一株鏈霉菌產(chǎn)生的抗腫瘤活性產(chǎn)物

蔣秋龍，楊志鈞，饒 敏，戈 梅，錢秀萍*

1上海交通大學(xué)藥學(xué)院;2 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心，上海 200240

鏈霉菌是一類具有絲狀分枝細胞的革蘭氏陽性細菌，與其他細菌相比具有較為復(fù)雜的發(fā)育分化過程，而其形態(tài)分化的同時又伴隨著復(fù)雜的生理變化和大量次級代謝產(chǎn)物的生成［1］。鏈霉菌除了產(chǎn)生臨床上應(yīng)用的大部分抗生素外，還包括抗腫瘤活性產(chǎn)物如Lee［2］等從Streptomyces sp.KACC91015 中分離到的苯二羥基辛烯酮衍生物對腫瘤細胞有抗增殖作用，酶抑制劑如Shin-ya［3］等從S.anulatus 中分離得到telomestatin，該物質(zhì)是一種強效特異的端粒酶抑制劑，殺蟲劑如Lewer［4］等從Streptomyces CP1130分離得到tartrolone C 對舔菜夜蛾具有中等的殺蟲作用等等，因此研究鏈霉菌代謝產(chǎn)物具有重要的意義。作者在一株鏈霉菌屬的放線菌發(fā)酵液中，分離出2 個新化合物和4 個已知化合物(圖1)，且兩個新化合物都具有一定的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Master cycler epgradient PCR 儀(Eppendorf);Heidoldf Laborata-4000 旋轉(zhuǎn)，蒸發(fā)儀;硅膠柱色譜300～400 目;戴安液相色譜儀P680(DIONEX);Agilent 1100 型高效液相色譜儀(Agilent);Q-Tofmicro磁式質(zhì)譜儀(Waters);BrukerAvanceII-400 型超導(dǎo)核磁共振儀，TMS 為內(nèi)標(biāo);JASCO P2000 旋光儀。

1.2 菌種來源

鏈霉菌HCCB11431、金黃色葡萄球菌、乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞PANC-1 和前列腺癌細胞Du-145(菌種和細胞均保藏于上海來益生物藥物研究開發(fā)中心)。

圖1 化合物1～6 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

1.3 菌株HCCB11431 的分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB 法［5］提取放線菌基因組DNA，提取后用50 μL TER(含RnaseA 20 μg/mL)溶解，以提取的DNA 為模版，利用細菌gyrB 通用引物(gryBPF-1、gryB-PR-2)進行擴增。PCR 擴增條件為:94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，58 ℃復(fù)性30 s，72℃延伸5 min，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

將獲得的序列與GenBank 中已發(fā)表的gyrB 基因序列進行同源性比較，選取同源性在95%以上的若干菌株，利用MEGA5.0 軟件進行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。MEGA 軟件相關(guān)參數(shù)為:統(tǒng)計方法選擇Neighbor-Joining，Bootstrap 選擇1000，置換法選擇Kimura2-parameter model。

1.4 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，甘油20 g，可溶性淀粉20 g，黃豆餅30 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g 和水1 L;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖8 g，黃豆餅粉22 g，玉米淀粉40 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO40.2 g，NaCl 2 g 和水1 L。發(fā)酵過程:先將HCCB11431接種于種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2 d(28 ℃、220 rpm)，再將培養(yǎng)好的種子以8%的接種量接種于5 L的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)6～7 d。

1.5 產(chǎn)物的分離純化

發(fā)酵結(jié)束后，用同等體積的甲醇過夜浸泡，離心得上清液，蒸干后得粗品20 g。粗品用甲醇溶解并用硅膠拌樣，氯仿和甲醇體系過硅膠柱，梯度(甲醇濃度10%～90%)洗脫，洗脫液根據(jù)TLC 點板和HPLC 分析后合并餾分得到餾分1 和餾分2，蒸干溶劑后復(fù)溶于甲醇中。

餾分1 和餾分2 分別用戴安液相色譜儀P680進行分離，制備柱YMC-Pack RP C18(20 mm ×250 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A 相為超純水，B相為甲醇(色譜純);進樣量:1 mL;0～30 min 用30%～100%甲醇洗脫，流速8 mL/min，得到餾分1-1、1-2、2-1 和2-2。

餾分1-1 經(jīng)Agilent 1100 制備液相色譜儀分離，半制備柱YMC-Pack RP C18(10 mm × 250 mm，5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A 相為甲酸水(0.05%甲酸)，B 相為甲醇(色譜純);進樣量:20 μL;0～30 min 用30%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物1(tR=28.9 min);餾分1-2 經(jīng)Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～35 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物3(tR=30.7 min);餾分2-2 經(jīng)Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物2(tR=22.0 min);餾分2-1 經(jīng)Agilent 1100制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到餾分2-1-1 和餾分2-1-2;餾分2-1-1 經(jīng)Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物4(tR=7.9 min)和化合物6(tR=8.5 min);餾分2-1-2 再經(jīng)Agilent 1100 制備液相色譜儀分離(0～30 min 用15%甲醇等度洗脫，流速2 mL/min)得到化合物5(tR=16.6 min)。

1.6 細胞毒活性測定方法

參照貼壁細胞的MTT 法［6］進行測試。具體方法如下:在96 孔板上，加5 ×104/mL 濃度的測試細胞的懸浮液，每孔90 μL，待細胞貼壁后加入待測樣品10 μL，每個濃度重復(fù)3 個孔，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后加入20 μLMTT 染料繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入120 μL DMSO 后，等待20 min 后用Bio-Rad680 酶標(biāo)儀測定OD570。抑制率計算公式如下:

根據(jù)計算出的細胞抑制率，用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 11.0 的Probit 回歸法，計算樣品的IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HCCB11431 分子生物學(xué)鑒定

gyrB 基因是編碼DNA 促旋酶的亞單位蛋白，對于細菌DNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制很重要，是一段較保守的序列，不出現(xiàn)頻繁的基因橫向轉(zhuǎn)移，因而常常被選用于細菌系統(tǒng)發(fā)育分析［7］。測序結(jié)果表明HCCB11431 的gyrB 基因含有1229 個核苷酸，GenBank號:KF746164。將HCCB11431 的gyrB 基因序列與GenBank 中相關(guān)序列的BLAST 比較，結(jié)果顯示HCCB11431 屬于鏈霉菌屬，與Streptomyces labedae 的序列同源性高達99%以上。

利用HCCB11431 的gyrB 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，由圖可知HCCB11431 與Streptomyces labedae 位于同一分支，同源性很高，在所比對的鏈霉菌中，與Streptomyces labedae 的關(guān)系最接近，故該菌株初步鑒定為Streptomyces labedae 菌。

圖2 HCCB11431 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic tree of HCCB11431 based on gyrB full-length sequence

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末，UV (H2O)λmax280(ε1159.85)，。質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 268.1155［M+H］+，分子式為C13H17NO5(理論計算值為268.1185，不飽和度為6);紅外光譜在3440、3423 cm-1上有吸收表明有氨基或羥基的存在，1630 cm-1上的吸收表明有羰基的存在，在1385、1122 cm-1處的吸收表明可能有芳香環(huán)的存在。通過分析1H NMR、13C NMR 和HMQC 波譜數(shù)據(jù)(表1)證實化合物1 含有3 個甲基(1 個連氧的甲基)、1 個亞甲基、1 個連氮的次甲基、1 個四取代的苯環(huán)和2 個羰基(δC171.2 和163.2);根據(jù)以上數(shù)據(jù)推得，其分子式和不飽和度要求化合物1 結(jié)構(gòu)中含有1 個羥基和1 個氨基。通過1H-1H COSY 相關(guān)譜1 得到1個孤立的C-2– C-3 自旋體。在HMBC 譜(圖3)中，H2-3 與C-4、C-5 和C-9 相關(guān)，表明C-3 在苯環(huán)的C-4 位取代;H3-13 與C-7、C-8 和C-9 相關(guān)，表明C-13 與C-8 相連;H3-12 與C-7 相關(guān)，以及考慮C-12的化學(xué)位移，C-12 通過氧與苯環(huán)上的C-7 相連;H3-11 與C-10 相關(guān)，以及考慮到C-6(δC148.9)和C-7(δC144.2)的化學(xué)位移，C-11 通過酯健與C-6 相連;H-2 與C-1 相關(guān)以及考慮到C-2 的化學(xué)位移，剩下的-COOH 和-NH2與C-2 相連。通過以上數(shù)據(jù)，推出化合物1 的平面結(jié)構(gòu)為三取代苯丙氨酸衍生物，該物質(zhì)為一新化合物，命名為3-(3-acetoxy-4-methoxy-5-methylphenyl)-2-aminopropanoicacid。化合物1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻［8］中報道的已知化合物3-(3-hydroxy-4-methoxy-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid 的結(jié)構(gòu)類似，多了一個乙酯基，其他部分核磁數(shù)據(jù)基本一致，證明了化合物1 的推測結(jié)構(gòu)符合事實。

表1 化合物1 的核磁數(shù)據(jù)Table 1 NMR spectroscopic data of 1 (Actone-d6，400 MHz)

圖3 化合物1 的HMBC 關(guān)系圖Fig.3 Key HMBC correlations of 1

化合物2 白色粉末，λmax280(ε1226.52)，=-23.21(c 0.2，CH3OH);高分辨正離子電噴霧質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z254.1022［M+H］+，分子式為C12H15NO5(理論計算值為254.1028，不飽和度為6)。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-5)，6.47(1H，s，H-9)，4.57(1H，dd，J=8.5，5.3 Hz，H-2)，3.00(1H，dd，J=13.9，5.1 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=13.9，8.7 Hz，H-3β)，1.94(3H，s，H-11)，2.17(3H，s，H-12)。紅外光譜與化合物1 相近，另外通過與化合物1的1H NMR 數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，氧甲基(δH3.73)在化合物2 中消失外，其它1H NMR 數(shù)據(jù)基本一致，表明該化合物比化合物1 少了氧甲基，其它結(jié)構(gòu)與化合物1 相同，該物質(zhì)也為一新化合物，命名為3-(3-acetoxy-4-hydroxyl-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid。化合物2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻［8］中報道的已知化合物3-(3，4-hydroxyl-5-methylphenyl)-2-aminopropanoic acid的結(jié)構(gòu)類似，多了一個乙酯基，其他部分核磁數(shù)據(jù)基本一致，從而證實了化合物2 推測的結(jié)構(gòu)是正確的。

化合物3 白色粉末，TOF-MS m/z 252.1081［M+H］+，分子式為C10H13N5O3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:8.19(1H，s，H-2)，8.34(1H，s，H-8)，6.34(1H，dd，J=6.1，8.0 Hz，H-1')，2.28(1H，ddd，J=2.7，6.0，-13.1 Hz，H-2'α)，2.75(1H，ddd，J=5.7，8.0，-13.1 Hz，H-2'β)，4.42(1H，dddd，J=2.6，2.7，4.0，5.7 Hz，H-3')，3.88(1H，ddd，J=2.6，4.2，4.4 Hz，H-4')，3.62(1H，ddd，J=4.4，5.0，-12.0 Hz，H-5'a)，3.52(1H，ddd，J=4.2，6.7，-12.0 Hz，H-5'b)，5.30(1H，d，J=4.0 Hz，OH-3')，5.23(1H，dd，J=5.0，6.7 Hz，OH-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］報道基本一致，故化合物3 確定為2'-deoxyadenosine。

化合物4 白色粉末，TOF-MS m/z 244.0906［M+H］+，分子式為C9H13N3O5。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:3.80(1H，dd，J=12.4，2.4 Hz，H-5')，3.93(1H，dd，J=12.4，2.4 Hz，H-5')，4.09(1H，ddd，J=2.8，3.2，2.4 Hz，H-4')，4.18(1H，dd，J=5.3，5.2 Hz，H-3')，4.21(1H，dd，J=4.8，4.2 Hz，H-2')，6.12(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，5.89(1H，d，J=3.2 Hz，H-1')，8.51(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，以上數(shù)據(jù)與文獻［10］報道基本一致，故化合物4 確定為Cytidine。

化合物5 白色粉末(CH3OH)，TOF-MS m/z 245.0736［M+H］+，分子式為C9H12N2O6。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.03(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=4.6 Hz，H-1')，5.71(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，4.19(1H，dd，J=6.1，5.0 Hz，H-2')，4.17(1H，dd，J=4.9，4.9 Hz，H-3')，4.03(1H，ddd，J=2.9，3.1，4.0 Hz，H-4')，3.85(1H，dd，J=12.3，2.8 Hz，H-5')，3.75(1H，dd，J=12.3，3.0 Hz，H-5')，以上數(shù)據(jù)與文獻［11］報道基本一致，故化合物5確定為Uridine。

化合物6 白色粉末，TOF-MS m/z 228.0978［M+H］+，分子式為C9H13N3O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.12(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，6.27(1H，dd，J=6.2，7.6 Hz，H-1')，6.00(1H，d，J=7.6 Hz，H-5)，4.40(1H，d，H-3')，3.98(1H，ddd，J=2.8，8.0 Hz，H-4')，3.85-3.72 (2H，m，H-5'，H-5'')，2.42-2.14(2H，m，H-2'，H-2'')，以上數(shù)據(jù)與文獻［12］報道基本一致，故化合物6 確定為2'-deoxycytidine。

2.3 活性分析

活性測定結(jié)果表明，化合物對不同的腫瘤細胞具有不同的細胞毒活性(表3)。化合物1 和化學(xué)物2 是屬于氨基酸衍生物，其中化合物1 只對MCF-7有一定的抑制作用，化合物2 對三種腫瘤細胞均具有較高的抑制作用，推測可能是由于甲基化減弱了細胞毒的緣故。化合物3～6 屬于核苷類似物，其中化合物3 和4 的抗腫瘤活性較強，化合物3 是蟲草素的結(jié)構(gòu)類似物，而蟲草素［13］(cordycepin)是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用。雖然化合物4 和化合物6 同屬于胞苷類似物，但化合物4 的活性明顯較高，說明2'位的羥基是重要的活性位點。

表3 化合物1～6 的IC50結(jié)果Table 3 IC50values of compounds 1-6 on tumor cells growth(μg/mL)

3 討論

本實驗分離得到的化合物分別為氨基酸衍生物(1～2)和核苷類似物(3～6)，目前很多研究者將氨基酸進行結(jié)構(gòu)修飾應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選，部分氨基酸經(jīng)過修飾后不僅增加了對腫瘤細胞的靶向性，其抗腫瘤活性也有了提高，毒副反應(yīng)也有所降低，因此利用氨基酸設(shè)計出新的抗腫瘤藥物具有重要意義。在本實驗中，化合物1 和化合物2 在結(jié)構(gòu)上相差一個甲基，即化合物2 苯環(huán)上的羥基被甲基化，化合物2 的抗腫瘤活性明顯比化合物1 要高很多，表明化合物2 苯環(huán)上的羥基可能是活性位點之一。

核苷類似物結(jié)構(gòu)易改造，生物體內(nèi)多種分子作用靶標(biāo)也讓核苷類似物可以通過多種途徑產(chǎn)生抗腫瘤活性。通過構(gòu)效關(guān)系建立模型來指導(dǎo)藥物的合成是目前核苷類抗癌藥物的發(fā)展方向之一，本實驗分離出的化合物4 和化合物6 也證明了結(jié)構(gòu)的差異引起了抗腫瘤活性的改變。

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