藥用植物內生菌對青藤堿的微生物轉化篩選

劉發貴，潘 燁，鄧艾平，羅 丹，楊 進，郭志勇，鄧張雙

三峽大學 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

青藤堿(Sinomenine)是一種天然嗎啡烷類生物堿，擁有抗炎、免疫調節、鎮痛、抗腫瘤、降血壓、促組胺釋放、神經保護等多種藥理活性，臨床用于類風濕性關節炎的輔助治療［1］。但是，青藤堿分子結構對光、熱、堿不穩定，且生物利用度低，易引起腸胃不適等副作用，限制了青藤堿作為抗炎藥物的應用［2］。為了克服這些缺陷，國內外學者對青藤堿分子進行了化學結構修飾，卻很少發現抗炎活性突出的青藤堿衍生物［3］。生物轉化反應具有反應條件溫和、反應產物立體選擇性好、較易獲得結構新穎的化合物等特點;同時符合生物體代謝規律，發現具有生理活性的代謝產物幾率高［4］。

關于青藤堿的生物轉化研究國內外報道較少。陳磊［5］報道了真菌Cunninghamella M2 轉化青藤堿為羥基青藤堿，但是沒有給出轉化產物的結構式。課題組在前期研究過程中，發現真菌Antrodiella semisupina 能催化青藤堿和愈創木酚形成碳碳和碳氧交叉偶聯產物1 和2［6］，且能選擇性的催化青藤堿及類似物轉化為(S)-雙青藤堿類結構3 和4［6-8］。Joyeau Roger 等［9］人發現青藤堿衍生物O-benzyl-sinomenine 能被真菌Mucor plumbeus ATCC 4740 轉化成去氮甲基產物5 和氮氧化物6 兩種轉化產物。課題組借鑒前期研究經驗，繼續研究青藤堿的微生物轉化反應及轉化產物，本文以藥用植物內生菌為研究載體，建立青藤堿的微生物轉化篩選模型，研究青藤堿與內生菌共培養以后的代謝產物，以期發現具有高效抗炎效果或者結構新穎的青藤堿衍生物。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

青藤堿鹽酸鹽:購自成都鉅龍天然藥業生命科技有限公司，經HPLC 分析，純度≥97.0%。GF254薄層層析硅膠板(20 mm × 20 mm，0.25 mm)和正相硅膠(300～400 目)均購自青島海洋化學有限公司。薄層層析條件:CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外顯色。分析試劑均為色譜純，常規試劑均為分析純。

圖1 青藤堿微生物轉化產物Fig.1 Chemical structures of sinomenine and its biotransformed products

1.2 儀器

1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC 和HMBC 譜由Bruker Avance III-400 核磁共振儀測得，溶劑為CDCl3，內標為四甲基硅烷(Tetramethylsilane，TMS)，化學位移記為δ(ppm);化合物分子量由液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質譜儀(儀器型號為AmozonSL+1200，布魯克.道爾頓公司)測得;微生物培養在恒溫搖床HQD150LB(武漢海聲達儀器設備有限公司)上進行。

2 實驗方法

2.1 植物組織

采自湖北省神龍架林區，分別為青風藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夾竹桃(Nerium oleander)、朵 云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)，由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室楊進副教授鑒定。

2.2 斜面培養基(SPM)

將200 g 去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加入瓊脂30 g，煮沸，加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量維生素B1，調節pH 至6.0，定容至1 L，用試管分裝(約10 mL/1 支試管)，在121 ℃下滅菌20 min。

2.3 微生物轉化培養基(SPM)

將200 g 去皮土豆切成小塊，加適量水煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，微量維生素B1，調節pH 至6.0，定容至1 L，用250 mL 錐形瓶分裝(約100 mL/1 個錐形瓶)，在121 ℃下滅菌20 min。

2.4 菌株分離

取部分植物組織放入75%左右的酒精溶液(含少量抗生素)中蕩洗，接入含抗生素的PDA 平板中，倒置培養，觀察并做好記錄，待菌落開始萌發時，將單個菌落轉入PDA 平板上繼續培養、分離純化，并進行斜面保種。

2.5 轉化菌株篩選

活化7 d 的斜面菌種，轉接到100 mL 發酵培養基中，恒溫振蕩器上培養4 d(25 ℃，150 rpm)，利用無菌濾膜加入青藤堿鹽酸鹽水溶液1 mL(20 mg/mL)，同樣條件下繼續培養4 d，停止培養。將發酵液過濾，濾液用NH3·H2O 調節pH 值至10.0，接著用CH2Cl2萃取(100 mL × 3)，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉蒸干溶劑，得固體粉末。用少量CHCl3溶解，在GF254薄層層析硅膠板上以一定間距點樣，展開劑為CHCl3-CH3OH(9∶1，V/V)，254 nm 紫外燈下檢測，觀察紫色斑點位置及大小，確定是否存在轉化。同樣條件下，分別以培養過程中不添加青藤堿和不接入菌種作為空白對照。

2.6 轉化產物的制備

活化7 d 的斜面菌種，轉接到200 mL 的發酵培養基(SPM)中，恒溫振蕩器上培養4 d(25 ℃，150 rpm)，利用無菌濾膜加入青藤堿鹽酸鹽水溶液1 mL(20 mg/mL)，同樣條件下繼續培養4d，停止培養。將發酵液過濾，濾液用NH3·H2O 調節pH 值至10.0，接著用CH2Cl2萃取(200 mL × 3 × 10)，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉蒸干溶劑，得固體粉末。經硅膠層析柱、HPLC 半制備柱分離，得轉化產物。

3 結果與分析

3.1 青藤堿生物轉化菌株的篩選

從青風藤［Sinomenium acutum(Thunb)Rehd.et Wils.］、夾竹桃(Nerium oleander)、朵云(Botrychium daucifoltum Woll)、蛇菰(Balanophora japonica)四種植物組織中利用傳統的劃線分離方法共分得植物內生菌84 株，保藏在天然產物研究與利用湖北省重點實驗室微生物菌種庫，暫未做鑒定。采用PDY 液體發酵方式，將青藤堿與84 株菌株分別進行共培養，篩選出7 株具有青藤堿轉化能力的微生物菌株，菌株編號分別為JZT01、JZT11、DY10、SD04、SD06、BY09、Q08。其轉化產物經薄層色譜分析(圖2)，7株菌株在青藤堿轉化能力上大致分為四種類型:(1)菌株Q08 具有完全轉化青藤堿的能力，且轉化產物單一，經TLC 分析初步鑒定為(S)-disinomenine;(2)菌株JZT11 和DY10 具有完全降解青藤堿的能力，青藤堿被代謝成小分子后可能作為碳、氮源被微生物生長所消耗;(3)菌株SD06、SD04 和BY09 具有部分轉化青藤堿的能力。這三株菌株與青藤堿共培養4 d 后，青藤堿并未完全轉化成代謝產物，經TLC 分析，初步鑒定轉化產物均為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，其中(S)-disinomenine 為主要產物;(4)菌株JZT01 具有較弱的青藤堿轉化能力，經TLC 分析，轉化產物非(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，可能是一種具有新結構的代謝產物。但是，該菌株代謝青藤堿的酶活較低，如何通過代謝調控提高酶活力，從而加速青藤堿的轉化速度，將是課題組后續努力方向之一。

3.2 青藤堿生物轉化產物的分離與結構鑒定

圖2 青藤堿轉化產物薄層色譜(TLC)分析Fig.2 TLC analysis of sinomenine and its metabolites

為了進一步確認菌株SD06、SD04 和BY09 轉化青藤堿的產物為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine，選取菌株SD04 進行放大培養，加入青藤堿鹽酸鹽總計530 mg，共獲得轉化產物粗提物600 mg，經硅膠層析柱吸附，CH2Cl2-CH3OH(9∶1，V/V)淋洗，得轉化產物S1(250 mg，產率50%，按青藤堿加入量計算)，轉化產物S2(100 mg，產率20%，按青藤堿加入量計算)。對菌株SD04 與青藤堿共培養的轉化產物經過系統分離及NMR 鑒定，確定青藤堿被真菌SD04 轉化為兩種代謝產物S1 和S2，分別為(S)-disinomenine 和(R)-disinomenine。

化合物S11H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.27(s，1H)，6.26(brs，1H)，5.45(d，J=1.7 Hz，1H)，4.41(d，J=15.5 Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.52(s，3H)，3.09(t，J=4.0 Hz，1H)，3.06(brs，1H)，2.56(dd，J=2.6，11.8 Hz，1H)，2.49(d，J=15.6 Hz，1H)，2.43(dd，J=5.4，18.8 Hz，1H)，2.34(s，3H)，2.33(d，J=18.8 Hz，1H)，2.19(td，J=2.8，11.9 Hz，1H)，2.03(d，J=12.3 Hz，1H)，1.93(dd，J=4.4，12.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.9，152.4，144.8，143.7，130.5，127.7，123.2，115.0，110.6，56.2，55.9，54.7，49.2，47.1，45.7，42.9，40.8，35.8，23.8;ESI-MS m/z 657［M +H］+。NMR 數據與文獻［6］對照，鑒定化合物S1 為(S)-disinomenine。

化合物S21H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.44(s，1H)，5.30(brs，1H)，4.43(d，J=15.7 Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.52(s，3H)，3.02-2.94(m，2H)，2.60-2.42(m，3H)，2.30(s，3H)，2.12-1.96(m，2H)，1.90(td，J=4.2，12.4 Hz，1H)，1.77(dd，J=5.0，18.8 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.8，152.3，145.0，143.9，130.8，128.0，123.1，114.7，109.4，56.2，56.0，54.3，49.1，47.2，45.5，43.0，40.6，35.6，22.5;ESI-MS m/z 657［M+H］+。NMR 數據與文獻［6，7］對照，鑒定化合物S2 為(R)-disinomenine。

菌株JZT01 與青藤堿共培養(0.15 mg/mL)5 d后得發酵液4 L，經調堿、萃取得浸膏200 mg，硅膠層析柱分離得轉化產物S3(5 mg，產率0.8%，按青藤堿加入量計算)。

化合物S3 淡黃色，無定型粉末，分子式為C19H23NO5，分子量與青藤堿相比，增加16。化合物1H NMR 顯示化合物S3 含有22 個質子信號(未見苯環羥基質子信號)，包括2 個偶聯的芳基質子信號δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)和δ 6.54(d，J=8.4 Hz，1H);1 個烯烴質子信號δ 5.38(d，J=2.0 Hz，1H);2 個甲氧基質子信號δ 3.83 (s，3H)和δ 3.49(s，3H);1 個氮甲基質子信號δ 3.290(s，3H);聯合質子偶聯常數及HMQC 譜可分辨4 個亞甲基質子信號δ 1.86(d，J=13.2 Hz，1H)和δ 2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，δ 2.60(d，J=15.2 Hz，1H)和δ 4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，δ 2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)和δ 3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，δ 3.06(d，J=19.2 Hz，1H)和δ 3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H);2 個次甲基質子信號δ 4.39(brs，1H)和δ 3.67(t，J=4.4 Hz，1H)。13C NMR 顯示化合物S3 含有19 個碳信號，包括2 個苯環烯碳信號δ 118.5 和δ 113.1;1 個烯碳信號δ 109.9;2 個次甲基碳信號δ 73.4 和δ 38.9;3 個甲基碳信號δ 58.2、56.2 和55.0;4 個亞甲基碳信號δ 61.3、47.7、31.6 和29.1;7 個季碳信號。與青藤堿分子NMR 譜圖相比，可見9、14、16 和17 位的質子信號和碳信號明顯移向低場，其他碳氫信號與青藤堿基本一致，說明在這4 個位置的中心碳原子上插入了雜原子。結合上面數據分析，可以推測在基團NCH3的氮原子上插入了氧原子，形成了N 氧化物。NMR 數據與文獻［10］對照，鑒定化合物S3 為sinomenine N-oxide。

化合物S31H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 6.70(d，J=8.4 Hz，1H)，6.54(d，J=8.4 Hz，1H)，5.38(d，J=2.0 Hz，1H)，4.39(brs，1H)，4.37(d，J=15.2 Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.67(t，J=4.4 Hz，1H)，3.49(s，3H)，3.293(dd，J=5.6，19.2 Hz，1H)，3.290(s，3H)，3.12(dt，J=2.0，12.4 Hz，1H)，3.06(d，J=19.2 Hz，1H)，2.89(td，J=3.2，12.4 Hz，1H)，2.67(dd，J=4.4，13.2 Hz，1H)，2.60(d，J=15.2 Hz，1H)，1.86(d，J=13.2 Hz，1H);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:193.0，152.7，146.0，145.2，125.4，121.2，118.5，113.1，109.9，73.4，61.3，58.2，56.2，55.0，47.7，39.4，38.9，31.6，29.1;ESI-MS m/z 345.9［M +H］+。

4 結論

本文建立了藥用植物內生菌對青藤堿的生物轉化模型，利用薄層色譜(TLC)及NMR 技術對轉化產物進行了結構確認，為(S)-disinomenine、(R)-disinomenine 和sinomenine N-oxide。所得微生物對青藤堿的轉化多以雙青藤堿為唯一類型的轉化產物，這可能與青藤堿的剛性結構及4 位羥基有關。青藤堿的剛性結構可能阻礙了與微生物酶的結合，而青藤堿4 位羥基易被微生物體內的氧化酶氧化形成偶聯產物，雙青藤堿的形成進一步加劇底物與酶的結合位阻，多方面的原因導致轉化產物結構類型單一。為了獲得結構豐富的微生物轉化產物，在共培養過程中，加入氧化酶抑制劑或者改變底物結構(如保護青藤堿4 位羥基)將是我們以后的研究方向。Sinomenine N-oxide 首次報道見于2005 年秦國偉教授等人從植物Sinomenium acutum 中分離得到，青藤堿在H2O2存在的條件下，也會發生氧化反應生成該化合物［10］。課題組在前期的研究過程中，發現鄰苯二胺能誘導真菌Antrodiella semisupina 轉化青藤堿為Sinomenine N-oxide，其生成機制不明確［11］。本文發現了一種真菌與青藤堿共培養，在無任何誘導劑存在的情況下，可以直接氧化青藤堿為Sinomenine N-oxide，可為氮氧化物合成酶及類似酶促反應提供一定參考價值。

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