體外添加不同水平的亞麻籽油對氣體產(chǎn)量、瘤胃發(fā)酵及脂肪酸組分的影響

吳端欽，賀志雄，湯少勛，譚支良*

1中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125;2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

在反芻動物瘤胃代謝過程中，反芻動物在能量代謝過程中，因甲烷形式損失的能量占飼料總能(GE)的2%～12%。家養(yǎng)反芻動物每年往大氣中排放約80 Tg 甲烷，占到跟人類活動有關(guān)排放甲烷量的22%。因此，通過飼糧營養(yǎng)調(diào)控來減少反芻動物甲烷的排放量，不僅可以提高反芻動物對能量的利用效率，還將帶來良好的生態(tài)收益。

多不飽和脂肪酸對瘤胃微生物有較強的抑制作用，富含多不飽和脂肪酸的植物油如葵花籽油，可以顯著的降低甲烷的生成，降低乙酸比例，提高丙酸比例，改變瘤胃的發(fā)酵模式［1］。有研究發(fā)現(xiàn)動物日糧中補充一些天然植物油，還可以增加動物產(chǎn)品中一些對人體有益的不飽和脂肪酸(如:共軛亞油酸)的含量。Benchaar 等［2］在奶牛的日糧中添加不同水平的LSO，發(fā)現(xiàn)乳中一些對人體健康有益的脂肪酸成分(如:trans-11 18∶1，cis-9，trans-11 18∶2)的含量，隨著LSO 添加水平的增加而增加。本研究利用體外法研究添加不同水平的LSO，探索對甲烷生成、瘤胃發(fā)酵及脂肪酸中間產(chǎn)物的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用LSO 購自甘肅天水隴上農(nóng)家植物油加工中心，體外培養(yǎng)底物為羊草，過1 mm 篩網(wǎng)。

1.2 試驗動物飼養(yǎng)及瘤胃液采集

試驗動物為四頭安裝永久性瘤胃瘺管的瀏陽黑山羊(體重為25 ± 2 kg)，單籠飼養(yǎng)，作為瘤胃液供體。飼喂按照中國地方山羊營養(yǎng)需要，并結(jié)合美國NRC 營養(yǎng)需要，配制山羊日糧，精粗比為30∶70，粗飼料為當(dāng)?shù)氐挠衩捉斩挕Ｔ缟?:00 點和晚上8:00各喂一次，自由采食、飲水。

晨飼前2 h，利用手動真空管采集每頭羊的瘤胃液，放入事先預(yù)熱(39 ℃)且充滿CO2氣體的保溫瓶中。在持續(xù)通CO2的條件下，將四只羊的瘤胃液混合均勻，過四層醫(yī)用紗布，待用。

1.3 體外培養(yǎng)

試驗底物為粉碎的羊草，LSO 為天然傳統(tǒng)壓榨法制作而成。試驗分三個處理組:對照組(Control)、底物+5% LSO 組和底物+10% LSO 組，每組三個重復(fù)。緩沖液配制參照Goering and Van Soest(1970)［3］配方。體外培養(yǎng)體系為瘤胃液:緩沖液=1:4，底物為50 mg，39 ℃條件下恒溫水浴，振蕩培養(yǎng)48 h。

1.4 總氣體、甲烷及氫氣測定

用壓力傳感器(昆山雙橋傳感器測控技術(shù)有限公司)測定12、24 和48 h 產(chǎn)氣壓力，并用相應(yīng)公式轉(zhuǎn)變成產(chǎn)氣量。在培養(yǎng)12、24 和48 h 時間點，分別抽取兩管氣體(5 mL/管)，測定甲烷及氫氣含量。甲烷測定利用配備了火焰-離子化檢測的7890 型氣相色譜(安捷倫)，測定氣相柱為Hayesep Q 填充柱(2.44 m × 1/8 in.，2.0 mm ID)，氣相柱和檢測器溫度分別為60 ℃和100 ℃，維持3 min，氮氣為載氣，流速為21 mL/min。氫氣測定所用的儀器與測定甲烷所用的為同臺儀器，柱溫設(shè)為60 ℃，維持2.5 min，其余檢測條件與測定甲烷相同。

1.5 發(fā)酵參數(shù)測定

48 h 培養(yǎng)結(jié)束后，用pH 計(型號:PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司)立即測定發(fā)酵液的pH 值。取5 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液，-20 ℃冷凍保存，待測。VFA濃度具體測定參照Vanzant 和Cochran(1994)［4］的方法，氨氮濃度測定參照Weatherburn(1967)［5］方法。

1.6 長鏈脂肪酸測定

發(fā)酵液中脂肪酸按照Bligh 和Dyer［6］描述的方法進行提取，根據(jù)Ichihara 等［7］(1996)的操作步驟進行脂肪酸甲酯化。然后用配備了火焰-離子檢測器的5890 型氣相色譜(安捷倫)，氣相柱為CP-Sil 88 熔融石英毛細管柱(100 m × 0.25 mm，0.2 μm)，H2為載體。升溫程序為:爐溫開始為45 ℃，維持4 min，以13 ℃升溫速度升到175 ℃，維持27 min，然后再以4 ℃升溫速度升到215 ℃，維持35 min，測定時間為86 min。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010 整理后，采用SAS 軟件的廣義線性模型(GLM)對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，多重比較采用Duncan 氏法。P ＜0.05 表示差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 體外添加不同水平的LSO 對總氣體產(chǎn)量、甲烷及氫氣產(chǎn)量的影響

圖1 體外添加不同水平的LSO 對總氣體產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of addition of different levels of linseed oil on gas production in vitro

由圖1 可以看出，在整個培養(yǎng)期間，對照組的產(chǎn)氣量均高于添加LSO 處理組，而且在13～48 h 培養(yǎng)時段中，對照組的產(chǎn)氣量極顯著高于兩個LSO 添加組(P ＜0.01)，但是添加LSO 的兩個處理組之間差異不顯著(P ＞0.05)。

圖2 體外添加不同水平的LSO 對甲烷和氫氣產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of addition of different levels of linseed oil on CH4and H2production in vitro

圖2(I)顯示，在培養(yǎng)開始的前12 h 時段中，對照組的甲烷產(chǎn)量顯著高于(P ＜0.05)10% LSO 添加組，5% LSO 添加組的甲烷產(chǎn)量低于對照組，但是它們之間差異不顯著(P ＞0.05);在13～24 h 培養(yǎng)時段中，對照組的甲烷產(chǎn)量極顯著(P ＜0.01)高于兩個LSO 添加組，而5% LSO 添加組的甲烷產(chǎn)量極顯著(P ＜0.01)高于10%添加組;在25～48 h 培養(yǎng)階段，對照組的甲烷產(chǎn)量極顯著(P ＜0.01)高于兩個LSO 添加組，而5% LSO 添加組顯著(P ＜0.05)高于10%添加組。圖2(II)表明，在培養(yǎng)的前24 h，各組之間的氫氣產(chǎn)量均無顯著差異(P ＞0.05)，但隨著LSO 添加量的增加而呈現(xiàn)出增加的趨勢;在25～48 h 培養(yǎng)時段，對照組的氫氣產(chǎn)量極顯著(P ＜0.01)低于另外兩組，同時，5% LSO 添加組顯著(P＜0.05)低于10%的添加組。

2.2 體外添加不同水平的LSO 對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

表1 體外添加不同水平的LSO 對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 1 Effects of addition of different levels of linseed oil on rumen fermentation parameters in vitro

由表1 可以看出，對照組發(fā)酵液中的乙酸和丙酸濃度極顯著(P ＜0.01)低于LSO 添加組，并且兩個LSO 添加組之間無顯著差異(P ＞0.05);對照組發(fā)酵液中異丁酸和異戊酸的濃度顯著(P ＜0.05)低于5% LSO 添加組;對照組發(fā)酵液中丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度極顯著低于(P ＜ 0.01)兩個LSO 添加組，但是兩個LSO 添加組之間差異不顯著(P ＞0.05);對照組的乙丙比顯著(P ＜0.05)高于5% LSO 添加組，極顯著(P ＜0.01)高于10%LSO 添加組，但是兩個LSO 添加組之間差異不顯著(P ＞0.05)。

發(fā)酵液的pH 值隨著LSO 添加劑量的增加而下降，10% LSO 添加組極顯著(P ＜0.01)低于對照組，顯著(P ＜0.05)低于5%添加組。同樣，發(fā)酵液中的氨態(tài)氮濃度隨著LSO 添加劑量的增加而下降，對照組中氨氮的濃度極顯著(P ＜0.01)高于兩個LSO 添加組，而5% LSO 添加組顯著(P ＜0.05)高于10%組。

2.3 體外添加不同水平的LSO 對發(fā)酵液中脂肪酸的影響

表2 體外添加不同水平的LSO 酸對發(fā)酵液中脂肪酸的影響(%)Table 2 Effects of addition of different levels of linseed oil on fatty acids in vitro (%)

從表2 中可以看出，添加LSO 對發(fā)酵液中的一些中長鏈脂肪酸(C15∶0-C17∶0)沒有顯著影響，同樣發(fā)酵液中長鏈脂肪酸(C18∶0)的含量，也沒有顯著變化，但是隨著LSO 添加量的增加，C18∶0 的含量有增加的趨勢;同樣，添加LSO 對發(fā)酵液中C18∶1、t11-TVA 和C18∶1，C11 的含量也沒有達到顯著影響;對照組發(fā)酵液中C18∶1，C9 的含量極顯著(P ＜0.01)高于5% LSO 添加組，顯著(P ＜0.05)高于10% LSO 添加組;對照組發(fā)酵液中沒有檢測到共軛亞油酸的兩種同分異構(gòu)體(C18 ∶2，c9t11-CLA 和C18∶2，t11t13-CLA)，而添加LSO 處理中這兩種同分異構(gòu)體的含量較為豐富;添加LSO 對C18 ∶2、c9t11-CLA 的含量沒有顯著影響，5% LSO 添加組發(fā)酵液中C18∶2、t11t13-CLA 的含量顯著(P ＜0.05)高于10% LSO 添加組;添加LSO 對TSFA、TMUFA、TPUFA、Ttrans、TCLA、Tn-3PUFA 和Tn-6PUFA 的含量均沒有顯著影響，但是LSO 添加組中發(fā)酵液中的TMUFA、TPUFA、Ttrans 和TCLA 含量高于對照組。

3 討論

在本研究中，富含多不飽和脂肪酸的LSO 降低了總產(chǎn)氣量和甲烷生成量，隨著添加劑量的增加，抑制總氣體和甲烷產(chǎn)量的效果也顯著增強(圖1、圖2I)，但是氫氣的產(chǎn)量卻是增加的(圖 2II)。Wanapat 等［8］綜述了前人所報道的一些體內(nèi)和體外試驗，認為當(dāng)日糧添加植物油時，對瘤胃發(fā)酵和甲烷的生成均有顯著影響。本研究與上述報道一致。反芻動物采食飼料后，飼料經(jīng)過瘤胃微生物降解可生成揮發(fā)性脂肪酸和氫氣。在本研究中，添加亞麻籽油增加了氫氣的產(chǎn)量，這可能是由于亞麻籽油中的不飽和脂肪酸對甲烷菌的抑制，減少了甲烷菌對氫的利用，導(dǎo)致了氫氣產(chǎn)量的增加。

本研究中富含多不飽和脂肪酸的LSO 顯著改變了瘤胃發(fā)酵類型，不同劑量添加組顯著增加了總揮發(fā)性脂肪酸含量(P ＜ 0.01)，降低了(P ＜0.01)乙酸比例，提高了(P ＜0.01)丙酸比例，降低了(P ＜0.05 或P ＜0.01)乙酸丙酸比例。Pilajun和Wanapat［9］也觀察到了類似的結(jié)果。添加LSO 發(fā)酵48 h 后pH 顯著被降低，這可能是因為添加的LSO 經(jīng)過微生物作用，釋放出自由脂肪酸以及發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸的增加所導(dǎo)致。本研究中添加LSO 顯著降低了發(fā)酵液中的銨態(tài)氮濃度，Jalc 等［10］進行的體外發(fā)酵試驗，添加亞麻酸處理組也觀察到了類似的結(jié)果。這可能是由于不飽和脂肪酸抑制發(fā)酵液中的瘤胃原蟲和細菌所造成的。

瘤胃中脂肪代謝是瘤胃微生物首先將飼料中的糖脂、磷脂和甘油三脂等進行水解，釋放出自由的脂肪酸，然后進行氫化、異構(gòu)等過程。在本試驗中，添加LSO 增加了發(fā)酵液中的飽和脂肪酸的比例(C18∶0)，而這是反芻動物日糧中補充植物油一個典型特征。對照組中C18∶1，C9 所占總脂肪酸比例顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)高于LSO 添加組，這可能是由于處理組中其他脂肪酸的含量增加，因此C18∶1，C9 比例相對較低。對照組中沒有檢出兩種共軛亞油酸(cis9，trans11-CLA，trans11，trans13-CLA)，但是LSO 添加組均有檢測到這兩種共軛亞油酸。Loor等［11］在奶牛日糧中添加LSO，也發(fā)現(xiàn)增加了十二指腸流中的cis9，-trans11-CLA 和trans11，trans13-CLA的含量。Flachowsky 等［12］給飼喂日糧(精粗比為70∶30 干物質(zhì)基礎(chǔ))的奶牛每天補充200 g LSO，發(fā)現(xiàn)十二指腸流中TMUFA、TPUFA、Ttrans 和TCLA 的含量得到大幅度的提高。本研究中，添加LSO 組發(fā)酵液中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

綜上所述，體外添加富含多不飽和脂肪酸的LSO 顯著抑制了甲烷生成，瘤胃發(fā)酵模式向丙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，而且效果隨著添加水平的增加而顯著加強。同時，添加LSO 提高了發(fā)酵液中對人體有益的脂肪酸的含量，有利于這些脂肪酸沉積到動物產(chǎn)品中，改善動物產(chǎn)品的質(zhì)量。

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