AOAC方法檢測大豆異黃酮的淺析

劉郭飛，伍 林，童 玲，楊立峰，李 丹，童 坤，薩仁高娃，易德蓮

（1.武漢科技大學應用化學研究所，湖北 武漢430081；2.武昌理工學院生命科學學院，湖北 武漢430223；3.日本北見工業大學生物材料大學院，日本 北見0900061）

大豆及大豆制品是我國以及其它亞洲國家的傳統食品，大豆中含有豐富的油脂和植物蛋白，其中大豆異黃酮具有很高的營養價值而且能預防和治療多種疾病。到目前為止，從大豆中提取分離出的大豆異黃酮的異構體共有12種，主要的有6種，分為結合型糖苷和游離型苷元，糖苷主要以黃豆苷（daidzin）、黃豆黃苷（glycitin）、染料木苷（genistin）的形式存在，而苷元主要以黃豆苷元（daidzein）、黃豆黃素（glycitein）和染料木黃酮（genistein）的形式存在［1－2］。大豆異黃酮（soybean isoflavones）是一種具有生物活性的植物雌激素，可以降低骨質疏松［3］、乳腺癌、更年期綜合癥［4－6］的發生幾率。另外，還具有抑菌［7］、提高免疫力［8］、降低膽固醇［9］和改善動脈硬化的作用［10］。近幾年還有研究證實大豆異黃酮具有抗高尿酸癥［11］和降血糖［12］的作用。但是過量的大豆異黃酮也會帶來負面影響，最近有研究指出大豆異黃酮作為植物激素過量使用時對小鼠的生殖系統產生了負面影響［13］。因此，大豆異黃酮的含量檢測十分重要。2001年，AOAC（美國分析化學家協會）公布了大豆及大豆制品中異黃酮的測定方法。作者在此淺析了AOAC方法的實驗條件和方法，希望能對國內大豆異黃酮的檢測起一定的指導作用。

1 實驗

1.1 材料與試劑

大豆樣品（黑龍江產），市售，磨碎后于干燥環境中保存待用。

甲醇（分析純）、冰醋酸（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）、甲醇（色譜純），關東化學株式會社；黃豆苷、黃豆苷元、染料木苷、染料木黃酮、黃豆黃苷、黃豆黃素標準品（純度≥99%），長良科技株式會社。

1.2 主要儀器

LC－10AT型高效液相色譜系統（SCL－10A型系統控制系統，SIL－10A型自動進樣系統，SPD－10A型紫外檢測系統，CTO－10A型柱溫箱系統），日本SHIMADZU；EDU－1200型冷凍干燥機、NVC－2100型旋轉蒸發儀、NTS－2000型恒溫振蕩器，日本EYELA；HIMAC CF 15R型高速冷凍離心機，日本HITACHI；MDF－392型超低溫冰箱，日本SANYO；ML－50型加熱干燥式水分測試計，日本AND株式會社。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

按AOAC方法進行［14］。準確稱取5.00g大豆樣品粉末，加入80%甲醇溶液40mL，于65℃水浴中振蕩2.0h，冷卻至室溫后加入3mL 2mol·L－1氫氧化鈉溶液，于室溫水浴中振蕩10min；然后加入1mL冰醋酸，用甲醇定容至50mL，取定容后5mL上清液，加入4mL水，再次用甲醇定容至10mL，取上清液于1 500 r·min－1離心10min，取適量上清液用0.2nm過濾膜過濾后轉入液相色譜瓶中待檢測。每個樣品設置3個平行樣。

1.3.2 HPLC條件

色譜柱為Inertsil ODS－4色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；柱溫40℃；流動相A為V水∶V甲醇∶V醋酸＝44∶5∶1，流動相B為V甲醇∶V醋酸＝49∶1，流速1 mL·min－1；梯度洗脫條件：0～30min，10%～60%B；30～33min，60%～100%B；33～35min，100%B；35～37min，100%～10%B；進樣量10μL；檢測波長260nm。

1.3.3 標準曲線繪制

按AOAC方法進行。稱取6種標準品約1mg于10mL容量瓶中，用80%甲醇溶液溶解，定容，配成約0.1mg·mL－1的母液，搖勻儲藏待用。黃豆苷、染料木苷分別用母液配成濃度約為10mg·mL－1、20mg·mL－1、40mg·mL－1、60mg·mL－1、80mg·mL－1、100mg·mL－1的濃度梯度待測，黃豆黃苷、黃豆苷元、染料木黃酮分別用母液配成濃度約為1mg·mL－1、4mg·mL－1、8mg·mL－1、12mg·mL－1、16 mg·mL－1、20mg·mL－1的濃度梯度待測，黃豆黃素用母液配成濃度約為0.6mg·mL－1、0.8mg·mL－1、1.0mg·mL－1、1.2mg·mL－1、1.4mg·mL－1、1.6mg·mL－1的濃度梯度待測。用HPLC色譜儀檢測，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 提取溫度對大豆異黃酮含量檢測的影響

提取時間為2.0h、甲醇體積分數為80%，考察提取溫度對大豆異黃酮含量檢測的影響，結果如表1所示。

表1 提取溫度對大豆異黃酮含量檢測的影響Tab.1 The effect of extraction temperature on determination of soybean isoflavones

由表1可以看出：隨著提取溫度的升高，檢測出的大豆異黃酮含量相應升高，65℃時達到最高，到70℃時檢測出的含量反而下降。因此，選擇最佳提取溫度為65℃。

2.2 提取時間對大豆異黃酮含量檢測的影響

提取溫度為65℃、甲醇體積分數為80%，考察提取時間對大豆異黃酮含量檢測的影響，結果如表2所示。

表2 提取時間對大豆異黃酮含量檢測的影響Tab.2 The effect of extraction time on determination of soybean isoflavones

由表2可以看出：隨著提取時間的延長，檢測出的大豆異黃酮含量相應升高，但是2.0h之后，含量的升幅不明顯。從經濟和能源角度綜合考慮，選擇最佳提取時間為2.0h。

2.3 甲醇體積分數對大豆異黃酮含量檢測的影響

提取溫度為65℃、提取時間為2.0h，考察甲醇體積分數對大豆異黃酮含量檢測的影響，結果如表3所示。

表3 甲醇體積分數對大豆異黃酮含量檢測的影響Tab.3 The effect of methanol volume fraction on determination of soybean isoflavones

由表3可以看出：隨著甲醇體積分數的增大，檢測出的大豆異黃酮含量相應升高，但是由于80%甲醇溶液的沸點為69～70℃，若使用更高體積分數的甲醇來提取，甲醇會沸騰揮發，體積分數改變而影響檢測結果。故選取最佳甲醇體積分數為80%。

2.4 日間精密度

提取溫度為65℃、提取時間為2.0h、甲醇體積分數為80%，將提取后待檢測提取液避光冷藏保存，連續5d檢測大豆異黃酮含量，考察其穩定性，結果如表4所示。

表4 大豆異黃酮含量檢測的日間精密度Tab.4 The day to day precision of determination of soybean isoflovones

由表4可以看出，采用AOAC方法檢測大豆異黃酮含量日間精密度良好，穩定性高，數據具有良好的可靠性。

2.5 標準曲線

6種大豆異黃酮的分離效果如圖1所示，其標準曲線的線性回歸方程如表5所示。

圖1 6種大豆異黃酮的分離效果Fig.1 The separation effect of six kinds of soybean isoflavones

由圖1可以看出，在設定的HPLC色譜條件下，6種大豆異黃酮保留時間適當，分離效果良好。

由表5可以看出，6種大豆異黃酮的標準曲線的線性回歸系數良好，相關性高。

表5 6種大豆異黃酮的線性回歸方程Tab.5 The linear regression equation of six kinds of soybean isoflavones

3 結論

研究表明，AOAC方法通過提取、皂化和液相色譜檢測，能夠簡便而準確地檢測出樣品中大豆異黃酮的含量，其最佳提取溫度為65℃、最佳提取時間為2.0h、最佳甲醇體積分數為80%。該方法在5d內的日間精密度良好，穩定性高。且AOAC方法中大豆異

黃酮的標準品的線性關系良好，可靠性高。只采用6種大豆異黃酮異構體就可檢測出大豆異黃酮含量。AOAC方法操作簡單、成本較低，對國內大豆異黃酮的測定具有較好的參考意義。

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