響應面法優化高溫芝麻粕蛋白的酶法提取工藝

王瑞萍 黃紀念 艾志錄

(河南農業大學食品科學技術學院1，鄭州 450002)(河南省農業科學院農副產品加工研究所2，鄭州 450002)

芝麻是我國四大油料之一，2009年我國芝麻播種面積為33.7萬公頃，產量達到31.8萬t[1]。芝麻大部分用于制油，制油后芝麻餅粕蛋白含量為40%～46%[2]。芝麻蛋白是一種優質的植物蛋白質資源，其氨基酸組成合理，必需氨基酸含量豐富[3]。為了使芝麻香油產生獨特風味，芝麻在制油前都要經過高溫焙炒，而焙炒使芝麻蛋白質發生熱變性，芝麻餅粕中的蛋白質溶解性降低，增大了蛋白提取和利用的難度，故高溫芝麻粕目前大多作為肥料和飼料使用，附加值低，造成了資源浪費。因此有必要對高溫芝麻粕中蛋白的提取和應用做更深一步研究，提高其經濟利用價值。

目前油料植物蛋白的提取多用堿溶酸沉法[4-5]，但堿溶酸沉使用化學試劑量大，污染環境并增加設備投資，而酶法提取植物蛋白已有一定的研究基礎，該法條件溫和、綠色節能、產品品質好并且應用前景廣泛[6-7]。目前有研究水酶法提取冷榨芝麻油和蛋白[8-9]，但將酶法提取應用于高溫芝麻粕蛋白提取的研究尚未見報道。本研究按 pH分類，評價酸性蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)、中性蛋白酶(胰蛋白酶、Neutrase、復合蛋白酶Protamex)和堿性蛋白酶(Alcalase、堿性蛋白酶2709)3大類8種蛋白酶提取高溫壓榨芝麻餅中蛋白的效率，篩選出優勢蛋白酶種類，研究此種蛋白酶酶解對高溫芝麻粕蛋白溶出率的影響，采用響應面法(response surface methodology，RSM)優化提取工藝，考察各工藝參數對高溫芝麻粕蛋白溶出率的影響，為規模化提取高溫芝麻粕蛋白提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫芝麻粕：實驗室自制；福林酚試劑、堿性蛋白酶Alcalase(酶活 94 400 U/mL)、中性蛋白酶Neutrase(酶活 87 500 U/mL)、復合蛋白酶Protamex(酶活 87 400 U/g)：美國Sigma公司；堿性蛋白酶2709(酶活 108 666 U/g)、菠蘿蛋白酶(酶活 55 840 U/g)：上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶(酶活 85 400 U/g)：北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶(酶活 44 160 U/g)、胃蛋白酶(酶活 97 200 U/g)：北京中生瑞泰科技有限公司；其他藥品和試劑均為國產分析純。

K—05型自動定氮儀：上海晟聲儀器有限公司；DGX-9243型鼓風干燥箱：上海福瑪實驗設備有限公司；DL-5-B離心機：上海安亭科學儀器廠；TGL-16A離心機：金壇市億通電子有限公司；XS205電子天平、pH計：瑞士梅特勒-托利多公司； DF-101S集熱磁力加熱攪拌器：金壇市醫療儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 高溫芝麻粕蛋白酶解法提取工藝流程

高溫芝麻粕→石油醚回流脫脂后烘干→研磨粉碎過60目篩→稱取樣品→加入蒸餾水分散調節至適宜pH→加蛋白酶酶解→滅酶→離心取上清液→測定蛋白溶出率

1.2.2 測定方法

蛋白測定(凱氏定氮法GB 5009.5—2010，換算系數5.3)；灰分測定(550 ℃灰化法 GB/T 5505—2008)；水分測定(105 ℃恒重法 GB 5512—1985)；粗脂肪測定(索氏抽提法 GB/T 14772—2008)；蛋白酶酶活標定(福林酚法 SB/T 10317—1999)，其中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活測定 pH 分別為 5、7、10。

1.2.3 蛋白溶出率的計算

按照凱氏定氮法測定高溫芝麻粕及酶解液中的蛋白含量，酶解后芝麻蛋白溶出率采用以下公式計算:

蛋白溶出率=(上清液中水溶性蛋白質量/原料中蛋白質量)×100%

1.2.4 酶增溶的蛋白溶出率的計算

酶增溶的蛋白溶出率=(酶法蛋白溶出率-對照蛋白溶出率)×100%

1.2.5 酶法提取芝麻粕蛋白工藝研究

1.2.5.1 蛋白酶種類和酶解pH對芝麻蛋白提取的影響

稱取10.0 g高溫芝麻粕粉于三角瓶中，采用酶解溫度40 ℃，液料比為 10∶1(mL/g，下同)，加酶量為100 U/g(以原料質量計，下同)，酶解2 h。試驗中，由于蛋白酶的最適pH 不同，結合前人研究和不同蛋白酶的特性，分別采用不同 pH條件酶解；對照組為采用相同試驗條件，未加入酶的體系進行試驗，隨后測定上清液中蛋白質量，計算蛋白溶出率，采用SPSS 20.0進行數據的分析處理，分析不同蛋白酶對芝麻蛋白溶出率的影響。

1.2.5.2 高溫芝麻粕蛋白堿性蛋白酶2709酶解單因素試驗

稱取10.0 g高溫芝麻粕粉于三角瓶中，以加酶量(0、50、100、150、200、250 U/g)，酶解時間(1、2、3、4、5 h)，溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)，液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)和酶解pH值(8、9、10、11、12)等5個工藝參數為考察因素，以蛋白溶出率為指標，對篩選出的蛋白酶進行單因素試驗，分析各因素對芝麻蛋白溶出率的影響。

1.2.5.3 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計的自變量，采取固定酶解時間，選擇酶解溫度(A)、加酶量(B)、液料比(C)和提取pH值(D)為自變量，以蛋白質溶出率(Y)為響應值，利用Design-Expert 7.0 Trial軟件進行響應曲面分析優化提取條件。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類和酶解pH對芝麻蛋白提取的影響

由表1可以看出，酶法提取芝麻蛋白時，添加不同種類的酶對芝麻蛋白溶出率均有增加作用，可能由于酶法提取芝麻蛋白時，蛋白酶部分酶解芝麻蛋白，打破了原有體系的平衡，從而推動固相中的蛋白溶入到溶液中，此時上清液蛋白包括被酶解后增溶的部分蛋白和自身溶解的蛋白，提高了蛋白溶出率[10]。酶法提取芝麻蛋白的效果受酶種類影響明顯，堿性蛋白酶2709 提高蛋白溶出率效果較好，明顯高于堿溶酸沉法的50.92%[11]。同時，同一種酶在不同pH 值下的溶出率均有顯著差異(P<0.05) 。pH 對酶解芝麻蛋白的影響主要通過2個途徑：蛋白酶的活性和芝麻蛋白的溶解度。芝麻蛋白在溶液中的溶解度受溶液 pH 影響顯著(見表1) ，酸性條件下溶解度小，堿性條件下溶解度大，這也是堿性蛋白酶和中性蛋白酶提取芝麻蛋白獲得較好結果的原因之一。以蛋白溶出率為評價指標，采用堿性蛋白酶2709作為提取芝麻蛋白的工具酶進行下一步試驗。

表1 不同蛋白酶及酶解pH對芝麻蛋白提取的影響/%

注: 0.05為顯著水平。同一酶種中，相同字母項表示無顯著差異；對照同一列中，相同字母項表示無顯著差異。

2.2 高溫芝麻粕蛋白堿性蛋白酶2709酶解單因素試驗

2.2.1 加酶量對蛋白質溶出率的影響

在pH 10，液料比10∶1，溫度40 ℃，酶解時間2 h的條件下，考察加酶量對芝麻蛋白溶出率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，隨著加酶量增加，蛋白質溶出率增加，但在加酶量大于100 U/g后溶出率增加趨勢不明顯。加酶量過大會使成本增加，且可能使蛋白被過度酶解生成短肽，因此選擇加酶量為100 U/g。

圖1 加酶量對蛋白溶出率的影響

2.2.2 酶解時間對蛋白質溶出率的影響

在加酶量100 U/g、液料比10∶1、pH 10、溫度40 ℃的條件下，考察酶解時間對芝麻蛋白溶出率的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，蛋白質溶出率隨著酶解時間的延長而增加，從1 h到2 h溶出率增加顯著，之后增加緩慢。2 h以后酶解時間增加蛋白質溶出率不再升高，同時考慮到酶解時間過長，會消耗較多的熱能，增加生產成本，因此酶解時間選擇為2 h。

圖2 酶解時間對蛋白溶出率的影響

2.2.3 酶解提取溫度對蛋白質溶出率的影響

在pH 10、加酶量100 U/g、液料比10∶1、酶解時間2 h的條件下，研究酶解溫度對芝麻蛋白溶出率的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，酶解溫度在55 ℃以下，蛋白質的溶出率隨著酶解溫度的升高而增加，超過55 ℃蛋白質溶出率下降，因為過高的溫度會使蛋白酶活性降低。酶解溫度超過50 ℃后提高溫度蛋白溶出率增加不明顯，溫度過高使酶解物的顏色加深，高溫也會消耗過多能源增加生產成本，因此選擇酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對蛋白溶出率的影響

2.2.4 液料比對蛋白質溶出率的影響

在pH為10、加酶量100 U/g、溫度50 ℃、酶解時間2 h條件下，研究不同液料比對蛋白質溶出率的影響，結果見圖4。由圖4可知，隨著液料比的升高，蛋白溶出率先升高后下降，在15∶1時最高。但當液料比增加到一定程度，底物濃度過低，蛋白酶不能充分作用，因此選擇液料比為15∶1。

圖4 液料比對蛋白溶出率的影響

2.2.5 酶解pH對蛋白質溶出率的影響

在加酶量100 U/g、溫度50 ℃、酶解時間2 h、液料比15∶1的條件下，考察不同酶解pH值對蛋白質溶出率的影響，結果如圖5所示。從圖5可以看出，在酶解pH低于11時蛋白質溶出率隨著pH值的增加而提高，這是由于溶液pH 值的變化改變了蛋白質的帶電情況，在堿性條件下，蛋白質帶負電荷，蛋白質的溶解度增加，利于蛋白溶出率提高[11]，pH 值大于11時溶出率有所降低，過高的pH會影響到蛋白酶的活性，因此選擇11為最適的酶解pH值。

圖5 酶解pH對蛋白溶出率的影響

2.3 響應面法優化酶解工藝

基于單因素試驗結果，為了提高試驗的可靠性，根據Box-Behnken試驗設計，酶解時間固定為2 h，以單因素試驗的最優值為中間值，采用四因素三水平的試驗設計，以芝麻蛋白溶出率為響應值，確定最佳酶解工藝參數，結果見表2、表3。利用Design-Expert 7.0 Trial 軟件對響應面回歸方程進行方差分析和回歸模型系數的顯著性檢驗，結果見表4。

表2 響應面分析因素與水平表

表3 Box-Behnken試驗設計及結果

表3(續)

表4 方差分析表

注：**，P<0.01表示差異極顯著，*，P<0.05表示差異顯著。

由表4可以看出該模型回歸極顯著，經過二次多項回歸擬合后，得到蛋白溶出率(Y)與溫度(A)、加酶量(B)、液料比 (C)、pH (D)4個因素的二次回歸方程為：

Y=69.01-1.81A+3.07B+3.96C+1.12D+1.89AB+1.64AC-0.78AD-2.75BC+1.91BD-3.49CD-12.88A2-3.18B2-9.35C2-7.48D2

其中該方程一次項B、C與二次項A2、C2、D2表現出了極顯著水平，交互項CD與二次項B2對試驗結果的影響達到了顯著水平，說明各因素對蛋白溶出率的影響不是簡單的線性關系；失擬項P=0.075 4，不顯著，該回歸模型R2=0.931 5，說明模型擬合程度良好，能夠較準確的預測和分析實際情況。所選的各因素水平范圍內，對試驗結果的影響次序為C>B>A>D，即液料比>加酶量>溫度> pH。pH值在試驗所選水平范圍內未對試驗結果產生顯著影響，但是其與液料比的交互作用對試驗結果影響較大。方程的二次項4個因素的特征值全為負值，表明該模型有穩定性最大值[12]。pH值與液料比交互作用對芝麻蛋白溶出率的影響作用顯著，根據回歸分析結果做pH值與液料比交互項的等高線圖和3D曲面圖，見圖6。由圖6可知pH值與液料比交互項的等高線圖顏色對比強烈，說明交互作用顯著[13]，等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[14]。在所選范圍內存在極點，即等高線最小橢圓的中心點(5點)，也是響應面的最高點。

圖6 pH與液料比對蛋白溶出率的交互影響

通過對響應面優化工藝結果擬合分析得出，在酶解時間2 h的條件下，酶解芝麻蛋白的最優工藝參數為：酶解溫度49.83 ℃，pH 11.11，液料比15.61∶1，加酶量122.60 U/g，在此條件下，芝麻蛋白的理論溶出率為70.03%。

2.4 試驗驗證

為了檢驗響應面模型的有效性和可靠性，根據優化得到最佳條件，考慮操作的可行性，修正了最佳蛋白酶解條件：在酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，pH 11，液料比16∶1，加酶量125 U/g的試驗條件下進行驗證試驗，得到蛋白溶出率均值為70.36%，與模型理論預測值70.03%基本吻合。說明該方程與實際情況擬合很好，試驗結果較為理想，證明應用響應面優化條件來提高芝麻蛋白溶出率的方法可行。

3 討論

高溫芝麻餅粕中蛋白變性程度高，溶解性低，要提取其中的蛋白需要將其溶出，再進一步分離純化等。經過前期試驗探索，利用酶法提取高溫芝麻餅粕中的蛋白較為可行。影響酶法提取高溫粕蛋白的因素主要有酶的種類、加酶量、酶解pH、液料比等因素。合適工具酶的選擇建立在試驗基礎上，以蛋白溶出率為評價指標，得到了提取效果較好的堿性蛋白酶2709。堿性蛋白酶2709是2709枯草桿菌經過深層發酵、提取精制成的一種蛋白酶，對底物有高度專一性，具有強水解能力、耐堿能力[16]，其價格相對低廉，從經濟成本考慮也是理想選擇。

加酶量的選擇在蛋白提取工藝中尤為重要，有限酶解幫助蛋白酶切斷芝麻蛋白的肽鏈，提高溶解性，促進芝麻蛋白提取；但加酶量太大會使芝麻蛋白大量被水解為短肽，與其他水溶性雜質混合，難以提取分離。因此本研究中酶解工藝優化時，選擇的加酶量遠遠小于已有報道中制備功能性多肽的加酶量9 600 U/g[17]，不足以生成大量多肽。堿性蛋白酶的作用位點主要是丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸等，由于芝麻蛋白中上述氨基酸殘基數目有限，也會限制多肽的生成。

酶解pH也是響應面試驗中對蛋白溶出率影響顯著的重要因素。當極端堿性pH時，部分埋藏在蛋白質分子內部的羥基、酚羥基和巰基離子化并暴露至水相環境中，造成肽鏈散開[18]。同時高堿性條件下較高溫度會使芝麻蛋白部分氨基酸產生消旋現象生成D—氨基酸，影響到芝麻蛋白產品的營養品質[19]，生產中可結合實際需要降低提取pH。下一步研究可對酶解液進行超濾脫鹽，提取出的蛋白適于應用在飲料工業中或者酶解制備功能性多肽。

4 結論

通過系統分析8種蛋白酶在不同pH值條件下對酶法提取高溫芝麻餅中蛋白的效果表明，使用堿性蛋白酶2709的酶解效果較好，蛋白溶出率達到60%以上。采用單因素試驗及響應面法優化酶解條件，利用Design-Expert軟件對試驗數據進行分析擬合，得到堿性蛋白酶2709酶解高溫芝麻粕蛋白的數學模型，固定酶解時間2 h，最佳工藝條件為酶解溫度50 ℃，pH 11，液料比16∶1，加酶量125 U/g，在此工藝條件下芝麻蛋白溶出率為70.36%。

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