煙草青枯病生防菌YH-22抗病機制的初步研究

楊 歡，余 君，王昌軍，李進平，施河麗，譚 軍，李錫宏，王 瑞，徐迪紅，陳守文*

（1.華中農業大學農業微生物國家重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省煙草科研所，武漢 430030；3.湖北省煙草公司恩施州公司科技中心，湖北 恩施 445000）

煙草是一種重要的農業經濟作物，在我國多個地方都有種植區域，然而一些細菌性、真菌性與病毒病害等給煙葉生產帶來了巨大的損失，嚴重制約了高效農業的發展。據不完全統計，煙草花葉病、赤星病、黑脛病、青枯病和根結線蟲病5種煙草主要病害造成的產量損失為4.8億多公斤，產值損失高達 15億多元[1]。煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細菌性病害，可浸染煙草、馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒等54個科的450多種植物[2]，以危害根、莖為主[3]，是典型的維管束病害。目前，青枯病防治措施主要有農業防治和化學防治等。其中，抗病品種連作會引起作物抗性衰退[4]，防治效果差，而化學農藥殘留帶來了嚴重的環境污染。相對于傳統防治方法而言，生物防治因其環境友好型、防治效果顯著等特點，近年來成為植物病害防治的研究熱點。生物防治是利用對土傳病害有拮抗效果的微生物或其代謝物，抑制病原微生物的生長，達到防治土傳病害發生的目的[5]，是一種環保無公害的方法。

微生物生防機制主要包括競爭生態位點和營養、產生抗菌物質、誘導抗性和促進植物生長等。對于一個理想的生防菌而言，既要具有產生有效拮抗病原菌因子的能力，又要很好的定殖于植株體內或根部以占據有利的生態位[6]。因此想要獲得較好的病害防效，必須考慮生防菌株在植物體內的定殖能力。王靜等[7]、張秀玉等[8]從煙草根際土壤分離到一株枯草芽胞桿菌SH7，分泌的抗菌蛋白對青枯病菌具有良好的抑制作用。

本研究供試生防菌解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YH-22分離篩選自恩施州烤煙種植區域的健康煙葉，對煙草青枯病有一定防效。以利福平抗性誘導，獲得利福平抗性株，研究了該菌株在煙草根際土壤和組織體內的定殖情況。為了進一步探討該菌株的抗病機制，對其抗菌物質的理化性質進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及煙草

生防菌株解淀粉芽胞桿菌YH-22（篩選自健康煙草葉片）；煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌9-2、煙草K326均由湖北省煙草科學研究院提供。

1.2 培養基

NA液體培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，1000 mL水，pH 7.2～7.4；TTC固體培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，紅四氮唑0.10 g，1000 mL水，瓊脂粉18.0，pH 7.2～7.4；紅四氮唑溶液（TTC）：0.10 g紅四氮唑溶于10 mL蒸餾水配成母液，使用前用滅菌的0.22 μm無機濾膜過濾，100倍稀釋用；LB液體培養基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，1000 mL水，pH 7.0～7.5，固體培養基加入1.8%瓊脂；發酵培養基：玉米淀粉 15 g，豆粕 50 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，MnSO4·H2O 0.01 g，1000 mL水，pH 7.5。

1.3 利福平抗性誘導

先將篩選的拮抗菌株YH-22按2%的接種量接入含有5 μg/mL利福平的LB中，37 ℃、180 r/min振蕩培養24 h，然后接入含10 μg/mL利福平的LB中，以此逐級轉接于含 20、50、100、150、200、300、400 μg/mL利福平的LB中進行抗性誘導。同時驗證抗400 μg/mL利福平菌株抗利福平能力和抗青枯病菌活性的穩定性。

1.4 盆栽定殖試驗

2012年10月煙草育苗，12月份將2個月苗齡的煙草移入盆缽中，盆栽土壤使用前每隔12 h間歇滅菌1次，每次121 ℃、30 min，然后80 ℃烘干，共滅菌、烘干3次。盆缽置于溫室中，溫室培養溫度為28～30 ℃，相對濕度為65%，16 h光照（白天）、8 h黑暗（晚上）。12月中旬，將菌株YH-22對煙苗進行灌根100 mL（接菌濃度為107CFU/mL），分別于灌根后第4、16、23、30、60天分別取樣（根際土壤、根圍土壤、根、莖）檢測拮抗菌的定殖情況：采用LB抗性平板，利福平濃度為100 μg/mL。每個處理做3盆，3次重復。取10 g土樣于90 mL無菌生理鹽水，做系列稀釋10-3、10-4、10-5，同時分別稱取20 g根圍土壤，風干后測量其pH；根（莖）沖洗干凈后風干，進行表面消毒（75%無水乙醇浸泡10 s，10% NaClO浸泡5 min，無菌生理鹽水洗滌 3次），于滅菌研缽中加適量水研磨成組織液后稀釋涂布于 LB抗性平板，37 ℃培養箱倒置培養12～24 h，記錄菌落數。

1.5 平板對峙實驗

煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌接入NA液體培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養12～16 h，以5%體積比加入冷卻至60 ℃左右的TTC固體培養基得到含菌培養基；拮抗菌YH-22接入LB液體培養基，37 ℃、180 r/min振蕩培養10～12 h后轉接于發酵培養基，發酵48 h，8000 r/min離心15 min收集上清。在含菌培養基中打孔，每孔加入50 μL檢測液，檢測其抗煙草青枯病原菌活性。

1.6 抗菌物質理化性質初步研究

有機溶劑溶解性[9]：將發酵液離心上清分別與氯仿、乙酸乙酯等量混合后震蕩 1 h，靜置萃取30 min后，分別取50 μL萃取相和萃余相加入含菌TTC平板的孔中，檢測抗菌活性。

熱穩定性[10]：YH-22的36 h的發酵液離心上清除菌后，分別在80 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃處理30 min，放置至室溫，0.22 μm濾膜過濾除菌，測定對煙草青枯病原菌的拮抗活性。

酸堿穩定性[11]：用 3 mol/L鹽酸或 NaOH將YH-22發酵液離心上清pH分別調至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，置于4 ℃冰箱24 h，然后回調pH至7.0左右，0.22 μm濾膜過濾除菌，分別測定濾液對煙草青枯病原菌的拮抗活性。

酶的耐受性[12-13]：將YH-22發酵液離心上清分別加入1 mg/L的中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，置于37 ℃水浴保溫1 h后，80 ℃水浴3 min終止反應，0.22 μm濾膜過濾除菌，分別測定濾液對煙草青枯病原菌的拮抗活性。

紫外線穩定性[14]：將YH-22發酵液離心上清置于紫外燈（8 w）下照射30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，后測定濾液對煙草青枯病原菌的拮抗活性。酸沉淀、排油特性、液滴坍塌性具體方法均見參考文獻[15]。

1.7 統計分析方法

抗菌物質理化性質的實驗數據結果采用SPSS18.0軟件的 Duncan檢驗進行顯著差異性（p＜0.05）分析。

2 結 果

2.1 利福平抗性誘導

將菌株YH-22逐級接入含有5、10、25、50、100、200、300、400 μg/mL的LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養12～24 h，最終獲得了抗400 μg/mL利福平的菌株，傳代10代后，其抗菌作用與原始菌株接近，利福平抗性能力和第一代抗性誘導菌株保持一樣。

2.2 盆栽定殖能力檢測

將抗400 μg/mL利福平的抗性菌株YH-22接入LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養12～16 h得種子液，以2%接種量接入發酵培養基，相同培養條件下培養24 h，得菌懸液，用灌根法接種于團棵期的煙草K326植株根部，分別在灌根接種后的第 0、4、16、23、30、60天取樣檢測 YH-22的存活量，其生長動態結果見表1。

接種后第4天，根和莖均未檢測到菌株。第16天，根里開始檢測到菌株，后期菌數基本保持穩定，維持在103CFU/g鮮質量。在第23天，莖里開始檢測到菌株。第 30天，根和莖中拮抗菌大增，分別增加了4.0倍和6.8倍，說明煙草正處于旺長期，合成了大量營養物質，為定殖的拮抗菌提供了生長繁殖所需的營養來源。第 60天，根和莖的菌株數量銳減，分別降低了70.0%和98.4%，說明煙草趨于成熟，合成的營養物質較少，使得拮抗菌株因缺少營養來源而繁殖力降低。而土壤中拮抗菌的菌量保持在105CFU/g土壤，從第4～30天，拮抗菌株數量呈現增長的趨勢，第60天，根際土壤和根圍土壤的菌數分別降低到第30天的58.5%和82.2%，這和植株中定殖的拮抗菌數量的變化相似。植株中菌量為102～103CFU/g組織，菌數并不高，可能原因是拮抗菌灌根接種濃度（107CFU/mL，100 mL）較低，這與易有金[16]研究中菌株在107CFU/mL接種時在煙草體內未被檢測到的結果相類似。

表1 YH-22菌株在煙草K326上的定殖能力檢測Table 1 The detection of the colonization ability of strain YH-22 in tobacco K326

2.3 抗菌物部分理化性質

2.3.1 有機溶劑溶解性 用氯仿、乙酸乙酯與發酵液離心上清振蕩混合1 h后靜置萃取30 min后，分別檢測萃取相和萃余相的抗菌活性。萃取液均無抗菌活性，萃余相均有抗菌活性，且萃取相的抑菌活性和未經有機溶劑處理的上清液相差不大，說明該抗菌物質為水溶性物質而不溶于有機溶劑氯仿和乙酸乙酯[13]，結果如圖1所示。

圖1 抗菌物質的有機溶劑溶解性Fig.1 The antibactiral substances solubility in organic solvent

2.3.2 穩定性 將發酵離心上清過濾除菌后，分別經不同溫度、pH、酶和紫外線處理，放置至室溫，測定青枯病菌拮抗活性，結果如圖2所示。圖 2A中，在80 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃處理30 min后，活性分別保留為71.0%、33.8%、9.7%、2.7%，說明該拮抗活性組分具有一定的耐熱性；圖2B中，抗菌物質在pH 4～10下穩定，pH 8時活性最高，抑菌圈為6.50 mm；圖2C中，抗菌物質經中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，活性分別保留有60.3%、65.7%和95.6%，前二者酶處理活性有所降低，說明該抗菌物質中含有蛋白成分，這和齊愛勇等[9]的研究結果類似，他們從枯草芽胞桿菌B21的發酵離心上清中分離純化到43.0 KD的抗菌蛋白，對胰蛋白酶和蛋白酶K部分敏感；圖2D中，上清經紫外線照射后，活性保留93.0%。

圖2 抗菌物質的穩定性Fig.2 Stability of antibactiral substances by different treatments

2.3.3 酸沉淀 將發酵液離心上清在 pH 2.0的條件下進行沉淀，離心收集沉淀，用甲醇溶解，檢測甲醇萃取液的拮抗活性，發現酸沉淀后的上清和甲醇本身沒有拮抗活性，而甲醇溶解的沉淀拮抗活性較強，結果如圖3所示，該抗菌物質大部分能在pH 2.0沉淀下來，這是因為抗菌蛋白或脂肽類物質在強酸條件下會變性而形成絮狀物沉積下來，說明該抗菌物質為蛋白類或脂肽類物質，而甲醇溶解后仍有很強的抑菌活性，而脂肽可以溶解于甲醇，從而進一步說明抗菌物質中含有脂肽類物質。

圖3 酸沉淀抑菌活性Fig.3 Bacteriostatic activity of acid precipitation

2.3.4 表面活性劑特性 枯草芽胞桿菌分泌的抗菌脂肽surfactin是高活性的生物表面活性劑[17]，具有溶血、排油、液滴坍塌、凝聚特性[15]，實驗中將發酵液滴加到油膜中心，發現油膜迅速被打散成一個個圓圈，說明該活性物質具有排油的特性；另外，將發酵液滴在parafilm膜上，液滴慢慢坍塌，而不是保持球形結構，說明該抗菌物質具有使液滴坍塌的特性，這進一步表明該抗菌活性物質含有脂肽類物質。

3 討 論

生防菌只有在植物體內占據很好的生態位，才有可能發揮更好的防效。而生防菌侵入植物體內的方式和其定殖部位是決定生防菌施用方式和施用時間的關鍵因素。可通過構建工程菌株，如熒光蛋白基因標記，對生防菌株在植株上的定殖進行實時跟蹤，研究抗病菌株發揮生防作用的部位以及菌株在植株中的消長動態，以確定生防機制屬于拮抗、競爭、寄生還是誘導植株系統抗性中的哪一種[18]，為生防菌劑的施用提供理論指導。

芽胞桿菌抗菌物質主要有蛋白質和脂肽兩大類，通過對抗菌物質理化性質的研究，可以初步確定抗菌物質的種類，進而采取相應的分離純化的方法，對抗菌物質的結構進行進一步分析?？刹捎昧蛩徜@沉淀和酸沉淀進行純化，將純化的樣品做質譜分析，以確定該拮抗物質的種類。如果是脂肽類，可采用酸沉淀，用甲醇抽提，將抽提液進行HPLC，通過標準樣品（如iturin、surfactin、fengycin）進行含量測定；如果是蛋白類，可用硫酸銨逐級沉淀，磷酸緩沖液溶解，將溶解液透析除鹽后進行SDS-PAGE，確定蛋白種類和大小，并測定所分離蛋白粗提物的抗菌能力，選擇較強抗菌能力的蛋白拮抗物進行氨基酸序列分析、基因克隆或基因導入表達以確定蛋白質的結構。

4 結 論

在根際土壤、根、莖先后檢測到了菌株YH-22，說明菌株 YH-22在煙草組織內具有一定的定殖能力。后期可以考慮構建工程菌株，如熒光蛋白基因標記，研究抗病菌株在植株具體部位中的消長動態，為生防菌劑的施用提供理論指導。

解淀粉芽孢桿菌 YH-22對青枯病菌具有抗性的物質，對胰蛋白酶和中性蛋白酶具有一定的耐受性，能耐受紫外線和胃蛋白酶，不溶于氯仿和乙酸乙酯，具有排油和使液滴坍塌的表面活性劑特性，具有一定的耐熱性，可初步確定該抗菌活性物質是蛋白和脂肽的混合物。至于其結構的鑒定，要進一步對其進行分離純化，如硫銨沉淀、酸沉淀、HPLC、SDS-PAG等；通過氨基酸序列分析、基因克隆或基因導入表達等方法確定其結構。

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