老熟蓮子殼多酚的樹脂法純化及穩定性研究

馬雙雙，劉 瑩，陳中惠，黃 文，王 益

華中農業大學食品科技學院，武漢 430070

蓮子殼(Lotus seed epicarp)是睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera，Gaertn.)種子的殼。蓮子殼在自然成熟過程中伴隨著由綠到褐、由軟到硬的變化，新鮮蓮子殼呈鮮綠色，質地軟，老熟蓮子殼呈紅褐色，質地堅硬，老熟蓮子殼是湘蓮加工副產物，資源豐富，但未被充分利用。近年來，蓮子殼活性成分的研究逐漸引起學者的重視。已有文獻報道新鮮蓮子殼富含單寧、黃酮、原花青素等多酚類化合物［1，2］;Chen 通過HPLC-DAD-ESI-MSn從新鮮蓮子殼中鑒定出17 種黃酮類物質［3］;新鮮蓮子殼提取物具有抑制脂肪細胞分裂［4］、抗黑色素瘤［2］、抗氧化［5］等功能。但是，新鮮蓮子殼不易獲得且不易存放，所以本研究以老熟蓮子殼為原料，通過靜態吸附與解吸實驗篩選出適合蓮子殼多酚吸附分離的大孔樹脂，通過動態吸附與解吸實驗確定蓮子殼多酚純化的工藝參數，并研究光、溫度、pH、金屬離子對蓮子殼多酚穩定性的影響，以期提高蓮子殼的利用率，為后期產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

湘蓮蓮子殼(老熟)，收集于武漢市洪湖;AB-8，天津南開化工廠;DM10、DM21、DM130，山東魯抗立科藥物化學有限公司;HPD-100、D101，滄州寶恩吸附材料科技有限公司;一水合沒食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、無水乙醇、檸檬酸、磷酸二氫鉀、溴水，國藥集團化學試劑有限公司;所有試劑均為分析純。

HH-S4 型數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司;BETA 2-8 LD plus 型凍干機，德國MARTIN CHRIST 公司;RE-2000A 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;UV-1700 型紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蓮子殼多酚提取流程

蓮子殼→粉碎→過100 目篩→乙醇熱回流提取→抽濾→真空濃縮→真空冷凍干燥→蓮子殼多酚粗提物。

1.2.2 多酚含量的測定

以一水合沒食子酸為標準品，采用Folin-Ciocalteus 法［6］測定多酚含量，多酚含量用質量濃度(mg/mL)表示。

1.2.3 大孔樹脂的預處理

大孔樹脂用95%的乙醇在室溫下密封浸泡24 h，蒸餾水沖洗至無白色渾濁，然后加入5%NaOH 溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性，再用5%HCL 溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性，三次酸堿處理后備用。

1.2.4 大孔樹脂的篩選

1.2.4.1 大孔樹脂靜態吸附曲線的繪制

準確稱取經過預處理且用濾紙吸干表面水分的樹脂各5 g ± 0.01 g，分別置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入相同濃度的蓮子殼多酚粗提液50 mL，避光密封，置于恒溫振蕩器中充分吸附8 h(25 ℃，120 rpm)，每隔1 h 從上清液中取樣，測定上清液中蓮子殼多酚的含量，計算吸附率，繪制不同樹脂的靜態吸附曲線［7］。

吸附率A(%)=［(C0-Ci)/C0］× 100%

式中:A 為吸附率，%;C0為粗提液中多酚的起始濃度，mg/mL;Ci為吸附第i 小時后粗提液中多酚的濃度，mg/mL。

1.2.4.2 大孔樹脂的靜態解吸曲線的繪制

將充分吸附的樹脂濾出，用濾紙吸干表面殘余樣液，分別置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%的乙醇溶液，避光密封，置于恒溫振蕩器中解吸3 h(25 ℃，120 rpm)，每隔0.5 h 從解吸液中取樣，測定解吸液中多酚的含量，計算解吸率，繪制不同樹脂的靜態解吸曲線。

解吸率D(%)=［Cj/(C0-Ce)］× 100%

式中:D 為洗脫率，%;Cj為解吸第j 小時解吸液中多酚濃度，mg/mL;C0為粗提液中多酚的起始濃度，mg/mL;Ce為吸附平衡時粗提液中多酚的濃度，mg/mL。

1.2.5 AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的動態吸附和解吸

1.2.5.1 AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的動態吸附

取經過預處理的AB-8 樹脂40 mL，濕法裝住，不同濃度的蓮子殼多酚粗提液以不同流速上柱，分管收集流出液并檢測多酚含量，當流出液中多酚濃度是上樣濃度的1/10 時，停止上樣，計算吸附量，考察上樣濃度、上樣速度對蓮子殼多酚吸附效果的影響。

動態吸附量Q(mg/mL)=［(C0-C)×V］/W

式中:C0:蓮子殼多酚粗提液的起始濃度，mg/mL;C:流出液中多酚的濃度，mg/mL;V:流出液總體積，mL;W:樹脂體積，mL。

1.2.5.2 AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的動態解吸

以最適的樣液濃度、速度上樣，蒸餾水洗脫除去大分子雜質后，分別用不同濃度的乙醇以不同速度進行解吸，分管收集洗脫液，測定洗脫液中多酚含量，計算解吸率，考察乙醇濃度、洗脫速度、洗脫體積對蓮子殼多酚解吸效果的影響［8］。

動態解吸率(%)=［(C×V)/(Q×W)］×100%

式中，C:洗脫液中蓮子殼多酚濃度，mg/mL;V:洗脫總體積，mL;Q:動態吸附量，mg/mL;W:樹脂體積，mL。

1.2.6 蓮子殼多酚穩定性的研究

利用最佳的純化工藝獲得的蓮子殼多酚解吸液，經旋轉蒸發、冷凍干燥后得蓮子殼多酚粉末。配制蓮子殼多酚樣液，考察光照、溫度、pH 和金屬離子對其穩定性的影響［9］。光照、溫度和pH 對蓮子殼多酚穩定性的影響通過處理前后多酚含量的變化來表示，金屬離子對蓮子殼多酚穩定性的影響通過處理前后樣液在280 nm 處吸光值的變化來表示。

多酚保存率(%)=ρ1/ρ0×100%

式中，ρ0為處理前多酚濃度，μg/mL;ρ1為處理后多酚濃度，μg/mL。

吸光值的變化=ODi-OD0

式中，OD0為樣液初始時候的吸光值;ODi 為樣液放置第i 小時的吸光值。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 不同樹脂的靜態吸附性能比較

大孔吸附樹脂是以吸附性和篩選性原理相結合的一種表面吸附劑。其吸附能力的大小與樹脂的極性、比表面積、孔徑、孔容、能否與被吸附物形成氫鍵等因素有關。本實驗所選擇的DM10、AB-8、HPD-100、DM21、DM130、D101 樹脂的靜態吸附過程如圖1 所示。

圖1 不同樹脂的靜態吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of different resins

由圖1 可知，不同樹脂具有不同的靜態吸附特征，吸附速率均隨吸附時間的延長逐漸減小。0～4 h，樹脂的靜態吸附率隨吸附時間的延長而增大，4 h后，吸附趨于飽和。DM10、AB-8、HPD-100、DM21、DM130、D101 樹脂的靜態飽和吸附率分別為73.6%、71.7%、70.1%、67.4%、65.4%、56.1%。DM10、AB-8、HPD-100 的吸附效果較好，吸附率均達到70%。

2.1.2 大孔樹脂的靜態解吸性能比較

DM10、AB-8、HPD-100、DM21、DM130、D101 樹脂的靜態解吸過程如圖2 所示。

圖2 不同樹脂的靜態解吸曲線Fig.2 Static desorption curve of different resins

由圖2 可知，6 種樹脂的解吸率存在先增加后平衡的趨勢，在1.5 h 均能完全解吸。此時，AB-8、DM130、HPD-100、DM10、D101、DM21 樹脂的靜態解吸率依次為88.8%、86.5%、82.5%、82.3%、72.7%、65.3%。AB-8、DM130 解吸效果相對較好，DM21、D101 樹脂的解吸率明顯低于另外4 種樹脂，不適合于蓮子殼多酚的純化。

靜態吸附和解吸實驗表明，雖然AB-8 樹脂的靜態吸附率略低于DM10，但其解吸率最大，綜合考慮樹脂的靜態吸附和解吸能力，得出AB-8 樹脂對蓮子殼多酚具有較強的選擇性，且易回收，最適合于蓮子殼多酚分離純化。

2.2 AB-8 樹脂的動態吸附和解吸實驗

2.2.1 上樣濃度對吸附量的影響

調節上樣速度0.5 mL/min，測定不同上樣濃度條件下AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的吸附量，結果如圖3 所示。

圖3 上樣濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of concentration of LSEPPs on adsorption capacity

由圖3 可知，隨著上樣濃度的增加，AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的吸附量呈現先增加后減少的趨勢。當樣液濃度為1.5 mg/mL 時，AB-8 樹脂的吸附量僅為6.1 mg/mL;當樣液濃度提高到4.5 mg/mL 時，AB-8 樹脂的吸附量為10.47 mg/mL。這是因為當樣液濃度較低時，隨樣液濃度的增加，可吸附物質的量增加，因此，AB-8 樹脂的吸附量逐漸增加。但是，隨著樣液濃度的繼續增大，與多酚競爭吸附的雜質量增加，在流速一定的條件下，蓮子殼多酚在AB-8樹脂內部擴散能力下降，從而導致樹脂吸附量有所下降。因此，上樣濃度選擇4.5 mg/mL。

2.2.2 上樣速度對吸附量的影響

調節上樣濃度4.5 mg/mL，測定不同上樣速度條件下AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的吸附量，結果如圖4 所示。

圖4 上樣速度對吸附量的影響Fig.4 Effect of feeding rate on adsorption capacity

由圖4 可知，隨著上樣速度的增大，AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的吸附量逐漸減少。當上樣速度由0.25 mL/min 增大到2 mL/min 時，吸附量由12.57 mg/mL 降低到6.59 mg/mL。這是因為上樣速度增大的過程中，多酚類物質未來得及在樹脂上充分吸附便流出樹脂柱。雖然，較低的流速有利于充分吸附，但是，流速過低會延長工作時間，降低工作效率。當上樣速度為0.25 mL/min 時，吸附量為12.57 mg/mL，當上樣速度為0.5 mL/min 時，吸附量為12.30 mg/mL。從提高生產效率角度考慮，選擇0.5 mg/mL 的速度進行上樣吸附。

2.2.3 乙醇濃度對解吸效果的影響

調節上樣濃度4.5 mg/mL、上樣速度0.5 mL/min、洗脫速度2 mL/min、洗脫體積4 BV，測定不同乙醇濃度條件下AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的解吸率，結果如圖5 所示。

圖5 乙醇濃度對解吸效果的影響Fig.5 Effect of concentration of ethanol on desorption rate

由圖5 可知，當乙醇濃度小于50%時，蓮子殼多酚在AB-8 樹脂上的解吸率逐漸增大，繼續增大乙醇濃度，解吸率無明顯變化。因為不同濃度的乙醇具有不同的極性，具有不同的洗脫能力。因此，選擇50% 的乙醇做為洗脫劑，此條件下，解吸率為81.21%。

2.2.4 洗脫速度對解吸效果的影響

圖6 洗脫速度對解吸效果的影響Fig.6 Effect of elution speed on desorption rate

調節上樣濃度4.5 mg/mL、上樣速度0.5 mL/min、乙醇濃度50%、洗脫體積4BV，測定不同洗脫速度條件下AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的解吸率，結果如圖6 所示。

由圖6 可知，AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的解吸率與洗脫速度存在反比例關系。當洗脫流速由0.5 mL/min 增大到4 mL/min 時，解吸率由82.23% 降為68.05%。因為洗脫流速增大，洗脫劑未來得及與吸附在樹脂上的多酚充分接觸，使其不能將多酚從吸附位點上完全置換出來。選擇合適的洗脫流速對于洗脫效果和工業生產效率的提高均有一定的影響。當洗脫流速從0.5 mL/min 增大到2 mL/min時，解吸率變化不大，因此，選擇2 mL/min 的流速進行洗脫。

2.2.5 洗脫體積對解吸效果的影響

調節上樣濃度4.5 mg/mL、上樣速度0.5 mL/min、乙醇濃度50%、洗脫速度2 mL/min，測定不同洗脫體積條件下AB-8 樹脂對蓮子殼多酚的解吸率，結果如圖7 所示。

圖7 洗脫體積對解吸效果的影響Fig.7 Effect of elution volume on desorption rate

由圖7 可知，1～4 BV，乙醇對蓮子殼多酚的洗脫能力存在劑量效應關系，1 BV 時，解吸率僅有30.98%，4 BV 時，解吸趨于平衡，解吸率達到82.72%，繼續增大乙醇用量，解吸率無明顯增加。從節約成本考慮，選擇洗脫劑體積為4 BV。

2.3 蓮子殼多酚穩定性的研究

2.3.1 光照對蓮子殼多酚穩定性的影響

將蓮子殼多酚樣液分裝于透光性良好的具塞試管中，試管平均分成3 組，第1 組置于室外，進行陽光直射;第2 組置于室內，避免陽光直射;第三組置于黑暗處，避免與光源接觸。每隔1 d 分別測定3組試管中的多酚含量，連續測定8 d，結果如圖8 所示。

圖8 光照對蓮子殼多酚穩定性的影響Fig.8 Effect of light on stability of LSEPPs

由圖8 可知，蓮子殼多酚對光較敏感。在避光、室內光、室外陽光直射條件下，隨著放置時間的延長，多酚含量均呈下降趨勢且下降程度依次增大。同時，樣液顏色隨放置時間的延長發生不同程度的變化，避光處理條件下無明顯變化，室內光和室外陽光直射條件下的樣液顏色逐漸變紅，且后者變紅更加明顯。第8 d 時，避光、室內光、室外陽光直射條件下的多酚保存率分別為91.00%、81.13%、62.67%。由此可見，蓮子殼多酚在生產和加工過程中應減少與光源的接觸。

2.3.2 溫度對蓮子殼多酚穩定性的影響

將蓮子殼多酚樣液分裝于透光性良好的具塞試管中，試管平均分成5 組，分別放到4、25、37、50、75、100 ℃恒溫水浴鍋中。每隔2 h 分別測定5 組試管中的多酚含量，連續測定10 h，結果如圖9(a)和9(b)所示。

圖9 (a) 溫度對蓮子殼多酚穩定性的影響Fig.9 (a) Effect of temperature on stability of LSEPPs

圖9 (b) 不同溫度處理10 h 后蓮子殼多酚的保存率Fig.9 (b) Preserving rate of LSEPPs at different temperature after staying 10 h

由圖9(a)和9(b)可知，溫度對蓮子殼多酚的穩定性具有顯著影響。在不同溫度條件下，隨著加熱時間的延長，多酚含量均有不同程度的降低。保溫10 h 后，4、25、37、50、75、100 ℃條件下的多酚保存率依次為98.3%、96.4%、92.9%、83.6%、71.5%、50.2%。由此可見，隨著溫度的升高，多酚的熱降解速度增大;當溫度超過50 ℃時，降解速度明顯加快，100 ℃條件下加熱10 h 后，保存率僅剩一半。因此，多酚熱穩定性差，低溫更有利于其保存。

2.3.3 pH 對蓮子殼多酚穩定性的影響

分別配制pH 為2、4、6、8、10 的緩沖溶液，加入等量的蓮子殼多酚粉末，充分溶解后置于37 ℃恒溫水浴鍋中，保溫2 h 后測定多酚含量，結果如圖10所示。

圖10 pH 對蓮子殼多酚穩定性的影響Fig.10 Effect of pH on stability of LSEPPs

由圖10 可知，當溶液pH 在2.0～6.0 范圍內，多酚含量變化不大，且pH 為4.0 時多酚含量最高;當溶液pH 呈堿性時，多酚含量顯著下降，堿性越強，多酚破壞程度越大。樣液顏色亦隨著pH 的增大而加深，pH 為10.0 時，樣液呈橘紅色。由此可見，蓮子殼多酚在弱酸性條件下比較穩定，對于多酚及其產品的使用和加工應在弱酸條件下進行。

2.3.4 金屬離子對蓮子殼多酚穩定性的影響

分別配制濃度為0.05 mg/mL 的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ba2+、Sn2+溶液，加入等量的蓮子殼多酚粉末，振蕩溶解后，置于37 ℃恒溫水浴鍋中，每隔1 h 測定不同離子樣液(上清液)在280 nm 處的吸光值，連續測定4 h，結果如圖11 所示。

圖11 金屬離子對蓮子殼多酚穩定性的影響Fig.11 Effect of metal ions on stability of LSEPPs

由圖11 可知，隨著放置時間的延長，含有不同金屬離子的多酚樣液的吸光值和顏色發生不同程度的變化。K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Ba2+、Zn2+這6 種離子存在時，多酚樣液的吸光值和顏色與空白組無差異，因此，對多酚的穩定性無影響。Sn2+對蓮子殼多酚的影響最為顯著，Sn2+加入后，溶液立即變渾濁，有黃色絮狀沉淀產生，且隨放置時間延長沉淀量增加;Fe3+加入后，多酚樣液由淺黃色變成藍黑色，并出現少量墨綠色絮狀沉淀;Fe2+加入后，多酚溶液由淺黃色變為藍黑色，無肉眼可見沉淀產生;Al3+加入后樣液黃色加深，同時出現少量淺黃色絮狀沉淀;Pb2+加入后，溶液變渾濁，并產生少量淺黃色絮狀沉淀;Cu2+加入后，樣液黃色加深，無沉淀產生。由此可見，Fe2+、Fe3+、Al3+、Sn2+、Pb2+、Cu2+、Pb2+離子對蓮子殼多酚具有明顯的破壞作用，在多酚的制備、保存和使用中，應盡量避免與這6 種離子接觸。

3 結論

通 過 AB-8、HPD-100、D101、DM10、DM21、DM130 這6 種樹脂的靜態吸附和解吸動力學實驗確定AB-8 樹脂吸附量大且易解吸，是蓮子殼多酚分離純化的最佳樹脂。通過AB-8 樹脂的動態吸附和解吸實驗確定蓮子殼多酚純化的工藝參數為:上樣濃度4.5 mg/mL，上樣速度0.5 mL/min，洗脫劑乙醇濃度50%，洗脫流速2 mL/min，洗脫體積4BV，該條件下，蓮子殼多酚純度可達69.34%。此工藝條件既充分利用了柱材料又達到了理想的分離效果。穩定性實驗結果表明:蓮子殼多酚在光照、高溫和堿性環境中易破壞，光照越強，溫度越高，堿性越強，破壞程度越大。不同金屬離子對蓮子殼多酚穩定性影響不同，Fe2+、Fe3+、Al3+、Sn2+、Cu2+、Pb2+這6 種離子對蓮子殼多酚具有顯著的破壞作用，K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ba2+這6 種離子無影響。因此，蓮子殼多酚的開發利用應在避光、低溫、弱酸環境中進行，并應避免與錫、鐵、鋁、銅等器皿的接觸，降低環境中鉛的含量。

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