Gli1 和OPN 在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義

汪長健 楊關根 丁 菁 廖秀軍

研究發現Hedgehog 信號通路異常激活可導致人類多種腫瘤的發生，包括基底細胞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等［1］。通路的激活可導致腦膠質瘤相關癌基因(Gli1)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP - 6)、細胞周期蛋白D2(cyclin D2)骨橋蛋白(OPN)等下游靶基因的轉錄，促進細胞向惡性生物學行為轉化，并最終發生腫瘤［2］。Hedgehog 信號通路與結直腸癌的關系目前尚無定論，在人類一些大腸癌細胞系如CaCo2、HT29 以及SW480 中，可以檢測到SHH、PTCH、SMO、SUFU 及Gli 的表達，而在Colo320 中未檢測到Gli 等關鍵蛋白的表達［3，4］。本實驗以結直腸癌標本為研究對象，觀察Hedgehog 信號通路中Gli1 及其下游靶基因OPN 在結直腸癌組織中的表達，分析二者之間的相關性，進一步探討它們的表達與結直腸癌臨床病理因素之間的關系。

材料與方法

1.材料:收集2009 年5 月～2010 年12 月杭州市第三人民醫院肛腸科行結直腸癌根治手術并具有完整臨床資料的病理標本76 例，所有患者術前均未接受化療或放療。其中男性為40 例，女性36 例;患者年齡39 ～81 歲，中位年齡54.5 歲。Dukes 分期:A 期11 例;B 期20 例，C 期31 例、D 期14 例，組織學分型:高分化13 例、中21 分化、低分化36 例、未分化6例。結腸癌33，直腸癌43 例。取距癌組織10cm 以上無浸潤的正常大腸組織為對照，所有對照標本經HE 染色鏡下未見腫瘤細胞。

2.試劑與方法:一抗兔抗人Gli1 抗體和鼠抗人OPN 單克隆抗體試劑盒均購自美國Santa Cruz 公司。二抗購于杭州隆基生物技術有限公司。免疫組化試劑盒購自北京中山生物科技公司。所有標本均以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，每例以5μm 厚度連續切片，用于免疫組化染色。應用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法，操作步驟按試劑盒提示進行，切片經處理后進行HE 染色和免疫組化染色。Gli1 的工作濃度為1∶150，OPN 的工作濃度為1∶200。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，用已知的Gli1 和OPN 陽性的乳腺癌切片作陽性對照。

3.結果判定:由兩名病理科醫師獨立閱片，對切片染色結果進行判定。Gli1 蛋白主要定位于細胞質，部分表達于細胞核，為棕黃色顆粒狀。OPN 蛋白主要定位于細胞質，部分表達于細胞膜，為黃色或棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取10 個高倍鏡視野(×400)，根據陽性細胞百分率及顯色深淺進行分類處理。其中染色強度:0.無染色;1.淡黃色;2.棕黃色;3.棕褐色。后按陽性細胞所占百分比記分:＜5%為0 分，5% ～25%為1 分，25% ～50%為2 分，50% ～75%為3 分，＞75%為4 分;兩項分值相加為每張切片組織染色積分，＞3 分記為陽性，≤3 分記為陰性。

4.統計學方法:使用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學處理，計數資料的比較采用χ2檢驗，Gli1 和OPN 表達的相關性采用Spearman 相關分析方法，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.Gli1 蛋白在結直腸癌組織和正常組織中的表達:Gli1 蛋白在76 例結直腸癌中有33 例呈陽性表達，表達率為43.4%。在23 例正常組織中3 例陽性表達，表達率為13.0%，Gli1 在癌組織中表達高于正常組織，二者之間差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.OPN 蛋白在結直腸癌組織和正常組織中的表達:OPN 蛋白在76 例結直腸癌中有39 例呈陽性表達，表達率為51.3%。在23 例正常組織中4 例陽性表達，表達率為17.4%，OPN 在癌組織中表達高于正常組織，二者之間差異有統計學意義(P ＜0.05)。

3.Gli1 和OPN 蛋白表達與結直腸癌的臨床病理特征的關系:Gli1 和OPN 的表達均與性別、年齡、腫瘤大小無關(P ＞0.05)，與淋巴結是否轉移、Dukes 分期有關(P ＜0.05)，在伴有淋巴結轉移和分期較晚的患者，Gli1 和OPN 的表達均顯示出有統計學意義的升高。OPN 的表達與腫瘤的分化程度無關，而Gli1則顯示出較強的相關性(P ＜0.01)，組織學分化越差，Gli1 表達越高(表1)。

表1 Gli1 和OPN 蛋白的表達與結直腸癌的臨床病理之間的關系

4.Gli1 和OPN 之間表達的相關性:采用Spearman等級相關分析:Gli1 與OPN 蛋白在結直腸癌組織中的表達呈正相關(r=0.312，P ＜0.01，表2)。

討 論

Hedgehog 信號通路是生物胚胎發育過程中重要的信號轉導系統之一，它高度保守，一旦果蠅的該通路基因發生突變，其幼蟲形似刺猬(Hedgehog)，因此得名。Gli1 是Hedgehog 信號通路中激發下游轉錄起始的關鍵分子，當細胞膜外分泌型配體(Shh/Ihh/Dhh)與跨膜受體蛋白Ptch 結合，促使其解除對另一跨膜蛋白Smo 的抑制作用，從而導致Gli1 進入核內啟動靶基因的轉錄［5］。人類的多種先天性疾病如氣管食管瘺、肛門閉鎖和腸道畸形等都與Hedgehog 信號通路中某些基因的突變有關。研究證明Hedgehog的異?；罨c腫瘤的發生發展關系密切，通過抑制該通路的激活有可能成為腫瘤治療的新途徑。關于Gli1 在結直腸癌中的作用存在爭議，有研究證實Hedgehog 信號通路中的效應分子Shh、SMO、Gli1 在結直腸癌組織中高表達;而在伴有Wnt 信號通路活化的結腸癌細胞和組織中，Gli1 則處于沉默狀態，且通過轉染Gli1 基因可抑制腸癌細胞的增殖［6，7］。本研究結果發現，Gli1 在結直腸癌組織中高表達，其陽性率為43.4%，而正常結腸組織中為13.0%，說明Gli1 的高表達參與了結直腸癌的發生。進一步分析提示Gli1 的表達與腫瘤的組織學分型、病理分期及淋巴結是否轉移有關，而與患者年齡、性別、腫瘤大小無關，組織學分化差、病理分期晚和有淋巴結轉移的患者Gli1 陽性表達率高。據此可認為Hedgehog 信號通路在結直腸癌中是被激活的，效應分子Gli1 促進了正常結直腸組織向腫瘤的演變。

表2 Gli1 和OPN 之間表達的相關性

OPN 是一種分泌型磷酸化糖蛋白，分子質量約(41 ～72)kDa，富含與細胞黏附功能有關的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，廣泛存在于骨組織、脈管系統、腎臟、炎癥細胞和分泌型上皮細胞，同時也在多種腫瘤組織中呈高表達，參與惡性腫瘤的侵襲和轉移過程，并與預后密切相關。已有研究證實OPNmRNA 在人類結直腸癌細胞株和組織中表達上調，且OPNmRNA 的表達狀態為結直腸癌患者的獨立預后因素［8］。通過RNA 干擾可抑制大腸癌細胞的增殖、侵襲、黏附和趨化能力，并起到放療增敏作用［9］。Das 通過檢測基底細胞癌組織中Gli1 和OPN 的表達發現，相對于局限性基底細胞癌，伴有轉移灶的患者組織中二者表達明顯升高，而且當Hedgehog 信號通路活化時，OPN 的表達也呈現上調狀態;當該信號通路被特異性抑制劑Cyclopamine 阻斷時，OPN 的表達隨即下調。由此推測OPN 為Hedeghog 信號通路下游的效應蛋白，由Gli1 介導的OPN 上調可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為［10］。本組結直腸癌OPN 陽性表達率為51.3%，結直腸癌組OPN 表達的陽性率較結正常結直腸組織高。OPN 表達與年齡、性別、腫瘤大小、組織學分化無關，但在淋巴結有轉移、病理分期晚者表達明顯高于淋巴結無轉移、病理分期早者，差異均有統計學意義，提示OPN在結直腸癌發生發展中發揮重要作用。

雙變量相關性分析表明，OPN 和Gli1 二者在結直腸癌組織中的表達正相關，證實了Gli1 的上調可促進其下游效應蛋白OPN 的表達，二者共同影響結直腸癌細胞的惡性增殖和浸潤能力。至于Gli1 通過何種途徑調控OPN 尚待進一步研究予以證實。

本研究證實了Hedgehog 信號通路在大腸癌中是激活的，Gli1 和OPN 都呈高表達，參與了結直腸癌的發生以及浸潤和轉移過程，二者在結直腸癌中的表達具有協同作用。因此檢測Gli1 和OPN 可能有助于判斷結直腸癌的生物學行為，為患者預后提供參考，并對結直腸癌的早期發現和靶向治療帶來新的思路。

1 Rubin LL，De Sauvage FJ. Targeting the Hedgehog pathway in cancer［J］. Nat Rev Drug Discov，2006，5(12):1026 -1033

2 Yoon JW，Kita Y，Frank DJ，et al. Gene expression profiling leads to identification of GLI1 -binding elements in target genes and a role for multiple downstream pathways in GLI1 - induced cell transformation［J］.J Biol Chem，2002，277(7):5548 -5555

3 Qualtrough D，Buda A，Gaffield W，et al. Hedgehog signalling in colorectal tumour cells:induction of apoptosis with cyclopamine treatment［J］.Int J Cancer，2004，110(6):831 -837

4 Chatel G，Ganeff C，Boussif N，et al. Hedgehog signaling pathway is inactive in colorectal cancer cell lines［J］. Int J Cancer，2007，121(12):2622 -2627

5 Ingham PW. Transducing Hedgehog:the story so far.［J］. EMBO J，1998，17(13):3505 -3511

6 Wang H，Li YY，Wu YY，et al. Expression and clinical significance of hedgehog signaling pathway related components in colorectal cancer［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(5):2319 -2324

7 Akiyoshi T，Nakamura M，Koga K，et al. Gli1，downregulated in colorectal cancers，inhibits proliferation of colon cancer cells involving Wnt signalling activation［J］.Gut，2006，55(7):991 -999

8 Li KW，Hong W，Shu WZ，et al. The potential of osteopontin as a therapeutic target for human colorectal cancer［J］.J Gastrointest Surg，2011，15(4):652 -659

9 Li KW，Hong W，Shu WZ. Clinical significance of the upregulated osteopontin mRNA expression in human colorectal cancer［J］. J Gastrointest Surg，2010，14(1):74 -81

10 Das S，Harris LG，Metge BJ，et al. The hedgehog pathway transcription factor GLI1 promotes malignant behavior of cancer cells by up -regulating osteopontin［J］. J Biol Chem，2009，284(34):22888 -22897