冷沉法制備花生球蛋白及伴花生球蛋白工藝研究

封小龍 劉紅芝 劉 麗 王 強

冷沉法制備花生球蛋白及伴花生球蛋白工藝研究

封小龍 劉紅芝 劉 麗 王 強

（農業部農產品加工與質量控制重點開放實驗室中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

以花生球蛋白提取率為指標，對冷沉法提取花生球蛋白及伴花生球蛋白進行工藝優化。在單因素的基礎上，經2次提取，通過L9（43）正交試驗設計確定最佳提取工藝，結果表明，影響花生球蛋白提取率的各因素顯著程度：冷沉時間＞料液比＞磷酸緩沖溶液濃度＞溶液pH。最佳提取條件為：料液比5∶10、溶液pH 7.1、磷酸緩沖溶液濃度0.4 mol／L、冷沉時間4 h。在此條件下花生球蛋白的提取率為53.60%。花生球蛋白提取后的上清，即為伴花生球蛋白。研究發現，不同冷沉次數對花生球蛋白組分純度影響不顯著，直接干燥上清比上清酸沉后制備的伴花生球蛋白蛋白含量要低，但是組分純度無顯著差異。真空冷凍干燥制備的花生球蛋白組分純度76.40%，伴花生球蛋白組分純度64.10%；噴霧干燥制備的花生球蛋白組分純度74.30%，伴花生球蛋白組分純度62.73%，不同干燥方式對花生蛋白組分純度影響顯著（P＜0.01）。

花生粉 冷沉法 花生球蛋白 伴花生球蛋白

花生是全球最重要的四大油料作物之一，是食用和榨油兼用的油料作物，中國是世界上重要的花生生產大國，產量約占世界總產量的40%［1］。脫脂花生粕是油脂壓榨后的副產物，其蛋白含量達50%，是我國重要的植物蛋白資源［2］。花生蛋白分為兩大類：90%為鹽溶性蛋白，10%為水溶性蛋白［3］。鹽溶性蛋白主要包括花生球蛋白（14S），伴花生球蛋白Ⅰ（2S）和伴花生球蛋白Ⅱ（7.8S），它們之間的含量比例分別為花生球蛋白73%，伴花生球蛋白Ⅰ6%，伴花生球蛋白Ⅱ21%［4］。花生球蛋白和伴花生球蛋白是花生中含量最多且最重要的兩種組分，它們的性質影響花生蛋白的各項功能特性［5］。

目前，花生球蛋白和伴花生球蛋白的提取方法主要是硫酸銨沉淀法［6］。硫酸銨沉淀法分離提取花生組分是基于蛋白質鹽析特性，可以將花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ、伴花生球蛋白Ⅱ3種組分分開，由于條件限制，硫酸銨沉淀法僅適用于小規模提取的實驗室研究，不適合產業化生產。冷沉法是利用花生球蛋白具有低溫冷沉這一特性對花生蛋白組分進行分離，Neucere［7］曾對冷沉法提取花生蛋白組分進行過相關報道，但是提取工藝與硫酸銨沉淀法相結合，并沒有單獨對冷沉法提取花生球蛋白和伴球蛋白進行系統研究。Basha等［8］通過Sephacryl S-300柱層析分離純化冷沉蛋白，探討冷沉時間、離子強度、溶液pH等不同因素對其影響，并分離制備冷沉蛋白Ⅰ和冷沉蛋白Ⅱ。本試驗采用冷沉法對花生球蛋白和伴花生球蛋白進行分離制備，考察了料液比、溶液pH、磷酸緩沖溶液濃度、冷沉時間等因素對花生球蛋白提取率的影響，并對影響花生球蛋白和伴花生球蛋白組分純度的因素進行探討，冷沉法分離制備花生蛋白組分工藝的確立，旨在為真正實現兩種組分產業化制備提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生脫脂粉：山東省高唐藍山集團；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CRZZGⅡ高速冷凍離心機：日本Hitachi公司；KJELTEC 2300自動凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司；B-290小型噴霧干燥機：瑞士BUCHI公司；LGJ-25真空冷凍干燥機：北京四環科學儀器公司；垂直板電泳槽（儀）：北京百晶生物技術有限公司；90-4數顯控溫磁力攪拌器：上海振榮科學儀器有限公司；凝膠成像系統：AlphaEase FC美國；YP3001 N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；Casarte冰箱：海爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白含量測定

脫脂花生粉和溶液中蛋白質含量測定采用GB 5009.5—2003凱氏定氮法測定［9］。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉電泳（SDS-PAGE）

根據郭堯君［10］報道 SDS-PAGE電泳方法，略有調整。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為13%，電泳進樣前，將2.0 mg樣品與0.5 mL樣品緩沖液震蕩混勻，煮沸5 min，迅速冷卻，并離心5 min，電泳上樣量為4.0μL。凝膠電泳于恒壓下進行，在濃縮膠中電壓為80 V，進入分離膠后增至110 V。等電泳前沿跑至距玻璃板邊緣1 cm左右時停止電泳。將凝膠膠片取出放入適量考馬斯亮藍R250染色1 h，再用甲醇和醋酸混合液脫色，期間換脫色液2～3次，至蛋白質譜帶清晰時為止。

1.3.3 花生球蛋白、伴花生球蛋白組分純度測定方法

用凝膠成像軟件AlphaEase FC掃描電泳膠片，對花生蛋白的組分純度進行分析。各組分純度由該組分對應條帶算得的光密度總和除以全部條帶光密度的總和確定。通過染色帶的強弱分析，可以得到某一特定蛋白占總蛋白含量的相對比值，即樣品的組分純度。

1.4 試驗設計

1.4.1 花生球蛋白和伴花生球蛋白制備工藝

1.4.1.1 試驗的工藝流程

將花生脫脂粉用一定pH和濃度的磷酸緩沖溶液混合溶解，攪拌1 h，離心（常溫，8 000 r／min，30 min）。去除沉淀，取上清于2℃冷沉一定時間，然后離心（2℃，8 000 r／min，30 min）。沉淀經干燥（冷凍干燥或噴霧干燥）得花生球蛋白，上清干燥（冷凍干燥或噴霧干燥）得伴花生球蛋白。工藝流程如圖1所示：

圖1 冷沉法分離花生球蛋白和伴花生球蛋白流程圖

1.4.1.2 花生球蛋白提取率計算

以花生球蛋白提取率為指標，提取率越大，花生球蛋白提出越多，從而伴花生球蛋白蛋白純度越高。稱取一定質量的脫脂花生粉m0，在提取工藝中，對磷酸緩沖溶液第1次提取的蛋白上清稱重m1，并測定液體中蛋白含量，計算上清中蛋白（總蛋白）含量；對第2次冷沉離心后的上清稱重m2，并測定液體中蛋

式中：48.99%為脫脂花生粉蛋白質量分數。

1.4.2 冷沉條件優化

1.4.2.1 單因素試驗設計

在確定浸提次數的基礎上，本試驗重點考察提取步驟中可能影響花生球蛋白提取率的料液比、磷酸緩沖溶液濃度、溶液pH以及冷沉時間4個因素，設置水平分別為料液比：1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10；溶液 pH：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；磷酸緩沖溶液濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol／L；冷沉時間：0、2、4、8、12、16、20 h。

1.4.2.2 正交試驗設計

在單因素的基礎上，采用DPS軟件進行L9（43）正交試驗設計（表1）。對試驗結果進行極差分析，進而確定球蛋白最佳提取工藝。白含量，計算冷沉上清中蛋白（伴花生球蛋白）含量，低溫離心后所得的沉淀即為花生球蛋白。因此：

表1 正交試驗設計表

1.4.3 花生蛋白組分純度摸索

1.4.3.1 不同冷沉次數制備花生球蛋白

通過最佳工藝制備花生球蛋白，然后用磷酸緩沖溶液繼續溶解沉淀，并在2℃繼續冷沉。用磷酸緩沖溶液反復浸提、冷沉花生球蛋白，制備1、2、3、4、5次冷沉凍干樣品。通過進行SDS-PAGE電泳，分析花生球蛋白亞基條帶的變化，研究冷沉次數對其組分純度的影響。

1.4.3.2 不同方式制備伴花生球蛋白

通過最優工藝提取花生球蛋白，對冷沉上清采取2種處理方式制備伴花生球蛋白：直接干燥—上清直接進行真空冷凍干燥，制備伴花生球蛋白樣品；酸沉后干燥—調節上清pH至4.5，并離心（4 500 r／min，20 min），去除上清，然后真空冷凍干燥沉淀制備伴花生球蛋白樣品，比較2種方式制備的伴花生球蛋白的蛋白含量及組分純度。

1.4.3.3 不同干燥方式制備花生球蛋白和伴花生球蛋白

通過最優工藝提取花生球蛋白，采用酸沉后干燥的方式制備伴花生球蛋白。用真空冷凍干燥和噴霧干燥2種方式制備花生球蛋白及伴花生球蛋白樣品，對其進行SDS-PAGE電泳分析，經光密度掃描測定花生球蛋白和伴花生球蛋白的組分純度，并測定其蛋白含量。

1.4.4 數據分析

數據處理是采用MSExcel 2010和DPS軟件，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 冷沉法提取花生球蛋白單因素試驗

2.1.1 料液比對花生球蛋白提取率的影響

在溶液pH 7.5、磷酸緩沖溶液濃度0.2 mol／L、冷沉時間16 h的條件下，考察料液比對花生球蛋白提取率的影響，結果如圖2所示。隨著料液比的增加，花生球蛋白的提取率呈先升高后降低的趨勢，在料液比為4∶10時提取率達到最大。可能是因為磷酸緩沖溶液提取的上清在低溫下放置，料液比較大和較小時均不利于花生球蛋白冷沉，從而使花生球蛋白得率偏低。

圖2 料液比對花生球蛋白提取率的影響

2.1.2 溶液pH對花生球蛋白提取率的影響

圖3 溶液pH對花生球蛋白提取率的影響

在料液比4∶10、磷酸緩沖溶液濃度 0.2 mol／L、冷沉時間16 h的條件下，考察溶液pH對花生球蛋白提取率的影響，結果如圖3所示。隨著pH的增大，蛋白溶出增多，花生球蛋白的提取率逐漸增大，pH 7.5時花生球蛋白的提取率達到35%，pH再增加會對蛋白質的功能性質產生影響［11-12］。因此選擇在溶液pH 7.5的條件下對花生球蛋白進行提取。

2.1.3 磷酸緩沖溶液濃度對花生球蛋白提取率的影響

在料液比4∶10、溶液pH 7.5、冷沉時間16 h的條件下，考察磷酸緩沖溶液濃度對花生球蛋白提取率的影響，結果如圖4所示。在0.1～0.3 mol／L時，隨著磷酸緩沖溶液濃度的增大，花生球蛋白的提取率呈上升趨勢，從12%上升至40%，表明磷酸緩沖溶液在一定范圍內有利于花生球蛋白的提取，但是在0.3 mol／L以后，花生球蛋白的提取率變化趨于平穩。因此，選取磷酸緩沖溶液濃度為0.3 mol／L。

圖4 磷酸緩沖溶液濃度對花生球蛋白提取率的影響

2.1.4 冷沉時間對花生球蛋白提取率的影響

在料液比4∶10、溶液pH 7.5、磷酸緩沖溶液濃度0.2 mol／L的條件下，考察冷沉時間對花生球蛋白提取率的影響，結果如圖5所示。在0～4 h范圍內，隨著冷沉時間的延長，花生球蛋白的提取率急劇上升。冷沉4 h以后，花生球蛋白提取率趨于平穩，冷沉時間的增加對花生球蛋白提取率影響甚微，可能是花生球蛋白冷沉達到動態平衡。因此，選擇冷沉時間為4 h。

圖5 冷沉時間對花生球蛋白提取率的影響

2.2 花生脫脂粉浸提次數的確定

以花生蛋白總蛋白提取率為指標確定最佳浸提次數。在料液比為4∶10，磷酸緩沖溶液濃度為0.2 mol／L，溶液 pH為7.5的條件下，浸提次數取1、2、3、4、5次。浸提次數對總蛋白提取率如圖6所示。試驗結果表明，花生蛋白的提取率在1次提取至2次提取時迅速增加，增加幅度為16.70%，而超過2次后則增速大幅度放緩，趨于平穩。這主要是由于每次浸提時，花生蛋白溶出率達到動態平衡，兩次浸提后，花生蛋白基本已溶出，并且過多的浸提次數會增加磷酸緩沖溶液的用量，加大成本，不利于工業化生產，故選取浸提次數為2次。因此在確定浸提次數為兩次的基礎上，進行正交試驗。

圖6 浸提次數對花生總蛋白提取率的影響

2.3 花生球蛋白冷沉條件優化

2.3.1 磷酸緩沖溶液提取花生球蛋白正交優化試驗

根據單因素試驗結果，確定出最優參數為料液比4∶10、溶液 pH 7.5、磷酸緩沖溶液濃度0.3 mol／L、冷沉時間4 h。

表2 正交試驗極差分析表

通過2次浸提花生脫脂粉，對花生球蛋白進行提取。在單因素的基礎上，進行L9（43）四因素三水平正交試驗設計，結果用Duncan新復極差法分析，對各因素的影響進行顯著性分析，正交試驗結果和極差分析如表2所示。各因素的極差越大說明其對花生球蛋白的提取率影響越顯著，各因素對花生球蛋白提取率影響的主次順序依次為：D（冷沉時間）＞A（料液比）＞C（磷酸緩沖溶液濃度）＞B（溶液pH）。最優組合為 A3B3C3D2，即料液比為5∶10、溶液pH為7.9、磷酸緩沖溶液濃度為0.4 mol／L、冷沉時間為4 h。

2.3.2 磷酸緩沖溶液提取花生球蛋白試驗優化及驗證

A3B1C3D2為正交試驗9組中提取率最高的一組浸提工藝條件，提取率達到54.71%。以A3B1C3D2和A3B3C3D22組工藝條件做1次驗證試驗，驗證結果如表3所示。根據正交試驗極差分析和試驗驗證結果，確定花生球蛋白最佳提取工藝參數為A3B1C3D2：即料液比為5∶10、溶液pH為7.1、磷酸緩沖溶液濃度為0.4 mol／L、冷沉時間為4 h。以該最優浸提工藝，提取花生球蛋白，離心后上清干燥即為伴花生球蛋白。

表3 模型驗證試驗

2.4 花生蛋白組分純度摸索

2.4.1 磷酸緩沖溶液冷沉次數對花生球蛋白組分純度的影響

花生蛋白主要由花生貯藏蛋白組成［13-14］（表4），包括花生球蛋白（40.5、37.5、35.5、23.5 ku）；伴花生球蛋白Ⅱ（61.0 ku）和伴花生球蛋白Ⅰ（15.5、17.0、18.0 ku）。

通過不同冷沉次數，采用真空冷凍干燥的方式制備花生球蛋白樣品，并進行SDS-PAGE電泳（圖7），經光密度分析，測定不同浸提次數所得的花生球蛋白組分純度如表5所示。表明1次冷沉花生球蛋白的組分純度為77.97%，而5次冷沉后組分純度僅升高2.03%，為80.00%。雖然不同冷沉次數制備的花生球蛋白樣品組分純度有略微的升高，但是幅度均很小。經DPS顯著性分析，發現不同冷沉次數制備的花生球蛋白組分純度并無顯著性差異。

表4 花生蛋白質組成

圖7 不同冷沉次數制備花生球蛋白SDS-PAGE圖譜

表5 不同冷沉次數制備花生球蛋白組分純度

2.4.2 不同方式制備伴花生球蛋白

圖8 不同方式制備伴花生球蛋白SDS-PAGE圖譜

真空冷凍干燥制備的伴花生球蛋白樣品，經SDS-PAGE電泳（圖8），通過光密度掃描分析測定其組分純度，見表6。數據表明，通過上清直接凍干制備的伴花生球蛋白組分純度64.6%，蛋白質量分數28.88%；而酸沉后凍干制備的伴花生球蛋白的組分純度64.1%，蛋白質量分數84.52%。

經DPS顯著性分析，發現不同方式制備的伴花生球蛋白的組分純度并無顯著性差異；上清直接凍干制備的伴花生球蛋白蛋白含量較高，主要是因為直接凍干制備的伴花生球蛋白中多糖、纖維等雜質較多。綜合兩方面的因素考慮，選擇酸沉后干燥的方式制備伴花生球蛋白。

表6 不同方式制備伴花生球蛋白組分純度和蛋白含量

2.4.3 不同干燥方式制備花生球蛋白和伴花生球蛋白

在最優工藝條件下提取花生球蛋白，上清通過酸沉后干燥的方式制備伴花生球蛋白，采用真空冷凍干燥和噴霧干燥2種干燥方式制備花生球蛋白和伴花生球蛋白樣品，SDS-PAGE電泳圖譜如圖9所示，組分純度如表7所示。

圖9 不同干燥方式制備花生蛋白組分SDS-PAGE圖譜

表7 不同干燥方式制備花生蛋白組分純度

真空冷凍干燥和噴霧干燥制備的花生球蛋白組分純度分別為76.40%、74.30%，噴干比凍干制備的花生球蛋白組分純度低2%；真空冷凍干燥和噴霧干燥制備的伴花生球蛋白組分純度分別為64.10%、62.73%，噴干比凍干制備的伴花生球蛋白組分純度低1.37%。經DPS顯著性分析，發現不同干燥方式制備的花生蛋白組分純度有顯著性差異。Chiou［15］曾報道，加熱會對花生球蛋白和伴花生球蛋白產生很大影響，使蛋白亞基發生變化。

據文獻報道硫酸銨沉淀法分離花生蛋白組分，花生球蛋白組分純度為85.53%，伴花生球蛋白組分純度為75.81%［13］。冷沉法制備的花生蛋白組分純度較低，可能是因為硫酸銨沉淀法分離制備的花生蛋白組分主要利用的是花生蛋白組分鹽析的特性，分離純度較高，而冷沉法是利用的花生球蛋白低溫沉淀的特性，雜質相對較多。

3 結論

3.1 以花生球蛋白的提取率為指標，通過單因素和L9（43）四因素三水平正交試驗分析，在浸提次數為2次的基礎上，確立冷沉法分離制備花生蛋白組分的最佳工藝條件：即料液比為5∶10、溶液pH為7.1、磷酸緩沖溶液濃度為0.4 mol／L、冷沉時間為4 h，在此條件下花生球蛋白的提取率為53.60%。各因素對花生球蛋白提取率的影響順序為：冷沉時間＞料液比＞磷酸緩沖溶液濃度＞溶液pH。

3.2 花生球蛋白組分純度隨冷沉次數的增加略有升高，1次冷沉花生球蛋白的組分純度為77.97%，而5次冷沉時，花生球蛋白組分純度只升高2.03%，為80.00%，冷沉次數對花生球蛋白組分純度影響并不顯著。

3.3 不同方式制備伴花生球蛋白—直接干燥和酸沉后干燥，對伴花生球蛋白的組分純度影響不顯著；但是直接凍干上清制備的伴花生球蛋白蛋白含量僅為28.88%，而酸沉后制備的伴花生球蛋白，蛋白質量分數遠遠高于直接凍干的樣品。因此確定對上清酸沉后干燥的方式制備伴花生球蛋白，得到的伴花生球蛋白組分純度為64.1%，蛋白質量分數為84.52%。

3.4 分別采用真空冷凍干燥和噴霧干燥2種方式制備花生球蛋白和伴花生球蛋白。冷凍干燥和噴霧干燥制備的花生球蛋白組分純度分別為76.40%、74.30%，制備的伴花生球蛋白組分純度分別為64.10%、62.73%。噴霧干燥制備的樣品組分純度均比冷凍干燥制備的樣品組分純度低，且差異顯著（P＜0.01）。

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Cryoprecipitation Extraction Technology of Arachin and Conarachin

Feng Xiaolong Liu Hongzhi Liu Li Wang Qiang
（Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

The study has taken the extraction ratio of arachin as an index to have a technology for extracting arachin and conarachin by cryoprecipitation research.On the basis of single factor experiments，after twice extraction，the extraction conditions have been optimized by orthogonal experimental design of L9（43）.The results showed that cryo-time and the rate of solution to solid were the main factors which effected to the arachin extraction rate，and followed by the buffer concentration as well as the pH value.The optimum extraction conditions were as follows：the rate of solution to solid 5：10（m／V），pH value 7.1，buffer concentration 0.4 mol／L，cryo-time 4 h.On the condition，the arachin extraction rate was 53.60%.After the extraction of arachin，the supernatant was conarachin.The result showed that the difference of times of cryoprecipitation has no effect on the purity of arachin.The content of protein of drying supernatant directly is lower than that of acid-depositing，but the method of extracting conarachin does not effect to the purity.The purity of arachin and conarachin is 76.40%and 64.10%respectively prepared by vacuum drying；74.30%and 62.73%prepared by spray drying.Different types of drying exert significant effect on the purity of peanut proteins（P＜0.01）.

peanut flour，cryoprecipitation，arachin，conarachin

TS201.2

A

1003-0174（2014）03-0057-07

2009公益性行業科研專項（200903043），“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B00）

2013-04-09

封小龍，男，1986年出生，碩士，糧油加工與功能食品

王強，男，1965年出生，研究員，博士生導師，糧油加工與功能食品