康對照，其中男7名，女8名，年齡(35.1±9.3)歲。本研究經(jīng)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲所有研究對象知情同意。

二、臨床指標(biāo)檢測

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、白蛋白(albumin，Alb)、凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)等指標(biāo)均在唐都醫(yī)院臨床檢驗中心進(jìn)行檢測，免疫生化指標(biāo)采用全自動生化儀檢測。HBV血清學(xué)標(biāo)志物、HBV DNA檢測均在本科實驗室進(jìn)行。

三、儀器與試劑

FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)及其CellQuest分析軟件和BD CBA數(shù)據(jù)分析軟件。CBA磁珠檢測盒購自美國BD公司。

四、CBA

按說明書進(jìn)行操作:試劑盒提供的Th1/Th2細(xì)胞因子凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解于2.0 mL稀釋液，室溫平衡15 min后進(jìn)行稀釋。采用倍比稀釋，取300μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入300μL稀釋液，并吹打混勻，即為1∶2 倍稀釋。依次進(jìn)行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 及 1∶512 倍稀釋。6種細(xì)胞因子捕獲磁珠等體積混合、震蕩，取50μL混合的Th1/Th2細(xì)胞因子捕獲磁珠于分析管中。依次加入 50μL藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的檢測試劑、50μL標(biāo)準(zhǔn)品或50μL待檢血清樣本，震蕩混勻后室溫避光3 h。加1 mL洗液，200×g離心5 min。加300μL洗液懸浮磁珠，上流式細(xì)胞儀前各樣本振蕩3～5 s。采用CellQuest軟件分析并采集分析圖譜，再用BD FACSComp軟件分析換算成濃度。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料采用±s表示，組間比較采用ANOVA方差分析，細(xì)胞因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析用Pearson方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者及健康對照者臨床基本資料

收集患者及健康對照者的臨床基本資料，包括年齡、性別、臨床癥狀及生化檢查等情況，見表1。

表1 患者及健康對照者臨床基本資料 (±s)

表1 患者及健康對照者臨床基本資料 (±s)

組別 例數(shù) 年齡(歲) 性別(男/女) TBil(μmol/L) ALT(U/L) HBV DNA(拷貝/mL)ACHBLF 組 33 44.3 ±4.3 28/5 376.3 ±86.2 259.6 ±23.6 4.7 ±1.7 CHB 組 20 40.1 ±3.7 16/4 36.5 ±8.2 45.9 ±4.1 6.6 ±1.9健康對照組 15 35.1 ±9.3 7/8 14.1 ±3.3 15.2 ±2.6—

二、CHB、ACHBLF患者和健康對照者血清Th1/Th2細(xì)胞因子水平的變化

標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為2 500～0 pg/mL共9個濃度點，整個過程均在計算機中處理，曲線擬合適配度(R Square)均在95%以上，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

ACHBLF患者血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、γ 干擾素(interferon gamma，IFN-γ)、白細(xì)胞介素 4(interleukin 4，IL-4)及白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)的水平較CHB患者及健康對照者顯著升高(P＜0.05)，見圖2、圖3和表2;然而，白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、白細(xì)胞介素 10(interleukin 10，IL-10)水平與CHB組和健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。CHB組血清中細(xì)胞因子水平與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 Th1/Th2細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線

圖2 CBA檢測不同患者及健康對照者細(xì)胞因子流式圖

圖3 CBA檢測ACHBLF、CHB患者和健康對照者血清IL-4、IL-6、IFN-γ及TNF-α的統(tǒng)計圖

表2 CHB、ACHBLF患者及健康對照者外周血中Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 (±s，pg/mL)

表2 CHB、ACHBLF患者及健康對照者外周血中Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 (±s，pg/mL)

注:與健康對照組比較，*P ＜0.05;與 CHB 組比較，#P ＜0.05

組別 IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α IFN-γ ACHBLF 組 9.62 ±3.82 15.84 ±2.72*# 53.80 ±7.84*# 21.07 ±5.79 8.53 ±1.47*# 20.80 ±2.48*#CHB 組 8.92 ±2.42 8.88 ±1.52 15.60 ±3.72 22.50 ±4.18 1.02 ±0.12 7.80 ±0.96健康對照組 5.60 ±1.86 8.18 ±1.34 17.30 ±3.69 13.60 ±2.90 2.00 ±1.24 10.50 ±0.74

三、ACHBLF 患者血清中 TNF-α、IFN-γ 及 IL-4、IL-6與TBil、Alb及PTA相關(guān)性分析

ACHBLF 患者血清中 IL-4、IL-6、TNF-α 及IFN-γ水平與反映肝功能的指標(biāo)均無明顯相關(guān)性(P ＞0.05)。見表3。

表 3 ACHBLF 患者血清中 IL-4、IL-6、TNF-α 及 IFN-γ與TBil、Alb及PTA相關(guān)系數(shù)r值

討 論

細(xì)胞因子是由機體的免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞合成和分泌的多肽類小分子，它們在調(diào)節(jié)機體抵抗外源性及內(nèi)源性抗原時起重要作用。檢測細(xì)胞因子的技術(shù)大致可分為3類:(1)生物活性檢測法;(2)免疫學(xué)細(xì)胞因子直接定量法;(3)分子雜交檢測法。因分子雜交檢測法及生物活性檢測法所要求的實驗室條件較高，目前多數(shù)采用ELISA。該法雖操作簡單、經(jīng)濟，但1次只能檢測1種細(xì)胞因子，樣本需求量大。CBA是基于流式細(xì)胞儀檢測平臺的液相多重蛋白定量技術(shù)，基本原理為:首先將不同捕獲抗體包被在不同熒光強度的微球上形成捕獲微球，然后和待測樣本溶液混合，微球上的特異性抗體就與樣本(血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液)中相應(yīng)的抗原或蛋白結(jié)合，再加入熒光標(biāo)記的檢測抗體，形成“三明治”夾心復(fù)合物，最后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。CBA使用具有不同熒光強度的微球群，分別包被針對不同抗體的特異性捕獲抗體，因此可以同時檢測多種蛋白，較傳統(tǒng)的ELISA有較大優(yōu)勢，所需樣本體積僅為傳統(tǒng)ELISA分析所需樣本量的1/6，穩(wěn)定性好，能避免由于酶聯(lián)放大技術(shù)使信號失真導(dǎo)致的假陽性。

HBV感染進(jìn)入機體后，機體通過免疫應(yīng)答抵御病毒的入侵。T淋巴細(xì)胞是病毒感染誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答中最重要的效應(yīng)器，T淋巴細(xì)胞在受到病毒抗原刺激后，分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)和Th。CTL一方面通過直接溶解受感染的細(xì)胞來清除病毒，但更主要的是通過分泌 IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子介導(dǎo)非溶解細(xì)胞的途徑來清除病毒[6-7]。Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子，Th1細(xì)胞反應(yīng)占優(yōu)勢時，有利于病毒的完全清除。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子，這些因子可以抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并介導(dǎo)體液免疫。Th2免疫占優(yōu)勢時，可以導(dǎo)致病毒感染的慢性化。重癥肝炎患者受病毒攻擊及機體免疫應(yīng)答異常，表現(xiàn)為單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活性增高，體液免疫功能亢進(jìn)等。同時，可誘導(dǎo)CTL的增殖分化，促進(jìn)肝組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤，特別是中性粒細(xì)胞，造成了大量肝細(xì)胞壞死[8]。

IFN-γ在重癥肝炎致病機制中起非常重要的作用[9]。重癥肝炎患者血清IFN-γ表達(dá)水平較高是Th1優(yōu)勢應(yīng)答的結(jié)果;TNF-α是枯否細(xì)胞分泌的最重要的細(xì)胞因子，是引發(fā)肝壞死最直接的原因。在重癥肝炎時，TNF-α不僅促使中性粒細(xì)胞的黏附，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，還可通過細(xì)胞免疫包括激活CTL免疫殺傷作用或激活體內(nèi)單核細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性TNF-α，共同參與急性肝壞死的發(fā)生[10]。本研究證實在健康對照組及CHB組患者血清中IFN-γ及TNF-α的表達(dá)水平非常低，而在ACHBLF組患者TNF-α和IFN-γ水平顯著升高，分析其原因可能為重癥肝炎時T細(xì)胞為了清除病毒的感染，分泌較多的IFN-γ及TNF-α，造成大量肝細(xì)胞破壞，同時HBV DNA水平亦下降。另外1種可能是TNF-α是促炎因子，ACHBLF患者易合并感染，可誘發(fā)TNF-α進(jìn)一步升高。TNF-α、IL-4是相互調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，二者共同作用介導(dǎo)炎癥的發(fā)展，TNF-α和IL-4的升高可反映出局部和全身感染的存在。本研究證實重癥肝炎時IL-6及IL-4升高，與TNF-α趨勢相同，其原因可能是發(fā)生了促炎癥因子的級聯(lián)瀑布效應(yīng)，促炎癥因子升高誘發(fā)免疫抑制性細(xì)胞因子同時升高，也可能與重癥肝炎患者多合并局部或全身感染有關(guān)，還需進(jìn)一步與感染相關(guān)指標(biāo)結(jié)合動態(tài)觀察。

本研究通過CBA檢測Th1/Th2細(xì)胞因子，分析其與肝功能衰竭的指標(biāo)包括TBil、Alb及凝血因子全套等指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示其統(tǒng)計學(xué)并無很強的相關(guān)性(P＞0.05)，有待于進(jìn)一步增加病例數(shù)加以驗證。而Th1/Th2變化結(jié)果并不完全符合此消彼長的規(guī)律，分析原因可能是機體啟動了不可逆的免疫反應(yīng)，免疫抑制性細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子同時處于高水平，上述假設(shè)是否成立仍需在以后的研究中擴大病例數(shù)進(jìn)行觀察。同時CBA的敏感性和特異性還需進(jìn)一步分析驗證。

外周血中的細(xì)胞因子是多源性的，其表達(dá)水平并不能直接說明肝臟微環(huán)境中Th1/Th2細(xì)胞因子的變化狀況，本研究因取材限制僅分析外周血中細(xì)胞因子的變化，未能同時分析肝臟組織Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)狀況，因此有待于進(jìn)一步檢測肝臟組織Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)以更加真實地反映重癥肝炎患者細(xì)胞因子變化。

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