噴射蒸煮結合超濾技術制備大豆分離蛋白及其表征

朱樂平 楊 娟 高志明 楊曉泉 胡 磊 楊薇薇

(華南理工大學輕工與食品學院 食物蛋白工程研究中心，廣州 510640)(黑龍江搖籃乳業股份有限公司，哈爾濱 150000)

大豆濃縮蛋白(Soy protein concentrate, 簡稱SPC)是采用低變性豆粕除去水溶性或醇溶性非蛋白成分后，所制得的大豆蛋白產品。功能性大豆濃縮蛋白是以大豆濃縮蛋白為原料，通過蛋白質改性制取，可以提高凈蛋白質含量，改善整體蛋白質氨基酸的可消化利用性，清除可溶性糖分從而減少多種抗營養因子的危害，降低美拉德反應在大豆加熱過程中對賴氨酸利用效率的影響，價格實惠，容易獲得。但大豆濃縮蛋白經醇提工藝后普遍存在溶解性較低，影響大豆蛋白品質和營養性的物質去除不徹底等問題。大豆異黃酮是多酚類植物雌激素，具有預防癌癥、保護心血管和防止骨質疏松等多種生理活性，但是對兒童尤其是嬰兒的食用安全性尚存有爭議。

噴射蒸煮技術(Hydrothermal cooking或 Jet cooking)，是一種利用高溫高剪切力處理樣品的加熱技術，已經被有效的利用到蛋白的提取和結構重組中。Xia等[1]利用噴射蒸煮技術實現了制備高品質的碎米和米糠蛋白，并通過蛋白表面疏水性的測定發現隨著溫度的升高，有更多具有較低結合力的疏水作用位點暴露在蛋白分子表面。國外已經有利用噴射蒸煮技術提高蛋白質提取效率和改善蛋白質功能特性的研究[2-3]。

超濾技術是在壓力驅動下篩分小分子物質的過程，其中以切割分子質量的大小作為標準，對料液進行進一步的分離以及濃縮，可以達到去除一定小分子物質的作用。Kumar等[4]已經研究了超濾技術對大豆蛋白濃縮等方面的應用。

為進一步解決大豆蛋白配料在應用中的安全性及營養性的問題[5-6]，克服現有加工技術的局限，改善現有大豆蛋白配料中植物雌激素異黃酮偏高及商業功能性大豆濃縮蛋白溶解性差、色澤差、功能性受限和感官特性差等方面的不足，本試驗對商業功能性大豆濃縮蛋白進行噴射蒸煮結合超濾處理制備蛋白的研究，并對蛋白的相關特性進行了研究，以期在豆基嬰兒配方奶粉、青少年飲料等產品中得以開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

噴射蒸煮發生器：廣州南聯食品機械公司；CR-300 型色彩色差計：日本Minolta公司；液相色譜儀，1525型泵，4687檢測器：Waters公司；Rapid N cube-杜馬斯定氮儀：法國Elementar公司；2501PC-紫外-可見分光光度計：日本島津公司；Nano-ZS&MPT-2-Zeta電位及納米粒度分布儀：英國Malvern公司；CR22G-型冷凍離心機：日本HITACHI公司；JM-S052W中空超濾膜：廣州潔圣膜技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白的制備

噴射蒸煮結合超濾技術制備分離蛋白。制備參考Wang等[7]的方法，超濾膜選取截留分子質量為80 ku。大豆濃縮蛋白按1∶10的比例加蒸餾水，用2 mol/L的NaOH調pH 至9.0，于常溫下攪拌2 h，得蛋白乳漿。將蛋白乳漿進行膠體磨處理，然后置于噴射蒸煮器中120 ℃處理90 s，采用超濾膜過濾后用2 mol/L 的HCl調pH至4.5，酸沉30 min后，25 ℃、3 000 ×g下離心15 min，蛋白沉淀重新溶于7倍體積去離子水中，取可溶組分調節pH至7.5，經透析、冷凍干燥得蛋白樣品SPC-HTC-UF。

噴射蒸煮制備分離蛋白。不采用超濾膜過濾，其余操作同SPC-HTC-UF，得對照樣品SPC-HTC。

普通的酸沉制備分離蛋白。低溫脫脂豆粕，經堿溶酸沉提取制備蛋白，采用鄭二麗[8]的方法，得對照樣品SPI。

1.2.2 蛋白質含量、氮溶指數和得率的測定

商務英語是一種交流較為靈活的英語應用方式，商務英語更多應用在對外貿易、經濟交流方面，所以掌握口語英語能力是必須的，商務英語和普通英語最本質的區別在于商務英語是一種社會化語言形式。商務英語在農產交易中的應用具有以下幾個特點：

采用Dumas燃燒法測定樣品的含氮量，天冬氨酸作為氮校準標準物。稱取100 mg待測樣品放入錫箔紙內進行壓片，測量待測樣品前，采用2個空白樣和3個天冬氨酸樣校準。空白樣測量時氧氣流量設定為50 mL/min，其他樣品測量時氧氣流量設定為150 mL /min。蛋白質含量=含氮量×6.25。

氮溶指數(NSI)：蛋白樣品溶于去離子水使其濃度為1%(w/v)，取適量溶液20 ℃、10 000 ×g下離心10 min，采用Lowry法于500 nm 處測吸光值的方法測定氮溶指數。NSI=溶液中可溶性氮含量/溶液中總氮含量×100%。

蛋白質得率=蛋白樣品質量/原料(脫脂豆粕或SPC)質量×100%。

1.2.3 色澤的測定

采用色彩色差計測定色澤[9-10]，W表示白度，L*表示明度，a*和b*表示色度。a*正值表示偏紅，負值表示偏綠，b*正值表示偏黃，負值表示偏藍。W=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2，白度值越高，表明色澤越淺。

1.2.4 Zeta電位測定

根據Surh等[11]的方法，測定1%(質量分數)的蛋白溶液pH值從2.0至10.0的Zeta 電位。測定比色池規格為1 cm聚苯乙烯池，采用1對0.45 cm2鉑電極，間距0.4 cm，測定溫度25 ℃，溫度平衡時間2 min，重復測量3次計算平均值為測定值。

1.2.5 異黃酮含量的測定

測定方法參考GB/T 23788—2009[12]，略有改動。稱取50 mg蛋白樣品，用2.5 mL去離子水溶解，加入木瓜蛋白酶2 400 u/g，在50 ℃、pH 6.5條件下攪拌1 h。加入5 mL甲醇，1 mL 0.1 mol/L HCl，攪拌2 h，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上液相測定。

色譜條件：色譜柱C18，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm不銹鋼色譜柱。流動相A，乙腈；流動相B，磷酸水溶液(pH=3)。流速0.5 mL/min，波長260 nm，進樣量10 μL，梯度洗脫條件為A(%)/B(%)在0～10 min為12/88，10～23 min為18/82，23～30 min為24/76，30～55 min為30/70，55～56 min為80/20，56～60 min為12/88。

1.2.6 蛋白體外消化性測定

體外消化試驗參考王曉燕[13]的方法，適當修改。1 g蛋白樣品溶解于100 mL 0.1 mol/L HCl體系，按照胃蛋白酶與蛋白1∶100的比例37 ℃孵化10 min后加入酶，于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中反應60 min后取樣，加入等體積10%(質量分數)三氯乙酸沉淀未消化的蛋白，離心(5 000×g，10 min，20 ℃)后取上清液測定可溶性氮含量。胃蛋白酶消化產物調pH至7.0后加入胰蛋白酶，效價比同胃蛋白酶，恒溫反應120 min后同上取樣進行測定。

2 結果與討論

2.1 蛋白質純度、氮溶指數及得率

經不同處理得到的蛋白純度、氮溶指數及得率變化如圖1所示。

注：SPI，低溫脫脂豆粕堿溶酸沉法提取制備的大豆分離蛋白；SPC，商業功能性大豆濃縮蛋白；SPC-HTC，噴射蒸煮制備蛋白；SPC-HTC-UF，噴射蒸煮結合超濾技術制備蛋白。圖1 蛋白純度、氮溶指數和得率

噴射蒸煮結合超濾處理后，SPC的純度和NSI顯著提高，SPC、HTC和SPC-HTC-UF的純度分別為63.57%、81.62%和84.63%，相比于SPC的NSI(8.77%)，HTC和SPC-HTC-UF的NSI分別增加了17.06%和67.71%，其中超濾對氮溶指數的影響相對不明顯。異黃酮等小分子物質的去除是蛋白純度提高的一重要原因，HTC處理提高了NSI的結果與文獻報道的結論一致[3,5]，原因可能是SPC中難溶的蛋白在高溫、高壓、高剪切力作用下，蛋白分散性增加，粒度減小，從而提高蛋白的溶解性。大豆分離蛋白以其良好的功能性和高蛋白營養性被廣泛應用于食品工業中，功能性大豆濃縮蛋白與之相比，明顯的缺陷在于蛋白質質量分數低(70%左右)，溶解性低(NSI<10%)，使其一些功能性質比不上大豆分離蛋白[14-15]。從圖1可見，噴射蒸煮結合超濾技術制備的分離蛋白SPC-HTC-UF，蛋白純度和NSI均與SPI接近，這表明噴射蒸煮結合超濾技術可以改善SPC的某些品質，為拓寬其應用提供條件。SPC經噴射蒸煮處理后，超濾處理使得率下降。

2.2 蛋白的色澤

經不同處理得到的蛋白色澤如表1所示。

表1 蛋白的色澤

注：測量值是3次測定的平均值，上標a～c表示顯著性差異(P<0.05)。

各樣品的白度值有顯著性差異。噴射蒸煮制備的分離蛋白SPC-HTC 比SPC的白度值高，噴射蒸煮結合超濾技術制備的分離蛋白SPC-HTC-UF白度值最高，三者均比SPI高。白度值越高，樣品的色澤越淺。可能是因為醇洗、水熱處理及超濾去掉了大部分具有色澤的物質，還與糖基化程度、所得蛋白的純度、蛋白原料等密切相關。

2.3 Zeta電位變化

不同pH值條件下蛋白溶液的Zeta 電位變化如圖2所示。

圖2 zeta電位曲線

Zeta電位的絕對值越大，溶液體系越穩定[16]。Zeta電位是對顆粒之間相互排斥或吸引力的強度的度量，數值(正或負)越高，越傾向于溶解或分散；數值(正或負)越低，越傾向于凝結或凝聚。圖2中Zeta電位的變化一定程度反映了蛋白溶液體系的變化。在pH=4時，SPC的Zeta電位為負，經處理的SPC-HTC和SPC-HTC-UF為正，表明作用力從負的靜電排斥力轉為正的靜電排斥力。酸性條件下，SPC的最大Zeta電位值出現在pH 2，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的最大Zeta電位值都在pH 3，表明最強靜電排斥力出現的pH條件改變。同時，等電點也發生了明顯的向右偏移。一方面由于高溫處理過程中，蛋白肽鏈展開，有更多的帶電氨基酸富集在蛋白表面，同時一些小分子帶電物質被去除，使得Zeta電位發生變化。由圖2可看出，在pH 2～5的范圍內，噴射蒸煮及超濾技術處理的蛋白zeta電位的絕對值高于SPC。

2.4 異黃酮含量

大豆異黃酮的含量如圖3所示。

圖3 大豆蛋白的異黃酮含量

本試驗監測了在大豆中比較常見和含量較多的6種異黃酮，即大豆糖苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷和染料木素，以其總量計為大豆異黃酮的含量。通過標準樣品在液相色譜中峰面積與異黃酮含量的標準曲線公式，計算得到SPI中異黃酮含量約為0.72 mg/g，SPC中異黃酮含量約為0.15 mg/g，SPC-HTC中異黃酮含量約為0.10 mg/g，SPC-HTC-UF中異黃酮含量約為0.07 mg/g，經噴射蒸煮和超濾處理異黃酮含量均降低。各蛋白中的異黃酮類型都以苷元型的大豆異黃酮為主，這可能與糖苷型的異黃酮在加熱、浸泡、堿溶等過程中更容易損失或者轉化有關，苷元型的異黃酮溶解性差，與大豆蛋白具有更好的天然結合能力。盡管大豆中大豆異黃酮的含量不高，一般為128 mg/100 g，但對于雌激素水平較低的嬰兒來說，其劑量仍有風險，對于雌激素濃度更低的男嬰來說，大豆異黃酮對雌激素敏感系統可能有負面影響[17]。有研究表明，天然存在的大豆蛋白與異黃酮結合牢固，濃縮蛋白難以徹底去除異黃酮。因此，在豆基奶粉的應用上，可考慮使用水解蛋白，并在此基礎上再通過相關手段進一步降低異黃酮含量。

2.5 蛋白的消化特性

蛋白消化特性的變化如圖4。

圖4 蛋白體外消化的氮釋放量

經過胃蛋白酶的消化，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮釋放量分別為49.87%和50.23%，遠高于SPC(16.38%)，在胰蛋白酶消化的階段，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮釋放量為69.18%和69.88%，遠高于SPC(33.24%)，同SPC相比，SPC-HTC和SPC-HTC-UF表現了更容易被消化利用。

3 結論

本研究以商業功能性大豆濃縮蛋白為原料，采用120 ℃、90 s的噴射蒸煮處理及80 ku的超濾膜制備大豆分離蛋白，并對其進行表征。蛋白純度、氮溶指數、色澤、穩定性有較大改善，異黃酮的含量大大減少，且經噴射蒸煮及超濾后的蛋白具有較好的消化性。噴射蒸煮處理可以顯著提高所制備蛋白的溶解性，80 ku超濾膜可以有效降低大豆異黃酮的含量。

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