赤霉素萃余液降解微生物的分離篩選及其降解COD的研究

張金兒，劉義雄，毛玉華，朱江萍，葉曉斌，肖 芳，涂國全

（江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干331307）

赤霉素是植物五大激素之一，主要由藤倉赤霉菌及其變種通過液體深層有氧發(fā)酵而得。赤霉素萃余液是赤霉素濃縮液經(jīng)溶媒萃取后的高濃度有機廢液，具有顯著的“三高”特點：高酸性（pH值≤2.2）、高鹽（鹽濃度≥10%）、超高有機濃度（≥100 000mg·L－1），一般菌在此廢液中難以存活［1］。

利用酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵降解赤霉素萃余液中COD的技術(shù)路線初步可行［1］，但降解效果并不理想。作者在此通過富集培養(yǎng)篩選得到“三耐”（耐酸、耐鹽、耐高濃度有機物）的高效降解赤霉素萃余液的不同類型的微生物（菌或菌群），并通過不同類型微生物的科學配伍進行免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵，對赤霉素萃余液進行高效降解，擬為抗生素發(fā)酵萃余液的處理開辟新途徑，具有重要的理論研究和實際應用價值。

1 實驗

1.1 材料

赤霉素萃余液，江西新瑞豐生化有限公司；xm＃菌，江西農(nóng)業(yè)大學生物工程學院。

1.2 方法

1.2.1 定向富集培養(yǎng)分離篩選流程（圖1）

1.2.2 土樣采集

圖1 定向富集培養(yǎng)分離篩選流程Fig.1 Process of redirect enrichment，isolation and screening

分別從長期堆放赤霉素發(fā)酵液濾渣場地、稻田、環(huán)保污泥、小便池及營養(yǎng)豐富的土壤等地深20cm處取土壤500g左右，裝于牛皮紙信封或塑料袋中，記錄土樣來源并編號。將采集的土樣于37℃培養(yǎng)烘干，然后用木棒將烘干土樣壓成粉末，備用。

1.2.3 不同pH值赤霉素萃余液的制備與分裝

取赤霉素萃余液3份，緩慢加入6mol·L－1NaOH溶液，分別調(diào)pH值為5.0、6.0和7.0，等量分裝于若干小試管中。

1.2.4 富集培養(yǎng)

1）第一次富集培養(yǎng)

每次做20個土樣。每個土樣取1g左右放入上述試管內(nèi)，用棉塞塞試管口。其中pH值5.0、6.0、7.0各接種3支，分別置于20℃、28℃和37℃溫箱中培養(yǎng)4～6d后觀察培養(yǎng)液的顏色并檢測pH值。以不接種土樣為對照。分別對顏色和pH值變化顯著的富集管取樣涂片進行顯微觀察，以確定培養(yǎng)液中是否有微生物并初步確定是細菌、放線菌、霉菌還是酵母菌。將顏色和pH值無明顯變化的富集管棄去。

2）第二次富集培養(yǎng)

分別取第一次富集培養(yǎng)中確定有微生物的富集液接種于對應的pH值培養(yǎng)液中，在對應的培養(yǎng)溫度下進行第二次富集培養(yǎng)，3～4d后觀察培養(yǎng)液的顏色、檢測pH值，并進行鏡檢。

3）第三次富集培養(yǎng)

取第二次富集液同法進行第三次富集培養(yǎng)。

1.2.5 分離

1）稀釋平板分離

將第三次富集培養(yǎng)液中經(jīng)鏡檢有菌的試管用10倍稀釋法稀釋到適當?shù)臐舛群蠼臃N到對應的pH值平板分離培養(yǎng)基上，搖勻后置于對應的溫度下培養(yǎng)至肉眼可見單菌落。

2）單菌落斜面或液體管的培養(yǎng)

將細菌、放線菌、酵母菌或霉菌的單菌落分別接種至對應的pH值斜面培養(yǎng)基上，編號并置于對應的溫度下培養(yǎng)至菌苔豐滿后，置于4℃冰箱中保藏備用。

1.2.6 篩選

在250mL三角瓶中分別裝入pH值為5.0、6.0、7.0的赤霉素萃余液100mL，進行高效菌株的初篩和復篩。

1）初篩

每個菌落斜面接種一瓶，置于相應的溫度下靜止培養(yǎng)5～8d后觀察培養(yǎng)液的顏色變化，聞氣味，檢測培養(yǎng)前后的pH值、COD值和固含量。選取pH值、COD值變化較大的菌株為初篩入選菌株，棄去pH值、COD值變化不大的菌株。

2）復篩

將每株初篩入選菌接種3瓶，篩選方法與初篩相同。選取pH值變化大、COD值下降率達到40%以上的菌株為復篩入選菌株。分別將復篩入選菌株進行擴培和菌種保藏，以便進行菌株間的科學配伍和赤霉素萃余液COD降解工藝研究。

1.2.7 免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵

1）小試

在250mL三角瓶中裝入pH值為6.0的赤霉素萃余液100mL，按10%～15%的接種量分別接入篩選所得單株高效菌或配伍菌，在28～32℃發(fā)酵，從41h開始取樣檢測COD值、固含量和pH值。

2）中試

在100L發(fā)酵罐中加入80LpH值為6.0左右的赤霉素萃余液，在28～32℃發(fā)酵，接種后2d內(nèi)少量通氣，2d后停止通氣，每天攪拌3～4次，每次10 min。接種量和檢測項目與小試相同。

1.2.8 分析檢測

顏色：目測。

pH值：采用pH酸度計測定。

菌體形態(tài)：涂片染色，在普通光學顯微鏡下觀察。

固含量：采用離心沉淀法測定，于4 000r·min－1離心10min，按下式計算固含量：

COD值：于4 000r·min－1離心10min，取上清液測定［2］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

對近200個土樣進行富集培養(yǎng)、平板分離及搖瓶初篩及復篩，共獲得多株“三耐”高效分解赤霉素萃余液的不同類型的菌株。幾株高效菌復篩過程中的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及發(fā)酵前后培養(yǎng)液顏色、pH值、COD值見表1，顯微照片見圖1。

從表1可知：幾株高效菌的單一降解效果可達42.55%～49.46%；發(fā)酵后pH值均有所回升，6＃菌升到7.0以上，而7＃、8＃菌都升到8.0以上。

從圖1可知，除8＃地衣為細菌外，其它3株菌均為酵母菌。

2.2 免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵小試結(jié)果

對3株高效菌（6＃、8＃、xm＃）和相互配伍菌進行赤霉素萃余液免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵降解COD小試實驗，結(jié)果見表2。

從表2可知：單一菌的降解效果不及配伍菌；以8＃地衣單一菌接種發(fā)酵時，其COD下降率不到50%；但和6＃酵母及xm＃酵母配伍時，COD下降率升高到60%以上，降解效果明顯改善。這可能是因為，起始pH值偏低，地衣繁殖慢；而配伍后，由于酵母菌大量繁殖產(chǎn)生乙醇致使pH值上升促進了地衣的繁殖，配伍菌隨之大量生長繁殖，改善了降解效果，COD下降率達60%以上。

表1 幾株赤霉素萃余液高效降解菌搖瓶復篩結(jié)果Tab.1 The shake flask screening results of high－efficient gibberellins raffinate－degrading bacteria

圖1 幾株赤霉素萃余液高效降解菌的顯微照片（×1600）Fig.1 The micrographs of high－efficient gibberellins raffinate－degrading bacteria（×1600）

表2 高效菌的免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵降解COD小試結(jié)果Tab.2 The degradation rate of COD of free autoclaved static continuous fermentation results for high－efficient bacteria

2.3 免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵中試結(jié)果

對xm＃＋6＃＋8＃配伍菌的赤霉素萃余液進行100L罐免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵降解COD中試實驗，結(jié)果見表3。

從表3可知，100L罐中試實驗的COD降解效果能重現(xiàn)小試水平，COD下降率達到60%以上；pH值和固含量都是先降后升再緩慢下降。

3 結(jié)論

（1）通過定向富集培養(yǎng)、分離篩選，獲得多株“三耐”高效降解赤霉素萃余液COD的酵母菌和細菌，利用酵母菌和細菌的協(xié)同作用，且不需另外添加飴糖等碳源，萃余液COD降解率達到60%以上。

（2）采用定向富集培養(yǎng)、分離篩選所得高效菌混合發(fā)酵，COD一次降解率比單一菌的降解率提高10%左右，但仍不能達標排放。要使COD值繼續(xù)降低，可對高效菌用目標廢液進行定向逐步馴化，進一步提高高效菌的降解能力，最終達標排放。

表3 配伍菌100L罐的免蒸靜止連續(xù)發(fā)酵實驗結(jié)果Tab.3 Free autoclaved static continuous fermentation results of compatibility of high－efficient bacteria in 100Lfermentor

［1］劉義雄，張文宣，徐勇，等.利用微生物混合靜止發(fā)酵降低赤霉素萃余液中COD含量［J］.農(nóng)藥，2013，52（9）：647－649.

［2］GB 11914－89，水質(zhì)化學需氧量的測定——重鉻酸鹽法［S］.