高堿性提取的大豆油體的成分變化研究

曹艷蕓 陳業明 華欲飛

高堿性提取的大豆油體的成分變化研究

曹艷蕓 陳業明 華欲飛

（食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品學院，無錫 214122）

以大豆油體（OB）為研究對象，詳細地考察了高堿性提取條件對大豆油體成分的影響，主要包括油體主要成分（中性脂、蛋白質和磷脂）的含量、油體表面的蛋白質種類和氨基酸組成、中性脂脂肪酸組成和生育酚組成。結果表明，高堿性提取會使大豆油體表面的蛋白質和磷脂部分脫離油體，蛋白質／中性脂比值由0.097（pH 6.8 OB）減小為0.058（pH 11 OB），磷脂／中性脂比值由 0.068（pH 6.8 OB）減小為 0.029（pH 11 OB）；對中性脂部分（生育酚、脂肪酸）基本無影響；高堿性提取影響油體粒徑和zeta電位，粒徑由（509±3）nm（pH 6.8 OB）減小為（451±7）nm（pH 11 OB），等電點由介于4.5～5（pH 6.8 OB）提高為5.5～6（pH 11 OB）；同時說明，油體特殊的天然乳化結構對于保護植物種子中的中性脂意義重大。

大豆油體 高堿性提取 蛋白質 磷脂 中性脂 氨基酸分析 脂肪酸 生育酚

油體（oil body，簡寫OB）是含油植物種子貯藏三酰甘油的亞細胞微粒，粒徑一般為0.5～2.5μm［1］。其主要成分有3種，為：中性脂（主要為三酰甘油，簡寫TAG）、油體蛋白和磷脂（PL）。油體內部為疏水的液態TAG核心，外層是由磷脂單分子層及鑲嵌蛋白質形成的半單位膜，油體表面具有親水性［2］。蛋白和磷脂通過提供空間位阻和靜電排斥作用賦予油體高度的穩定性，同時能夠防止某些非特異性脂肪酶與油體結合［3］。作為一種天然的納米級大小的微膠囊［4］，大豆油體集中了大豆的多不飽和脂肪酸，同時含有磷脂和生育酚［5］。一方面，油體擁有穩定的天然乳化結構，并且含有許多營養成分；另一方面，國內大豆油體原料來源非常豐富。因此，大豆油體具有運用于食品和化妝品行業的巨大潛力［6］。

目前，油體的提取一般都采用堿性條件提取［7-8］。從植物種子提取油體的過程中，種子中的一些蛋白質會與油體發生結合，而堿性條件能破壞雜蛋白質與油體的相互作用。通常，大豆油體表面會結合有大豆 7S、11S球蛋白［7］以及 Gly m Bd 30K、P34等［9］過敏性蛋白，尤其是油體表面結合的過敏性蛋白會極大地限制油體在食品和化妝品行業的應用。Chen等［7］通過研究證明，pH 11堿性提取可以得到不含過敏性蛋白等雜蛋白的純凈油體。但是，高堿性提取條件是否會對油體的成分產生影響，目前未見詳細報道。本試驗以大豆油體為研究對象，中性提取的油體為參照，考察了強pH值提取條件對大豆油體的3種主要成分（中性脂、蛋白質和磷脂）的含量、蛋白質種類、蛋白質的氨基酸組成、中性脂的脂肪酸組成以及生育酚等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：高油豆88-31（2012產）：南京農業大學研究所，貯存于4℃冰箱中備用。

儀器：Hitachi CR21G高速冷凍離心機：日本日立有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；Shimadzu GC-2010 Plus氣相色譜儀：日本島津有限公司；納米粒度儀、zeta電位儀：英文馬爾文儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆油體的提取

大豆在4℃浸泡18 h后，與水按質量比為1∶9混合，打漿，勻漿經4層紗布過濾，得到生豆漿，分為2份。加入適量蔗糖（最終質量濃度為20%），攪拌均勻。其中1份生豆漿不調節pH值（測得此時生豆漿pH值為6.8），另1份調pH值11后，離心（4℃，19 000 r／min，40 min）。離心后分為 3層，上浮即為油體。收集油體，將其重新分散于水中。加入20%蔗糖，溶解。再次調節至相應的pH值后離心。如此重復洗滌油體2次。最后得到的2種油體（pH 6.8 OB，pH 11 OB）分別分散于50 mL去離子水中，透析，冷凍干燥。

1.2.2 高堿性提取對大豆油體質組成的影響

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對蛋白質組成進行分析。其中，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12.5%，用考馬斯亮藍G-250染色［10］。

1.2.3 高堿性提取對大豆油體主要成分含量的影響

1.2.3.1 中性脂含量計算

經冷凍干燥的2種油體，按1∶10加入冰丙酮提取中性脂肪，充分震蕩，離心（4 000 r／min，20 min），移取上層有機相于已經恒重的平底燒瓶中。沉淀用冰丙酮重復提取5次。丙酮相于45℃真空濃縮后，于60℃真空干燥恒重。稱重，計算中性脂肪含量。

1.2.3.2 蛋白質及磷脂含量計算

分別精確稱量經冷凍干燥的油體樣品（pH 6.8 OB，pH 11 OB）于已恒重的平底燒瓶（m1）中，加入1～1.5 mL離子水，按1∶50的固液比例加入氯仿-甲醇溶液（2∶1），60℃水浴回流提取全脂質，每次提取8 h，共更換3次提取液。將提取液合并后用已恒重的G3砂芯漏斗（質量m2）過濾。濾液經真空旋轉蒸發除去有機溶劑，60℃真空干燥2 h。計算全脂質含量；用于提取脂質的圓底燒瓶以及砂芯漏斗置于105℃烘干恒重，質量分別記為：圓底燒瓶（m01），砂芯漏斗（m02）。4種油體中蛋白質含量以及磷脂按以下公式計算：

式中：mOB指相應油體的質量

磷脂含量＝全脂質含量-中性脂含量

1.2.4 高堿性提取對大豆油體的粒徑及zeta電位的影響

新鮮制備的大豆油體（pH 6.8 OB，pH 11 OB）分散于去離子水中，緩慢攪拌3～4 h，使油體充分分散，形成均勻的乳狀液。測定其粒徑分布。

經透析的大豆油體（pH 6.8 OB，pH 11 OB）充分分散于水中，使其質量濃度約為0.05 mg／mL。將每種油體的分散液分成4份，分別調節pH值為4.5、5.0、5.5和6.0。測定zeta電位值。

1.2.5 高堿性提取對大豆油體氨基酸組成分析

經冷凍干燥的油體樣品（pH 6.8 OB，pH 11 OB）先后經冰丙酮脫除中性脂肪，氯仿-甲醇溶液（2∶1）脫除磷脂，揮干有機溶劑，得到油體蛋白質。

精確稱取約100 mg油體蛋白樣品于水解管中，用 6 mol／L HCl水解（110℃，22 h）。將水解產物定容后過濾，濾液置于干燥器中蒸酸過夜（干燥器其中盛放NaOH固體）。再用0.02 mol／L HCl復溶，離心后用鄰苯二甲醛（OPA）柱前自動衍生化，用液相色譜儀進行氨基酸組成分析。

色氨酸測定采用6 mol／L NaOH水解（110℃，20 h）。水解液經轉移、中和、定容、離心后，用OPA柱前自動衍生化后進行氨基酸組成分析。計算各油體樣品的每種氨基酸含量占氨基酸總量的百分比。

1.2.6 高堿性提取對大豆油體中中性脂脂肪酸組成的影響

稱取60～80 mg新鮮制備的中性脂（丙酮提取物，方法同1.2.3.1）對其進行甲酯化處理，用正己烷回收甲酯化產物，然后采用氣相色譜儀測定，用面積歸一化法對脂肪酸進行定量。

1.2.7 高堿性提取對大豆油體中生育酚組成的影響

新制備的2種油體（未分散于水中，且未經透析處理），以1∶10的固液比加入冰丙酮（含0.1 mg／mL BHT）抽提中性脂部分，充分攪拌2 h，抽濾，收集濾液。重復提取3次后將得到的濾液合并。35℃真空濃縮除去丙酮。對真空濃縮之后的中性脂離心處理（10 000 r／min，15 min）。取上層透明油相約 1.5 g，按 GB／T 26635—2011／ISO 9936∶2006方法進行低溫皂化處理，生育酚提取物用無水乙醇定容至10 mL。按GB／T 5009.82—2003進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 高堿性提取對大豆油體表面蛋白質成分的影響

pH 11強堿性提取得到的大豆油體表面蛋白質基本僅含有油體蛋白24 ku油體蛋白和18 ku油體蛋白（圖1）。pH 6.8 OB含有大豆7S球蛋白（圖1中 α’，α，β）和11S球蛋白（圖1中條帶 A3，A，B）以及Gly m Bd 30K等雜蛋白；pH 11 OB表面基本上只剩下油體蛋白，其他雜蛋白被去除。堿性條件可以破壞油體表面攜帶的雜蛋白與油體的相互作用，有利于這些雜蛋白質脫離油體。7S和11S等雜蛋白的等電點大多呈酸性，高堿pH遠離雜蛋白的等電點，雜蛋白帶有很強的負電荷，因此比較容易從油體表面脫落。

圖1 pH條件對大豆油體表面蛋白質成分的影響

2.2 高堿性提取條件對大豆油體主要成分含量的影響

由表1可知，pH 11 OB與pH 6.8 OB相比，中性脂含量增加，蛋白質以及磷脂含量均明顯減少，這與2.1結果相一致。其中，蛋白質質量分數由8.33%（pH 6.8 OB）減小為5.33%（pH 11 OB），磷脂質量分數由5.80%（pH 6.8 OB）減小為2.65%（pH 11 OB）；中性脂質量分數由85.67%（pH 6.8 OB）增加為91.93%（pH 11 OB）。進一步分析可得，磷脂含量從0.068 g／g中性脂減小為0.029 g／g中性脂，蛋白含量從0.097 g／g中性脂減小為0.058 g／g中性脂。產生這種結果的原因可能有2種：1）pH 11強堿性條件使得油體雜蛋白（7S，11S，Gly m Bd 30K）以及油體蛋白逐漸脫離油體，進而使得磷脂與油體蛋白相互作用形成的結構也受到一定程度的影響，從而導致部分磷脂脫離油體；2）pH 11強堿性條件使得磷脂分子結構遭到破壞（比如磷脂極性頭的水解）而致使磷脂含量降低。

表1 高堿性提取對大豆油體主要成分含量的影響

2.3 高堿性提取對大豆油體的粒徑及zeta電位的影響

由圖2a可見，因此，pH 11 OB粒徑（451±7）nm明顯小于pH 6.8 OB（509±3）nm。該結果也可以由2.1及2.2的結果解釋，由于pH 11高堿性提取時，油體表面的部分蛋白質和磷脂會脫離油體，因此，pH 11 OB的粒徑減小。此外，本試驗中，大豆油體的蛋白質含量明顯高于其他植物種子（油菜籽、芥菜子、棉花籽、玉米、花生、芝麻等）油體［11］，這是由于其他植物種子油體粒徑一般為0.5～2.5μm［1］，大豆油體的尺寸更小，只有200～500 nm［12］，具有較大的表面積／體積，因此大豆油體含有較高比例的蛋白質是合理的。

由圖2b可見，與pH 6.8 OB相比，表面蛋白質均是油體蛋白的pH 11 OB的等電點向堿性移動。pH 6.8 OB的等電點在4.5～5之間，pH 11 OB的等電點在5.5～6之間（更靠近于5.5）。這是由于pH 6.8 OB表面結合的雜蛋白（大豆7S、11S球蛋白以及 Gly m Bd 30K、P34）均為酸性蛋白［13-14］，這些酸性蛋白使得pH 6.8 OB的等電點偏向酸性；而油體蛋白均為堿性蛋白［15］，因此，pH 11 OB的等電點增大。

圖2 高堿性提取對大豆油體的平均粒徑分布及zeta電位的影響

2.4 高堿性提取對大豆油體氨基酸組成分析

表2所示為pH 6.8 OB和pH 11 OB蛋白質中各種氨基酸的摩爾分數。由表2分析可得，隨pH值增加，整體上，疏水性氨基酸含量增加。原因是隨提取pH值增加，油體雜蛋白脫離油體，油體蛋白成為油體表面的主要蛋白質；而油體蛋白是疏水性蛋白，因此，油體蛋白質疏水性氨基酸含量增加。

表2 高堿性提取對大豆油體氨基酸的影響

2.5 高堿性提取對大豆油體中中性脂脂肪酸組成的影響

表3所示為pH 6.8 OB和pH 11 OB的中性脂中各種脂肪酸的含量。由表3可見，對于pH 6.8 OB與pH 11 OB的中性脂而言，脂肪酸組成基本上是相同的。該結果表明，pH 11強堿性提取條件不會對油體中心部位的中性脂產生影響。同時也說明油體所擁有的天然乳化結構可以很好地保護TAGs免受外界環境的干擾與破壞。

表3 高堿性提取對大豆油體中性脂脂肪酸組成的影響

2.6 高堿性提取對大豆油體中生育酚組成的影響

圖3可見，2種油體的中性脂部分中生育酚的含量基本相同。其中，α-生育酚含量在0.015～0.02 mg／g中性脂范圍內；β和γ-生育酚的總含量在0.24～0.27 mg／g中性脂范圍內；δ-生育酚含量在0.47～0.50 mg／g中性脂范圍內。由于生育酚是脂溶性物質，它存在于油體中間的疏水部位（即中性脂）。該結果說明，油體的乳化結構能夠很好的保護中性脂中的生育酚，即使是pH 11的強堿性提取條件。因此，油體有利于保護生育酚，這使得油體作為生物活性物質的天然載體具有廣闊的應用前景。

圖3 高堿性提取對大豆油體生育酚組成的影響

3 結論

堿性提取條件已廣泛應用于油體的提取，雖然高堿性提取能夠獲得純凈、不含有過敏性蛋白及其他雜蛋白質的油體，但是它在一定程度上仍會改變所提取油體的成分和性質。尤其是對大豆油體表面的蛋白質和磷脂成分產生較為顯著的影響；然而對核心的中性脂部分（脂肪酸組成、生育酚組成）卻基本無影響。同時也證明了油體特殊的天然乳化結構可以保護其內的TAGs，在植物種子的貯藏中對于防止植物種子中TAGs的分解、氧化等具有重大意義。

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Composition Changes of Soybean Seed Oil Body by High-Alkaline Extraction

Cao Yanyun Chen Yeming Hua Yufei
（State Key Laboratory of Food Science and Technology School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

The resech herein described had taken soybean oil body as study object.It was discrete intracellular organelle for storing triacylglycerols（TAGs），being composed of neutral lipid（mainly TAGs）matrix shielded by a monolayer of phospholipids embedded with special proteins.Alkaline extraction has been extensively adopted for oil body preparation；high-alkaline condition is beneficial for pure oil body extraction.However，the effect of high alkaline condition on oil body components is not clear.Thus，the high-alkaline effects on the following items have been studied as follows：neutral lipid，protein and phospholipid contents；protein composition and its amino acid composition；fatty acid composition；tocopherol composition in oil body.Particle size distribution and zeta potential of oil body were also studied.The results showed that high-alkaline condition has a great influence on protein as well as phospholipid on oil body surface while nearly no influence on the neutral lipid.High-alkaline condition would cause protein and phospholipid release from oil body，namely，the value of proteins／neutral lipids decreased from 0.097（pH 6.8 OB）to 0.058（pH 11 OB）and phospholipids／neutral lipids decreased from 0.068（pH 6.8 OB）to 0.029（pH 11 OB）.Average particle decreased from（509±3）nm（pH 6.8 OB）to（451±7）nm（pH 11 OB），while the isoelectric point range increased from4.5～5（pH 6.8 OB）to 5.5～6（pH 11 OB）.It was also demonstrated that naturally emulsified structure of oil body could protect the TAGs from damaging.

soybean seed oil body，protein，phospholipids，neutral lipids，alkaline extraction，amino acid composition，fatty acid，tocopherol

TS221

A

1003-0174（2014）03-0037-05

2013-05-23

曹艷蕓，女，1989年出生，碩士，大豆油體蛋白

陳業明，男，1982年出生，副教授，植物蛋白