禹州漏蘆醇提物對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響

李喜鳳，胡春月，胡利欣，方曉艷，唐 露，張偉曉，安 碩，王優湑

河南中醫學院，鄭州 450046

禹州漏蘆為菊科植物藍刺頭屬(Echinopslatifolius Tausch)或華東藍刺頭(Echinopsgrijisii Hance)的干燥根［1］，始載于《神農本草經》列為上品，為河南傳統的道地藥材。文獻報道禹州漏蘆主要含有噻吩類、揮發油類及三萜類等化學成分，其中噻吩類具有抗炎、保肝、抗腫瘤的作用［2，3］，但對于禹州漏蘆藥材的藥效學目前無人進行系統的研究。該文采用CCl4小鼠急性肝損傷模型，對禹州漏蘆藥材的醇提取物進行實驗研究，為禹州漏蘆藥材藥用資源的合理開發和臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質量為(20 ±2)g，河南省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(豫)2010-0001。

1.2 藥品與試劑

禹州漏蘆藥材采自新鄉市輝縣，經本院生藥學科董誠明教授鑒定為菊科藍刺頭屬植物藍刺頭單個品種。陽性對照藥:聯苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業有限公司);SOD(批號:20111215)、MDA(批號:20111215)、GSH-PX(批號:20111214)、考馬斯亮蘭蛋白(批號:20111109)、ALT(生產批號:20111230)、AST(生產批號:20111230)，測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品;四氯化碳(開封市試劑總廠);其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

LDZA-0.8 型低速自動平衡微型離心機(北京醫用離心機廠);UV-2000 型紫外分光光度儀(上海尤尼柯);數顯恒溫水浴鍋(上海比郎儀器有限公司);FA2004B 電子天平(上海越平科學儀器有限公司);DF-1 集熱式恒溫磁力攪拌器(金壇市中大儀器廠)。

1.4 樣品的制備

禹州漏蘆藥材，經粉碎后充分混合，過2 號篩，用95%乙醇加熱回流提取，加10 倍量提取3 h 后再加入8 倍量提取3 h，第三次6 倍量提取2 h，合并3次提取液，揮干，加水配置成醇提物高劑量(425.21 mg/kg)、醇提物中劑量(231.94 mg/kg)、醇提物低劑量(119.70 mg/kg)。

2 實驗方法

2.1 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立

本實驗采用0.2% CCl4油溶液，以10 mL/kg體重腹腔注射的方法建立急性肝損傷模型。0.2%CCl4油溶液要現用現配，恒溫磁力攪拌器攪拌6 h。因CCl4與油溶液不易互溶，必須充分混勻，減少造模誤差。

2.2 動物分組及實驗流程

小鼠適應性喂養3 d，隨機分為6 組，每組10只:空白組、模型組、陽性藥組、禹州漏蘆醇高、中、低劑量組。正常組及模型組給予生理鹽水，陽性組給予聯苯雙酯滴丸(25 mg/kg)，禹州漏蘆醇提物高、中、低劑量組灌胃給藥，每天一次，連續7 d，于末次給藥1 h 后，正常組給予腹腔注射花生油，其余組給予腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液10 mL/kg，禁食不禁水。灌胃期間，供給小鼠食用河南省實驗中心提供的標準飼料，自由飲用純凈水。觀察記錄各組小鼠實驗前后的體重及精神狀態、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄等一般情況。造模16 h 后摘眼球取全血，3000 rpm 離心15 min，血清冷藏，待測。取血后，快速脫頸椎處死。剖腹取肝臟，測定每只小鼠的肝臟濕重。取肝右葉組織0.5g 左右，用冷生理鹽水沖洗，濾紙拭干，用生理鹽水制成10%肝組織勻漿，離心，取上清待測。同時取肝左外葉相同部位，固定于10%甲醛溶液中，經取材修塊，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理學變化。

2.3 生化指標的檢測

ALT、AST 活性測定采用賴氏法;MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法;SOD、GSH-Px活性測定分別采用亞硝酸鹽法和5，5-雙硫代對硝基苯甲酸(DTNB)顯色法。

2.4 組織病理學觀察

根據實驗各組肝細胞變性的不同程度，共分為4 級，擬定標準如下:0 級(-)，肝組織結構正常，無明顯變性，壞死及炎癥細胞浸潤;1 級(+)，肝小葉結構尚正常，可見氣球樣變或脂肪變性，散在點狀壞死;2 級(++)，肝小葉結構不清，可見明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細胞浸潤;3 級(+++)，肝小葉結構不清、可見明顯的片狀壞死，伴有區域性炎癥細胞浸潤。

2.5 統計學方法

應用SPSS17.0 統計軟件對實驗資料進行統計分析，所有統計數據均以表示;組間比較采用t 檢驗，等級資料進行秩和檢驗。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠的一般情況

連續觀察7 d，各組小鼠在造模前，除個別幾只雄鼠有掐咬現象，飲食、活動、精神狀態，皮毛、大小便等均無異常變化，造模后，大部分小鼠出現倦縮，豎毛懶動、稀樣便等異常情況出現。與正常組比較，實驗前后各組小鼠的體重無顯著性差異(P ＞0.05)，造模后，與正常組比較，模型組的小鼠肝臟系數值(小鼠肝臟濕重/處死前小鼠體重)顯著性增大(P ＜0.01)，禹州漏蘆醇提物的高中低劑量組肝臟系數均較模型組顯著降低(P ＜0.05)。結果見表1。

表1 實驗前后小鼠的體重變化及肝臟系數(x± s，n=10)Table 1 Changes of weight and liver coefficient of micebeforeand after experiment(，n=10)

表1 實驗前后小鼠的體重變化及肝臟系數(x± s，n=10)Table 1 Changes of weight and liver coefficient of micebeforeand after experiment(，n=10)

注:與正常組比較，##P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:##P ＜0.01 vs normal control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs liver injury model group.The same as follow.

3.2 禹州漏蘆醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALT、AST 的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 活性顯著升高(P ＜0.01)，顯示造模成功。與模型組比較，禹州漏蘆醇提取物各劑量組對小鼠血清中ALT、AST 含量均有不同程度的降低，具有顯著性差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。結果見表2。

表2 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠血清中AST 和ALT 的影響(x± s，n=10)Table 2 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsison serum ASTand ALT in liver injurymice(，n=10)

表2 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠血清中AST 和ALT 的影響(x± s，n=10)Table 2 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsison serum ASTand ALT in liver injurymice(，n=10)

3.3 禹州漏蘆醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px、MDA 的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px 活性顯著降低，MDA 水平顯著增加(P ＜0.05)，顯示造模成功。與模型組比較，禹州漏蘆醇提物各劑量組對小鼠肝組織中SOD、GSH-Px 活性顯著升高，MDA 水平顯著降低(P ＜0.05)。結果見表3。

表3 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝勻漿SOD、GSH-Px 和MDA 的影響(，n=10)Table 3 Effect of alcohol extract of Radix Echinopsis on the activity of SOD，GSH-Pxand MDA in livertissue of acute injury mice(，n=10)

表3 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝勻漿SOD、GSH-Px 和MDA 的影響(，n=10)Table 3 Effect of alcohol extract of Radix Echinopsis on the activity of SOD，GSH-Pxand MDA in livertissue of acute injury mice(，n=10)

3.4 禹州漏蘆醇提物對CCl4致急性肝損傷模型小鼠的肝組織病理形態學的影響

3.4.1 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響

通過對實驗各組小鼠肝細胞變性情況進行半定量分析，結果表明，空白組小鼠肝細胞無異常改變;模型組小鼠肝細胞變性程度嚴重，經Ridit 分析，與空白組比較有顯著的統計學意義(P ＜0.05);禹州漏蘆醇提物各劑量及陽性組小鼠肝細胞變性程度均有所改善，其中尤以陽性藥組，高、中劑量組效果最佳，與模型組比較有顯著的統計學意義(P ＜0.05)，且禹州漏蘆高中劑量組能夠顯著性的降低肝臟系數(P ＜0.05)，結果見表4。

表4 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響(，n=10)Table 4 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsis on the denaturation liver(，n=10)

表4 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響(，n=10)Table 4 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsis on the denaturation liver(，n=10)

3.4.2 禹州漏蘆醇提物對各組小鼠病理切片光鏡觀察

空白組小鼠肝臟的肝小葉結構正常，肝細胞索以中央靜脈為中心，成輻射狀排列，匯管區可見小葉間血管和膽管，肝細胞無變性、壞死等損傷性改變;模型組小鼠肝小葉結構紊亂，中央區肝細胞出現嚴重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細胞浸潤;陽性組小鼠肝小葉結構基本正常，但肝小葉中央區肝細胞排列紊亂，可見肝細胞水樣變性或脂肪變性，偶見壞死，伴炎癥細胞浸潤;禹州漏蘆醇提物給藥組小鼠肝小葉結構基本正常，與模型組比較，禹州漏蘆醇提取物不同程度地減少CCl4誘導肝損傷中肝細胞中的炎性細胞浸潤、水腫、變性、壞死等。切片結果見圖1。

圖1 禹州漏蘆醇提物對小鼠急性肝損傷的肝組織病理切片的光鏡觀察(HE 染色，×100)Fig.1 Light microscopic images of biopsies of liver tissues from different groups’acute liver injury mice

4 討論與結論

肝損傷是現代研究護肝藥物作用及作用機制常用病理模型。活體動物上應用CCl4復制急性肝損傷模型是一個經典方法［4］，其病理過程與肝毒物引起人體肝損傷的病理過程極其相似［5］。CCl4進入肝細胞后，經肝微粒體細胞色素P450 激活，生成自由基(·CCl3等)，繼而引起生物膜脂質過氧化反應，導致肝脂肪變和肝壞死［6］。而且當肝細胞膜因脂質過氧化反應而結構破壞、功能受損時，細胞內的ALT、AST 等會釋放到血液中，從而血清中ALT、AST的活性檢測可以評價肝臟損傷的程度和藥物治療肝損傷的效果［7，8］。自由基是人體正常生物化學過程中的中間產物，在機體正常及病理過程中均存在，同時機體中亦存在可滅活氧自由基的酶，如SOD、GSH-Px 等，SOD 的含量水平可作為衡量機體抗氧化能力的標準;GSH-Px 能夠特異地催化還原性GSH對過氧化氫的還原反應，從而起到保護細胞膜結構與功能的完整作用。MDA 可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、破裂及壞死。因此，ALT、AST、MDA含量和GSH-Px、SOD 活性間接反映了肝細胞受自由基攻擊后損傷的程度，它們的變化可以作為自由基致肝細胞損傷的一種靈敏可靠的診斷性指標及預后療效的觀察;同時肝臟活檢能夠直觀的顯示肝臟實質性損害、炎癥活動及纖維化。

CCL4是毒性化學制劑，其誘導的肝損傷模型能準確反映肝細胞功能、代謝及形態學變化，經濟且重復性好。但CCL4同時也會損傷動物的心、脾、肺、腎、腦等器官;另外，蒸汽和液體可由呼吸道、皮膚吸收，對人體有一定的毒性，故在配置CCL4油溶液及腹腔注射造模的時候一定要謹慎操作。

本課題采用經典的化學性肝損傷動物模型［9］，從生化指標顯示，本實驗模型組的AST、ALT 活性，MDA 含量升高明顯高于空白組，同時GSH-Px、SOD活性降低;表明造肝細胞損傷模型成功。與模型組比較，禹州漏蘆各劑量組能夠顯著性的抑制AST、ALT、MDA 含量的升高，增強GSH-Px、SOD 活性;結合肝臟組織病理學觀察，各組的生化指標的數值與病理切片結果相符，均可顯示禹州漏蘆醇提物能夠減輕肝細胞變性、炎癥浸潤及壞死的病變，并促進肝細胞的再生及修復，抑制肝損傷敏感酶的升高，提高機體清除氧自由基能力并抑制肝損傷。實驗證明:禹州漏蘆藥材具有保護CCl4所致小鼠急性肝損傷的作用及其保肝作用與其清除氧自由基，抗脂質過氧化損傷密切相關。對于禹州漏蘆藥材的保肝活性部位、藥效物質基礎及其他作用機制，有待以后進一步研究。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I:244.

2 Wang Y(汪毅)，Li X(李銑)，Zhang P(張鵬).research advance of chemical composition andpharmacological activities on Radix Echinopsis.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2005，36:309-311.

3 Wang Y(汪毅)，Li X(李銑)，Meng D(孟大利)，et al.Chemical constituents of thiophenes from Echinopslatifolius Tausch.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2008，25:194-196.

4 Liu JW(劉建文).Pharmacological experiment methodology-New technology and new methods，Volume 2(藥理實驗方法學—新技術與新方法，第2 版).Beijing:Chemical Industry Press，2008.206.

5 Kang WY(康文藝)，Huang H(黃嬛)，Lian TT(廉婷婷)，et al.Protective effect of Dendranthemamorifolium on CCl4-induced liver injury in mice.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:1634-1636.

6 Yang LF(楊龍飛)，Jin JX(金家興)，Gao WX(高文秀)，et al.The protective effect of liver purgeextractum on the model of experimental liver injury in rats.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2006，12(6):41-42.

7 Ozer J，Ratner M，Shaw M，et al.The current state of serum biomarkers of hepatotoxicity.Toxicol，2008，245:194-205.

8 Gao XC(高緒聰)，Chai ZH(柴振海)，Zhang ZP(張宗鵬).Progress in biomarkers and evaluation of drug-induced liver injury.Chin J Pharm Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2012，26:692-696.

9 Guo JJ(郭菁菁)，Yang XF(楊秀芬).Research progress of the protective effect of flavanoids on experimental liver injury of animals.Chin Pharm Bull(中國藥理學通報)，2008，24:5-10.

10 Lin WH(林偉華)，Chen HY(陳華英).The diagnostic value of ALT，AST，GGT，CHE in liver disease.J Mod Clin Med Bioeng(現代臨床醫學生物工程學雜志)，2005，11:232-233.