苦楝化學成分及抗糖尿病活性研究

譚欽剛 ，賴春華，張貴杰，陳毅飛，覃德績，王恒山

1桂林醫學院;2 廣西師范大學，桂林 541004

苦楝(Melia azedarach L.)為楝科(Meliaceae)楝屬(Melia)植物，其樹皮因良好的藥理活性曾收載于2010 年《中國藥典》一部［1］。研究表明，苦楝葉提取物能使糖尿病小鼠的血糖水平顯著下降且呈量效關系［2］，為了深入研究苦楝皮的化學成分及抗糖尿病活性，本實驗對苦楝皮乙醇提取物的化學成分進行了研究，共分離得到5 個三萜類成分和3 個酚性化合物，并對分離得到的部分化合物進行了體外抗糖尿病活性測試。研究結果表明，化合物1～3，6，7 為首次從該植物中分離得到。受試化合物2～5 均未表現出葡萄糖激酶(glucokinase，GK)、組蛋白去乙?；?sirtuin1，SIRT1)體外激動活性和二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPPIV)抑制活性，其中化合物2 對人11β-羥基類固醇脫氫酶1(11βhydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1)具有顯著的抑制作用，并對人11β-HSD2 有良好的選擇性。

1 儀器與材料

FAB-MS 用VG Auto Spec-3000，EI-MS 用VG ZAB-SH 質譜儀(英國VG 公司);NMR 用Bruker AM-400 或DRX-500 核磁共振儀測定(德國Bruker公司，TMS 為內標);酶標儀(SpectraMax 190，美國Molecular Device 公司);PHS-3TC 型精密數顯pH 計(上海天達儀器有限公司);薄層層析檢測用UV-210 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

柱層析硅膠(200～300 目)，GF254薄層板為青島海洋化工廠生產;Rp-18(40～65 μm)為德國Merck公司產品;Sephadex LH-20(40～70 μm)為瑞典Pharmacia 公司產品;分離純化用試劑為分析純，10%的硫酸-乙醇溶液(加熱)檢測;陽性對照物PSN-GK1、MK0431(FW:505)、白黎蘆醇(RSV)、甘草次酸購自Sigma 公司，小鼠或人11β-HSD 基因購自NIH Mammalian Gene Collection。

樣品購自云南昆明，由中國科學院昆明植物研究所曾春霞博士鑒定為苦楝(Melia azedarach L.)的皮。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

苦楝皮干燥品(10 kg)粉碎，用95%的乙醇加熱回流提取3 次，濾液減壓回收得提取物570 g，水分散后用乙酸乙酯萃取3 次，得乙酸乙酯萃取物260 g，上硅膠柱層析，用氯仿∶丙酮(1∶0～1∶1)系統梯度洗脫，得到七個組分(Fr.I -VII)。Fr.III 經硅膠柱層析，以石油醚-丙酮(6∶1～3∶1)洗脫，再經甲醇結晶得化合物1(73.0 mg)，6(5.8 mg)。Fr.IV 經Rp-18 柱層析，以甲醇-水(7 ∶3～10 ∶0)洗脫，以Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)過濾，甲醇結晶得化合物2(56.1 mg)，3(24.8 mg)，4(29.5 mg)。Fr.V 經Rp-18 柱層析，以甲醇-水(5∶5～10∶0)洗脫，甲醇結晶得化合物5(383.2 mg)。Fr.VI 經Rp-18 柱層析，以甲醇-水(4∶6～10∶0)洗脫，甲醇結晶得化合物7(5.0 mg)，丙酮結晶得化合物8(9.3 mg)。

2.2 體外抗糖尿病活性研究

糖尿病發病原因復雜，某些酶與其發生發展密切相關，如GK 在糖尿病患者血糖平衡控制中有減少肝臟葡萄糖生成和促胰島素分泌的雙重作用［3］，SIRT1 激動劑可改善肥胖糖尿病大鼠的胰島素敏感性［4］，DPPIV 的活性增高與糖尿病的發生存在相關性［5］，抑制11β-HSD 的活性可使糖尿病患者的代謝作用正常等［6］。

采用文獻［7］描述的酶偶聯分析法，測定化合物2-5 對GK 和SIRT1 的激動活性;按文獻［8］方法構建體外篩選模型并測定上述化合物抑制DPPIV 的活性;按文獻［9］方法，測定上述化合物對小鼠和人11β-HSD 的抑制作用。

3 實驗結果

3.1 化合物結構鑒定

化合物1 無色針狀結晶(MeOH)，mp.194～195 ℃;FAB-MS(negative):m/z 457［M-1］-;分子式C30H50O3;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.10(1H，t，J=6.9 Hz，H-24)，3.56(1H，m，H-12)，1.66(3H，s，H-26)，1.61(3H，s，H-27)，1.15(3H，s)，1.06(3H，s)，1.02(3H，s)，1.00(3H，s)，0.96(3H，s)，0.87(3H，s);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:39.7(t，C-1)，34.0(t，C-2)，217.9(s，C-3)，47.7(s，C-4)，55.2(d，C-5)，19.6(t，C-6)，34.0(t，C-7)，39.5(s，C-8)，49.3(d，C-9)，36.7(s，C-10)，30.9(t，C-11)，70.4(d，C-12)，48.6(d，C-13)，51.9(s，C-14)，31.5(t，C-15)，26.2(t，C-16)，49.9(d，C-17)，15.9(q，C-18)，15.3(q，C-19)，74.5(s，C-20)，21.7(q，C-21)，30.9(t，C-22)，21.9(t，C-23)，124.5(d，C-24)，132.0(s，C-25)，25.7(q，C-26)，17.8(q，C-27)，26.6(q，C-28)，20.9(q，C-29)，16.9(q，C-30)。以上數據與文獻［10］報道一致，故該化合物鑒定為12β，20(S)-dihydroxydammar-24-en-3-one。

化合物2 無色針狀結晶(MeOH)，mp.205～206 ℃;ESI-MS(negative):m/z 605 ［M-1］-;分子式C39H58O5;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ:9.58(1H，d，J=4.1 Hz，3'-OH)，9.15(1H，d，J=6.9 Hz，4'-OH)，7.43(1H，d，J=15.9 Hz，H-8')，7.02(1H，s，H-2')，6.98(1H，d，J=8.2 Hz，H-6')，6.73(1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.22(1H，d，J=15.9 Hz，H-7')，5.05(1H，t，J=7.2 Hz，H-24)，4.47(1H，dd，J=10.6，4.1 Hz，H-3)，4.65(1H，d，J=11.8 Hz，H-1)，3.86(1H，s，20-OH)，1.60(3H，s，H-26)，1.51(3H，s，H-27)，1.00(3H，s)，0.91(3H，s)，0.87(3H，s)，0.84(3H，s)，0.83(3H，s)，0.81(3H，s);13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ:38.9(t，C-1)，24.3(t，C-2)，79.8(d，C-3)，38.1(s，C-4)，55.2(d，C-5)，17.8(t，C-6)，35.2(t，C-7)，39.9(s，C-8)，50.0(d，C-9)，36.6(s，C-10)，21.9(t，C-11)，24.9(t，C-12)，41.6(d，C-13)，49.9(s，C-14)，31.3(t，C-15)，27.3(t，C-16)，49.9(d，C-17)，16.4(q，C-18)，16.1(q，C-19)，73.0(s，C-20)，25.3(q，C-21)，41.3(t，C-22)，22.3(t，C-23)，125.3(d，C-24)，130.1(s，C-25)，25.6(q，C-26)，17.5(q，C-27)，27.8(q，C-28)，15.3(q，C-29)，16.6(q，C-30)，125.5(s，C-1')，114.4(d，C-2')，144.9(s，C-3')，148.4(s，C-4')，114.8(d，C-5')，121.3(d，C-6')，145.6(d，C-7')，115.7(d，C-8')，166.4(s，C-9')。以上數據與文獻［11］報道一致，故該化合物鑒定為dammarendiol II 3-O-caffeate。

化合物3 片狀結晶(MeOH)，mp.110～112℃;EI-MS:m/z 438［M］+;分子式C31H50O;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.71(1H，br s，H-31)，4.65(1H，br s，H-31)，1.09(3H，s，H-30)，1.03(3H，s，H-29)，1.02(3H，d，J=6.5 Hz，H-27)，1.02(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，1.00(3H，s，H-18)，0.98(3H，s，H-28)，0.89(3H，d，J=6.0 Hz，H-21);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:33.4(t，C-1)，37.4(t，C-2)，216.5(s，C-3)，50.2(s，C-4)，48.4(d，C-5)，21.5(t，C-6)，28.1(t，C-7)，47.8(d，C-8)，21.0(s，C-9)，25.9(s，C-10)，25.8(t，C-11)，35.5(t，C-12)，45.3(s，C-13)，48.7(s，C-14)，32.7(t，C-15)，26.7(t，C-16)，52.2(d，C-17)，18.3(q，C-18)，29.5(q，C-19)，36.1(d，C-20)，18.0(q，C-21)，34.9(t，C-22)，31.2(t，C-23)，156.7(s，C-24)，33.7(d，C-25)，21.9(q，C-26)，21.8(q，C-27)，19.3(q，C-28)，22.1(q，C-29)，20.7(q，C-30)，105.9(t，C-31)。以上數據與文獻［12］報道一致，故該化合物鑒定為24-methylenecycloartenone。

化合物4 無色粉末，FAB-MS(negative):m/z 709［M-1］-;分子式C41H58O10;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.04(2H，d，J=7.7 Hz，H-3' and H-7')，7.52(1H，m，H-5')，7.38(2H，t，J=7.5 Hz，H-2'and H-6')，5.30(1H，br.d，J=2.1 Hz，H-15)，5.13(1H，br.s，H-7)，4.83(1H，s，H-3)，4.65(1H，d，J=11.8 Hz，H-1)，3.92(br.s，W1/2，J=3.5 Hz)，3.54(1H，m，H-21)，2.12(3H，s，COCH3)，1.60(3H，s，COCH3)，1.35(3H，s，H-27)，1.24(3H，s，H-26)，1.08(3H，s，H-30)，1.06(3H，s，H-29)，0.96(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-19)，0.86(3H，s，H-28);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:72.6(d，C-1)，25.3(t，C-2)，77.0(d，C-3)，36.4(s，C-4)，37.3(d，C-5)，23.0(t，C-6)，75.4(d，C-7)，41.9(s，C-8)，35.2(d，C-9)，40.1(s，C-10)，16.0(t，C-11)，34.6(t，C-12)，46.3(s，C-13)，158.8(s，C-14)，119.2(d，C-15)，33.7(t，C-16)，56.8(d，C-17)，19.9(q，C-18)，16.1(q，C-19)，29.7(d，C-20)，65.2(t，C-21)，32.6(t，C-22)，67.4(d，C-23)，96.5(s，C-24)，76.3(s，C-25)，23.1(q，C-26)，24.1(q，C-27)，27.9(q，C-28)，21.3(q，C-29)，26.7(q，C-30)，165.2(s，C-1')，130.5(s，C-2')，129.4(d，C-3')，128.2(d，C-4')，132.9(d，C-5')，128.2(d，C-6')，129.4(d，C-7')，169.7，170.1(s，COCH3)，20.9，21.3(q，COCH3)。以上數據與文獻［13］報道一致，故該化合物鑒定為meliavolin。

化合物5 無色針狀結晶(MeOH)，mp.215～217 ℃;FAB-MS(positive):m/z 733［M +1］+;分子式C37H48O15;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.91(1H，dd，J=13.7，6.3 Hz，H-3')，6.40(1H，d，J=3.0 Hz，H-23)，5.65(1H，s，H-21)，5.38(1H，d，J=2.9 Hz，H-22)，4.89(1H，s，H-3)，4.75(1H，s，H-1)，4.23(1H，d，J=2.3 Hz，H-7)，4.14 and 3.84(2H，d，J=9.1 Hz，H-19)，4.11(1H，s，H-15)，3.93(1H，dd，J=12.9，2.7 Hz，H-6)，3.68(3H，s，12-OMe)，3.54 and 3.46(2H，d，J=2.5 Hz，H-28)，3.34(3H，s，11-OMe)，3.03(1H，d，J=12.8 Hz，H-5)，2.91(1H，d，J=4.5 Hz，H-17)，2.10(3H，s，OCOCH3)，1.92(3H，s，OCOCH3)，1.48(3H，s，H-30)，1.34(3H，s，H-18)，0.98(3H，s，H-29);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:70.1(d，C-1)，28.1(t，C-2)，70.7(d，C-3)，42.2(s，C-4)，34.9(d，C-5)，71.7(d，C-6)，82.9(d，C-7)，51.9(s，C-8)，48.1(d，C-9)，49.8(s，C-10)，106.6(s，C-11)，169.0(s，C-12)，93.5(s，C-13)，92.8(s，C-14)，81.9(d，C-15)，28.8(t，C-16)，48.1(d，C-17)，25.8(q，C-18)，70.5(t，C-19)，91.7(s，C-20)，105.8(d，C-21)，105.4(d，C-22)，146.7(d，C-23)，76.0(t，C-28)，18.1(q，C-29)，18.0(q，C-30)，166.6(s，C-1')，128.2(s，C-2')，138.1(d，C-3')，14.3(q，C-4')，12.0(q，C-5')，170.2，171.4(s，COCH3)，20.9，21.4(q，COCH3)，52.3(q，C11-OCH3)，53.1(q，C12-OCH3)。以上數據與文獻［14］報道一致，故該化合物鑒定為3，20-diacetyl-11-methoxy-1-tigloylmeliacarpinin。

化合物6 無色針狀結晶(MeOH)，mp.145～147 ℃;EI-MS:m/z 210［M］+，分子式C10H10O5;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:12.89，(1H，s，4-OH)，12.42(1H，s，2-OH)，10.34(1H，s，CHO)，6.29(1H，s，H-5)，3.96(3H，s，OCH3)，2.53(3H，s，CH3);13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:193.9(s，CHO)，172.0(s，C-1')，168.3(s，C-4)，166.6(s，C-2)，152.3(s，C-6)，112.1(d，C-5)，108.4(s，C-3)，103.8(s，C-1)，52.3(q，OCH3)，25.2(CH3，q)。以上數據與文獻［15］報道一致，故該化合物鑒定為methyl 3-formyl-2，4-dihydroxy-6-methyl benzoate。

化合物7 淺黃色針狀結晶(MeOH)，mp.203～204 ℃;FAB-MS(negative):m/z 343［M-1］-;分子式為C18H16O7;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:13.3(1H，s，7-OH)，11.0(1H，s，3-OH)，5.98(1H，s，H-4)，2.68(3H，s，H-14)，2.66(3H，s，H-12)，2.11(3H，s，H-15)，1.76(3H，s，H-10);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:201.8(s，C-1)，103.9(s，C-2)，191.7(s，C-3)，98.3(d，C-4)，101.5(s，C-6)，163.9(s，C-7)，109.3(s，C-8)，157.5(s，C-9)，32.1(q，C-10)，198.0(s，C-11)，27.9(q，C-12)，200.4(s，C-13)，31.3(q，C-14)，7.6(q，C-15)，179.4(s，C-4a)，155.2(s，C-6a)，105.2(s，C-9a)，59.1(s，C-9b)。以上數據與文獻［16，17］報道一致，故該化合物鑒定為usnic acid。

化合物8 淺黃色針狀結晶(丙酮)，mp.241～243 ℃;FAB-MS(negative):m/z 289［M-1］-;分子式為C15H14O6;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.82，(1H，d，J=1.5 Hz，H-2')，6.75(1H，d，J=8.1 Hz，H-5')，6.70(1H，dd，J=8.1，1.6Hz，H-6')，5.91(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，5.84(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，4.55(1H，d，J=7.5 Hz，H-2)，3.96(1H，dd，J=13.8，7.7 Hz，H-3)，2.83(1H，dd，J=116.1，5.4 Hz，H-3)，2.48(1H，dd，J=16.1，8.1 Hz，H-3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:82.8(d，C-2)，68.8(d，C-3)，28.5(t，C-4)，100.8(s，C-4a)，157.8(s，C-5)，96.3(d，C-6)，157.6(s，C-7)，95.5(d，C-8)，156.9(s，C-8a)，132.2(s，C-1')，115.2(d，C-2')，146.2(s，C-3' and C-4')，116.1(d，C-5')，120.2(d，C-6')。以上數據與文獻［18，19］報道一致，故該化合物鑒定為epi-catechin。

3.2 化合物2～5 抗糖尿病活性

3.2.1 GK 體外活性篩選

化合物2～5 對人GK 激動作用篩選實驗重復3次，結果表明，1 μmol/L 的陽性對照PSN-GK1 可使GK 活性增加至溶劑對照組的2.63 倍，而化合物2～5 在濃度為10 μmol/L 時，僅使其活性增加至對照組的0.79～1.11 倍，因此，受試化合物無明顯的GK 激動活性。

3.2.2 化合物對人SIRT1 激動劑體外活性篩選

上述化合物對人SIRT1 的激動作用篩選試驗重復2 次，結果表明，200 μmol/L 的陽性對照RSV 可使SIRT1 活性增加至溶劑對照組的10.51 倍，而上述化合物在相同濃度時，僅使其活性增加至對照組的0.82～1.00 倍，因此，受試化合物均不具有顯著的SIRT1 激動活性。

3.2.3 化合物體外抑制DPPIV 活性篩選

測定上述化合物對DPPIV 的抑制作用，結果表明，0.1 μmol/L 的陽性對照MK0431 有很強的抑制作用，其比活力值為25.2%;受試化合物濃度為10 μmol/L 時，其比活力值為97.67～103.96%，表明上述化合物對DPPIV 均無激動活性。

3.2.4 化合物體外抑制11β-HSD 活性篩選

測定上述化合物對11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-HSD)的抑制活性，結果見表1。

表1 化合物對小鼠和人抑制11β-HSD1 型酶抑制率Table 1 Inhibitory activity of compounds 2-5 against 11β-HSD1

由表1 可知，化合物2 對人11β-HSD1 有明顯的抑制作用，進一步測定該化合物對11β-HSD1 抑制作用的IC50值和對人11β-HSD2 的抑制率，結果見表2。

經測定，化合物2 對人11β-HSD1 的IC50為94.15 nmol/L。從表2 可知，該化合物對人11β-HSD1 具有顯著的抑制作用，當其劑量為1 mmol/L時對人11β-HSD2 的抑制率低于50%，提示該化合物對人11β-HSD2 有良好的選擇性。

表2 化合物2 對人11β-HSD1 和11β-HSD2 的抑制率(X ± SD，n=2)Table 2 The inhibition activity of compounds 2 against human 11β-HSD1 and 11β-HSD2(X ± SD，n=2)

致謝:本實驗體外抗糖尿病活性測試由中國科學院上海藥物研究所內分泌組完成。

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