響應面法優化微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白工藝

王 晶，吳燕燕，李來好，楊賢慶

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

響應面法優化微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白工藝

王 晶1,2，吳燕燕1,*，李來好1，楊賢慶1

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

研究微波對酶解合浦珠母貝蛋白的影響，以水游離氨態氮含量和抗氧化活性為指標，選擇較好的作用酶，通過單因素試驗確定料液比、加酶量（E/S）、微波溫度、微波功率及時間和后續水浴時間等因素水平，以水解度和DPPH自由基清除率為響應值，響應面法優化酶解合浦珠母貝蛋白工藝條件。結果表明，微波輔助蛋白酶酶解合浦珠母貝蛋白工藝條件為微波溫度58 ℃、微波功率300 W、微波時間17 min、加酶量5 000 U/g，后續在58 ℃條件下再水浴1.5 h。預測響應值為0.224 4，水解度達到26.15%，驗證實驗證明與響應優化模型預測值誤差不大，二次多元擬合度較好。

合浦珠母貝蛋白；微波輔助酶解；抗氧化活性；響應面法

合浦珠母貝，又稱馬氏珠母貝，是我國南海近海的主要養殖品種，也是我國主要的產珠貝種。但是采珠后會產生的大量珍珠貝肉，在市面上的加工利用率低且應用面窄[1]。研究發現合浦珠母貝肉不僅具有很高的食用價值，還富含蛋白質、多種不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等營養物質[2-3]。同時其酶解產物還具有抗氧化功能、較強的清除自由基能力[4-7]。珍珠的抗衰老特性已得以證明，合浦珠母貝因其在海洋中的特殊生長環境，其貝肉中還有豐富的抗氧化肽[8-10]，因此為從海洋資源中提取天然抗氧化劑提供了新途徑。

微波是指頻率在300 MHz～300 GHz的高頻電磁波，目前學術界對微波加速有機反應的機理有兩種觀點：微波熱效應和分子振動降低反應活化能的非熱效應[11]。但微波技術最大的特點是可以縮短酶解時間，從而提高提取效率、降低成本[12-13]。

本實驗利用微波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白，以期縮短蛋白水解時間，提高蛋白質水解度，為酶解合浦珠母貝蛋白制備抗氧化肽提供資源和工業化生產提供新思路和技術支持，為進一步純化抗氧化肽提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

合浦珠母貝購自海南養殖基地。

Alcalase 2.4L蛋白酶（2×105U/g） 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶（8×105U/g，CAS：9001-7 3-1，生物試劑）、酸性蛋白酶（5×1 05U/g，C A S：9 0 0 1-7 5-6，生物試劑）、風味蛋白酶（2×104U/g，生物試劑） 廣州市齊云生物技術公司；胰蛋白酶（2.5×105U/g，CAS：9002-07-3，生物試劑）、復合蛋白酶（1.2×105U/g，生物試劑） 廣州菲博生物科技公司；枯草蛋白酶（1.1×105U/g，食品級） 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；DPPH（CAS：1898-66-4，分析純） 美國Sigma公司；甲醛以及其他試劑（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器廠有限公司；3K30型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；MAS-Ⅱ 微波儀 上海新儀微波化學科技有限公司；Kjeltel2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS儀器有限公司；Delta320精密pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Akku-drive電子滴定儀 德國赫施曼公司；SUNRISE酶標儀 奧地利Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將合浦珠母貝去殼和臟器，然后直接用組織搗碎機將貝肉絞碎待用。

1.3.2 常規水解合浦珠母貝蛋白

稱取貝肉12 g若干份，每個樣品以料液比3：2（g/mL）加0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）8 mL，再按照4 000 U/g加酶量加入Alcalase 2.4L蛋白酶，混勻后置于60 ℃水浴鍋。依次水浴1、2、3、4 h和5 h取出樣品[14]，在100 ℃條件下滅酶10 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液測定其游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率。

1.3.3 微波輻射輔助蛋白酶水解合浦珠母貝蛋白

對處理過的樣品采用微波儀微波輔助酶解，在設定功率條件下達到設定的溫度后，會自動以最低功率100 W保持樣品的溫度。其他按照以下條件處理：稱取經前處理的貝肉12 g，料液比3：2（g/mL）加0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0），加酶量4 000 U/g、微波功率300 W，在60 ℃條件下微波10 min后，取出繼續在60 ℃條件下水浴1.5 h，再經滅酶，離心，測定其水解度（degree of hydrolysis，DH）和DPPH自由基清除率。以此條件為基準，對比先加酶后微波水浴與先微波后加酶水浴的效果，再選擇最佳作用酶，并考察料液比、加酶量（E/S）、微波溫度、微波功率以及時間和后續水浴時間等單因素的影響，采用Box-Behnken設計建立數學模型，以DH和DPPH自由基清除率作為響應值，進行響應面分析，確定微波輔助酶解的工藝條件。

1.3.3.1 酶的選擇

將Alcalase 2.4L蛋白酶（pH 7.0，60 ℃）、木瓜蛋白酶（pH 6.5，60 ℃）、胰蛋白酶（pH 8.0，40 ℃）、酸性蛋白酶（pH 3.0，50 ℃）、枯草蛋白酶（pH 8.0，50 ℃）、風味蛋白酶（pH 7.0，50 ℃）和復合蛋白酶（pH 6.5，50 ℃）編號為1～7，從中選擇最佳微波輔助酶解的酶類，根據其各自的最佳pH值和溫度結合以上基準條件處理樣品，并測定其游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率。

1.3.3.2 酶解工藝條件對微波輔助酶解的影響

其他條件同1.3.3.1節，設置料液比3：1、3：2、1：1、2：3和1：3（保持系列料液總量不變來稱取樣品的質量）；加酶量2 000、4 000、8 000、12 000、16 000、20 000 U/g；微波溫度30、40、50、60、70 ℃；微波功率200、300、400、600、800、900 W；微波處理時間1、3、5、10、15、30、45、60 min；水浴時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察酶解工藝條件對微波輔助酶解的影響，選擇最優比例，測定其游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率。

以上實驗過程中發現，用到微波處理中的樣品量較小時會造成較大的實驗處理誤差，推測是微波爐腔內微波處理分布不均勻，那么平行組在相同的設定條件下頁會有相對較大的誤差，所以，為了減小實驗中不穩定性因素的影響和減小實驗誤差，在處理過程中加有500 mL去離子水的玻璃容器于微波腔中，每次將處理組放在玻璃容器的水中處理。

1.3.3.3 響應面試驗設計

考慮微波處理對酶的影響，根據單因素試驗結果，選擇微波溫度、微波功率、微波時間以及加酶量4 個因素作為響應變量，其編碼為A、B、C和D。利用Design Expert v 8.0.6.1軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，優化微波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝。各試驗組的編碼與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table1 Variables and levels in the three-level, four-variable Box-Behnken experimental design

1.3.4 指標測定

樣品總氮含量測定參照凱氏定氮法[15]，氨基態氮含量測定參照甲醛-電位滴定法[16]。DH[17-18]按式（1）計算。

式中：N1為水解液中氨基氮含量；N2為原料中粗蛋白氮含量。

抗氧化活性測定：以對DPPH自由基的清除能力驗證酶解液的抗氧化活性狀況，參考文獻[19-20]，并稍作修改，具體如下：取1 mL樣品酶解液于10 mL的離心管，再依次加入1 mL去離子水，1 mL DPPH溶液（2×10-4mol/L，DPPH溶于無水乙醇），混勻后在室溫條件下避光反應20 min，10 000 r/min離心10 min，于517 nm波長處測吸光度Ai，實驗空白組為1 mL無水乙醇代替DPPH自由基溶液加入1 mL去離子水測定吸光度為Aj，對照組為1 mL去離子水代替1 mL樣品在517 nm波長處測定吸光度A0，并以等體積去離子水和無水乙醇混合液空白調零，DPPH自由基清除率按公式（2）計算。

式中：A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

2 結果與分析

2.1 水浴與微波酶解合浦珠母貝蛋白效果

為了表征微波輔助酶解處理合浦珠母貝肉的效果，設立了不同的處理組，先加酶后微波10 min，再水浴酶解1.5 h和微波10 min，再加酶水浴酶解1.5 h，討論微波輔助酶解的功效大小。各組處理樣品經過滅酶離心后，取上清液，測定其游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率，結果見表2。

表2 微波輔助酶解和水浴酶解處理組的游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率結果Table2 Effect of enzymatic hydrolysis alone or sequentially combined with microwave treatment on free ammonia nitrogen content and DPPH radical scavenging rate

2.2 酶的選擇

圖1為微波輔助7 種酶處理合浦珠母貝肉的游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率結果，不同的酶以料液比3：2在各自最適的pH值環境和微波處理溫度中作用于底物，微波處理10 min后，水浴1.5 h。不同的酶受微波條件的影響大小也不同[21]，由圖1可見，DPPH自由基清除率較高的是木瓜蛋白酶＞Alcalase 2.4L＞復合蛋白酶，水解度較好的是枯草蛋白酶＞風味蛋白酶＞Alcalase 2.4L，綜合考慮游離氨態氮含量和DPPH自由基清除率，保證水解度和活性較高，1號酶分別達到3.488 6 mg/g貝肉和81.303%，即Alcalase 2.4L蛋白酶效果最佳，因此，后續實驗選擇該酶進行微波處理。

圖1 7種不同的酶對合浦珠母貝肉微波輔助酶解的效果Fig.1 Effect of different enzymes on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.3 單因素試驗

2.3.1 料液比對微波輔助酶解的影響

圖2 料液比對微波輔助酶解的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on the microwave-assisted enzymolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖2可知，處理樣品時通過維持料液總量不變來稱取各組的樣品量，以減小實驗誤差。隨著貝肉比例的減少，DPPH自由基清除率逐漸降低，而游離氨態氮的含量在3：2時最高為3.535 mg/g貝肉。綜合考慮活性和水解量，料液比為3：2的處理結果較好。

2.3.2 加酶量對微波輔助酶解的影響

由圖3可知，不同加酶量對微波處理的影響較大，加酶量為4 000～8 000 U/g范圍時[22]，無論是DPPH自由基清除率還是游離氨態氮的含量都明顯高于其他的酶加量的結果，最高為4.248 mg/g貝肉和80.505%。說明酶與底物的平衡結合量在這個范圍內，可以使酶解達到最佳狀態。

圖3 加酶量對微波輔助酶解的影響Fig.3 Effect of E/S ratio on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.3.3 微波溫度對微波輔助酶解的影響

圖4 微波溫度對微波輔助酶解的影響Fig.4 Effect of microwave temperature on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖4可見，樣品在50～60 ℃條件下微波10 min后水浴1.5 h的處理樣液，其DPPH自由基清除率還是游離氨態氮的含量都較高，因此在此范圍內可以有效同時保證高水解度和活性。

2.3.4 微波功率對微波輔助酶解的影響

圖5 微波功率對微波輔助酶解的影響Fig.5 Effects of microwave power on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

從圖5可知，隨著微波功率加大，DPPH自由基清除率還是游離氨態氮的含量總體呈現下降趨勢。酶自身結果和活力在不同的微波功率下會受到一定的影響，目前的機理雖然尚不明確，但一致認為較大的功率會破壞酶活力。所以需要在較低的功率條件下找到快速處理的平衡點[23-24]。綜合實驗對水解度和DPPH自由基清除率的要求，微波功率300 W左右處理樣品較好，分別達到3.55 mg/g貝肉和83.811%。

2.3.5 微波處理時間對微波輔助酶解的影響

圖6 微波時間對微波輔助酶解的影響Fig.6 Effect of microwave time on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

根據已選擇較好的微波功率，在此條件下加熱處理樣品時間過長也會影響酶的活力情況[25-26]。由圖6可知，隨著微波處理時間延長，DPPH自由基清除率在10～45 min內較高。而游離氨態氮的含量大體呈遞增趨勢，30 min后曲線變的平緩，可能是酶的活性位點長時間在微波作用下被破壞，造成酶活性下降的緣故。

2.3.6 水浴處理時間對微波輔助酶解的影響

由于微波對酶也存在一定的負面影響，應該選擇在能夠保證較高的水解度和活性條件下，可以快速達到處理要求作用于樣品，后續需要結合水浴，達到總體過程時間低于全水浴的處理結果。圖7為微波處理后不同水浴時間的影響，隨著水浴時間延長，游離氨態氮的含量也隨之增加，而DPPH自由基清除率在1.5～2 h表現較突出，本著節省能源縮短處理時間的目的，實驗選擇1.5 h水浴時間較佳。

圖7 水浴時間對微波輔助酶解的影響Fig.7 Effect of subsequent water-bath heating time on on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面設計試驗和顯著性分析

運用Design Expert v 8.0.6.1軟件使用編碼單位對試驗進行四因素三水平的響應設計，見表3，優化試驗綜合考慮酶解液的高DH和DPPH自由基清除率，設立以DH×DPPH自由基清除率為響應值，試驗共29 組，其中包含24 個析因點和5 個零點，5 次零點試驗做誤差估計。數據結果進行多元回歸擬合，回歸方程的方差分析、各項的方差分析和參數估計及顯著性分析的主要結果歸納分別見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table3 Arrangement and results of the three-level, four-variable Box-Behnken experimental design

利用軟件對數據進行二次多元回歸擬合微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白方程如下：

響應值= 0.22＋2.683×10-3A-0.017B＋4.450×10-3C ＋0.025D＋4.325×10-3AB-3.850×10-3AC-0.012AD＋3.650×10-3BC - 0.013BD - 6.300×10-3CD - 0.061A2-0.038B2- 0.020C2- 0.026D2

如表4所示，二次多元回歸擬合方程的方差分析，B、D、A2、B2和D2項為極顯著影響因素，其中AD項和BD項交互影響顯著，其他項不顯著，說明各項對響應值的影響并非線性關系。整體二次多元擬合的模型的校正決定系數R2Adj= 93.02%，P＜0.000 1，表明試驗所選用的二次項模型具有極顯著性。失擬項P=0.181 8＞0.05，差異不顯著說明殘差均是由隨機誤差引起的，而R2=96.51%說明響應值有96.51%取決于所選的因素變量。所以用此模型可以較好地預測和優化微波輔助酶解合浦珠母貝蛋白。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysis of variance for the regression equation

2.4.2 響應面結果分析

圖8 兩兩交互作用對響應值的影響Fig.8 Interactive effects of experimental conditions on the hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins

由圖8等高線可以看出，各因素間的交互影響較好，基本呈現橢圓形。圖8b固定微波溫度，改變微波時間，其響應值變化較小，呈平緩的弧線，說明微波時間影響不及微波溫度影響大。圖8e和8f中，各自固定微波功率和時間，響應值隨著加酶量的增大而增大，起初變化較大，但后面變化平緩甚至有些許滑低，可能是底物已被飽和催化的緣故。

對模型發成求導得出最優條件為A=58.31、B=272.65、C=17.22、D=5 016.84，即微波溫度58.31 ℃、微波功率272.65 W、微波時間17.22 min、加酶量5 016.84 U/g，此時預測的響應值為0.224 4，DH為26.15%。

2.5 模型驗證實驗及活性測定

為了進一步檢驗響應面優化條件的可靠性，結合實際操作，將實驗條件A、B、C和D修正為58 ℃、300 W、17 min和5 000 U/g進行驗證實驗，得到DH為（25.04±0.46）%，響應值為0.217 3±0.070 0。

3 結 論

3.1 本實驗采用微波輔助酶解合浦珠母貝肉有效可行，通過優化實驗證明微波能夠促進貝肉水解，節省資源和時間，按照優化條件進行酶解的結果相當于常規水浴3 h（水解度（22.74±0.08）%）與4 h（水解度（26.95±0.03）%）之間，于是微波輔助酶解可以將水浴酶解時間縮短約一半。

3.2 實驗中對比了加酶和不加酶以及先加酶和后加酶微波處理的結果，發現微波前加酶較好，說明微波在一定程度上也是可以促進酶的作用。

3.3 響應優化的二次多元擬合度較好，對各因素的影響進行顯著性分析，并優化出的最佳工藝條件為微波溫度58 ℃、微波功率300 W、微波時間17 min、加酶量5 000 U/g，后續在58 ℃條件下再水浴1.5 h。在此條件下酶解合浦珠母貝肉能夠在一定程度上為工業化提供方向，并為后續實驗研究提供一定的參考依據。

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Optimization of Conditions for Microwave-Assisted Enzymolysis of Pinctada martensii Muscle Proteins Using Response Surface Methodology

WANG Jing1,2, WU Yan-yan1,*, LI Lai-hao1, YANG Xian-qing1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The microwave-assisted enzymatic hydrolysis of Pinctada martensii muscle proteins was optimized by response surface methodology. Alcalase 2.4L was chosen as the best enzyme to hydrolyze Pinctada martensii muscle proteins based on free ammonia nitrogen content and DPPH radical scavenging activity of hydrolsates. The levels of operating parameters such as substrate concentration, E/S ratio, solvent temperature, microwave power, radiation time and water bath heating time were established by single-factor experiments for response surface Box-Behnken design. Based on the mathematical product of degree of hydrolysis (DH) and DPPH radical scavenging rate, the optimal hydrolysis conditions were determined as a solvent temperature of 58 ℃, microwave treatment at 300 W for 17 min after addition of 5 000 U/g Alcalase 2.4L, and subsequent water bath heating at 58 ℃ for 1.5 h. Under these conditions, the maximum predicted DH was 26.15%, which was multiplied by DPPH radical scavenging rate to obtain 0.224 4. The small difference from the actual values observed in verification experiments suggested a high degree of fitting.

Pinctada martensii muscle proteins; microwave-assisted enzymolysis; antioxidant activity; response surface methodology

TS254.9

A

1002-6630（2014）10-0011-07

10.7506/spkx1002-6630-201410003

2013-07-03

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B05）；海南省重點科技項目（ZDXM20100005）；廣東省科技計劃項目（2011B031200009）；國家海洋局海洋公益性行業科研專項（2013418018）

王晶（1987—），女，碩士研究生，研究方向為海洋產物資源利用。E-mail：wjing8816@163.com

*通信作者：吳燕燕（1969—），女，研究員，博士，研究方向為水產品加工與安全控制。E-mail：wuyygd@163.com