響應(yīng)面法優(yōu)化酶-超聲波輔助同步提取紫薯花青素工藝

張 慢，潘麗軍,2,，姜紹通,2，莫玉穩(wěn)

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶-超聲波輔助同步提取紫薯花青素工藝

張 慢1，潘麗軍1,2,*，姜紹通1,2，莫玉穩(wěn)1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

為提高紫薯花青素得率，采用酶-超聲波輔助同步對(duì)紫薯花青素的提取效果進(jìn)行研究。通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定酶-超聲波輔助提取最佳工藝條件：體積分?jǐn)?shù)0.1%的HCl-C2H5OH為溶劑（酸醇比為50：50），纖維素酶提取溫度51 ℃、料液比1∶20、酶添加量54 U/mL、超聲功率100 W、時(shí)間33 min，此條件下花青素得率可達(dá)到（3.581±0.016）‰。酶-超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法相比，縮短了提取時(shí)間，花青素得率提高了2.73 倍；與微波法、超聲波法相比，花青素得率分別提高了32.4%和17.8%。

紫薯；花青素；纖維素酶；超聲波；響應(yīng)面法

目前，隨著全球范圍內(nèi)消費(fèi)者對(duì)飲食與健康之間關(guān)系關(guān)注的日益加劇及對(duì)人工合成色素危害性的認(rèn)識(shí)，天然色素的研發(fā)與使用成為世界食品工業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。與合成色素相比，天然色素一般從植物中提取出來(lái)，其優(yōu)勢(shì)在于：對(duì)人體無(wú)毒害，安全性高；能更好地模仿天然物顏色，色調(diào)比較自然；部分天然色素具有生理活性及保健作用。而紫薯中所含有的花青素是一種天然食用水溶性紅色素。

花青素是一類廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，因其食用安全、色澤鮮亮自然、無(wú)特殊氣味，且兼具抗氧化[1]、保護(hù)肝臟[2-3]、抗突變[4]、降血脂[5]等保健功能[6]，受到廣泛關(guān)注。紫薯花青素是從紫薯的莖葉或塊根中提取出來(lái)的一種水溶性的天然花青素類紅色素。有研究表明，紫薯花青素較其他同類花青素，如葡萄花青素、李花青素和黑米花青素的理化性質(zhì)穩(wěn)定，且具有顯著的生物學(xué)活性[7]。

紫薯花青素主要提取方法包括溶劑浸提法、酶水解法、樹(shù)脂法、超聲波萃取法、微波萃取法、超濾法、吸附精制法等[8-11]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)紫薯花青素的提取主要采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法，但該方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)率低、產(chǎn)品穩(wěn)定性差等缺陷。研究[12-14]表明，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于天然活性成分的提取具有明顯的優(yōu)勢(shì)。超聲波技術(shù)是利用超聲輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化、擾動(dòng)效應(yīng)，高加速度的擊碎和攪拌等綜合作用，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增強(qiáng)溶劑穿透力，從而加速活性成分滲出，有效縮短提取時(shí)間，提高提取得率[15]。酶解法[16]主要是利用纖維素酶、果膠酶等對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行破壁，以利于有效成分最大限度的溶出。本實(shí)驗(yàn)采用酶-超聲波法對(duì)紫薯花青素的提取效果進(jìn)行研究，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，獲得最佳提取工藝條件，為紫薯花青素的生產(chǎn)以及紫薯資源的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮無(wú)霉變的塊狀紫薯 市購(gòu)；乙醇、濃鹽酸、正丁醇、硫酸鐵銨（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型植物組織粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；202-1型電熱恒溫干燥箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；AR1140/C型電子天平 上海奧豪斯公司；Hei-VAP Value型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司；JK-300DUB型三頻數(shù)控超聲波清洗器 合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；721分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花青素的提取及工藝優(yōu)化

新鮮的紫薯洗凈，去除病蟲(chóng)害部分，切成條狀，置于50 ℃烘箱中烘制12 h，粉碎后過(guò)100 目篩，將篩出的紫薯粉放置到干燥器中避光保存，備用。

以紫薯為原料，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的HCl-C2H5OH為溶劑（酸醇比為50：50），在料液比為1：10（g/mL）時(shí)，按照100 U/mL用量加入不同的酶（α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶），于200 W、40 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取30 min，提取過(guò)后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液濃縮，55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，定容后測(cè)定紫薯花青素粗提液的吸光度，計(jì)算紫薯花青素的得率。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紫薯花青素得率為響應(yīng)值，確定Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素為提取溫度、提取時(shí)間、液料比、酶添加量。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶-超聲波輔助同步提取的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)提取條件。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取其平均值。設(shè)計(jì)的四因素三水平組合試驗(yàn)的各因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.3.2 紫薯花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確移取提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的HCl作參比液，于雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，確定其最大吸收峰。

1.3.3 花青素含量的測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.50 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg溶于CH3OH中，定容至10 mL），吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分別置于6支10 mL具塞試管中，各加入甲醇溶液至1.0 mL，加入9.0 mL反應(yīng)混合液（反應(yīng)混合液：取C4H10O、濃HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的 NH4Fe(SO4)2?12H2O體積比為83：6：1混合均勻。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NH4Fe(SO4)2?12H2O：稱取10.0 g NH4Fe(SO4)2?12H2O，用2 mol/L HCl溶解定容至100 mL），塞緊塞子，搖勻，置于沸水浴中加熱40 min后，立即取出用冰水冷卻4～5 min，取出，恢復(fù)至室溫后（約15 min），于最大吸收波長(zhǎng)處以試劑空白調(diào)零，測(cè)定其吸光度[17]。

1.3.3.2 樣品中花青素得率的測(cè)定

取1.0 mL定容后的紫薯花青素的濃縮液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定其吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中紫薯花青素的濃度，按照下式獲得樣品中紫薯花青素的得率。

式中：C為紫薯花青素質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以紫薯為原料，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的HCl-C2H5OH為溶劑（酸醇比為50：50），在料液比1：10（g/mL）、40℃時(shí)，按照100 U/mL的用量加入纖維素酶，于100 W超聲波清洗器中提取30 min，固定其他因素，考察單一因素對(duì)紫薯花青素得率的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)結(jié)果采用Excel中單因素方差分析，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯花青素提取液的吸收光譜

圖1 紫薯花青素光譜掃描圖Fig.1 UV spectrum of anthocyanins from purple sweet potato

由圖1可知，紫薯花青素有3 個(gè)峰，分別在300、325、520 nm左右。其中300 nm為多酚類物質(zhì)羥基的特征吸收峰，325 nm為有機(jī)酸類物質(zhì)羧基的特征吸收峰，520 nm為花色苷類物質(zhì)的特征吸收峰[18]。由于花青素具有特征性很強(qiáng)的C6—C3—C6碳骨架和相同的生化合成來(lái)源，因此人們也將花青素視為黃酮類化合物。但花青素因強(qiáng)烈吸收可見(jiàn)光而區(qū)別于其他天然黃酮類化合物[19]，故可以選擇520 nm作為花青素的最大吸收波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)下的吸光度可視為花青素的吸光度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of proanthocyanidins

線性回歸分析吸光度（Y）與原花青素質(zhì)量濃度X/（μg/mL）的回歸方程為：Y=0.003X-0.031，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線性范圍50～300 μg/mL。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶的選擇試驗(yàn)

由圖3可知，加入酶后，紫薯中花青素的提取得率增加。其中，纖維素酶使花青素的得率增加顯著，果膠酶和中性蛋白酶作用較弱，花青素提取得率提高不明顯。紫薯植物的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成的，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶是復(fù)合酶，能夠水解纖維使植物細(xì)胞壁破壞，充分釋放細(xì)胞內(nèi)含物，加速花青素的釋放。紫薯中淀粉的含量很多，但α-淀粉酶對(duì)紫薯花青素的提取效果低于纖維素酶；紫薯中果膠和蛋白質(zhì)的含量相對(duì)很少，使果膠酶和中性蛋白酶的作用不明顯。因此，選擇纖維素酶進(jìn)行紫薯花青素的提取試驗(yàn)。

圖3 不同種類的酶對(duì)花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzyme type on the yield of anthocyanins

圖4 提取溫度對(duì)花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanins

2.3.2 提取溫度對(duì)花青素得率的影響

由圖4可知，花青素的得率隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，紫薯中花青素的得率達(dá)到最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，花青素的得率反而減少。因?yàn)樵谧钸m合的溫度條件下酶促反應(yīng)速度最快，在較低溫度下，底物的分子熱能較低，酶促反應(yīng)速度慢，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶易變性失活。因此，纖維素酶的提取溫度選取50 ℃較為適宜。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of anthocyanins

由圖5可知，花青素的提取得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在30 min時(shí)達(dá)到最大，之后基本上保持不變。因?yàn)槔w維素酶與底物的作用需要一定的時(shí)間，當(dāng)酶促反應(yīng)充分發(fā)生后，酶的效率得到充分利用，繼續(xù)增加時(shí)間，花青素的提取不再增加。因此，纖維素酶的提取時(shí)間選取30 min較為適宜。

圖6 酶添加量對(duì)花青素得率的影響Fig.6 Effect of enzyme concentration on the yield of anthocyanins

2.3.4 酶添加量對(duì)花青素得率的影響

由圖6可知，當(dāng)纖維素酶用量達(dá)到50 U/mL后，繼續(xù)增加酶用量，花青素的得率不再增加。因?yàn)槊缸饔玫牡孜锪渴且欢ǖ?，?dāng)?shù)孜锉幻赋浞肿饔煤?，繼續(xù)增加酶的用量不會(huì)導(dǎo)致花青素釋放量的增加。因此，纖維素酶的加入量選取50 U/mL較為適宜。

2.3.5 料液比對(duì)花青素得率的影響

圖7 料液比對(duì)花青素得率的影響Fig.7 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of anthocyanins

由圖7可知，花青素的提取得率隨著料液比的增加先上升后下降，在料液比1：20時(shí)達(dá)到最大值，再增大料液比得率反而下降。過(guò)量溶劑的使用使酶的濃度降低，從而降低了酶與底物的接觸，因而使花青素的提取得率下降。因此，料液比選擇1：20較為適宜。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

結(jié)合單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比、酶添加量對(duì)花青素得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Table2 Box-Behnken design and experimental results

續(xù)表1

2.4.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件，通過(guò)對(duì)多項(xiàng)式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：

回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差與分析Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明回歸模型高度顯著；失擬項(xiàng)P=0.305 7＞0.05，即模型失擬項(xiàng)不顯著，表明模型合適，即試驗(yàn)數(shù)據(jù)有意義。決定系數(shù)R2是參數(shù)變量和總變量的比值，也是檢測(cè)數(shù)據(jù)合理性的指標(biāo)。當(dāng)R2接近1時(shí)，表明模型與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合度好[20]。本試驗(yàn)的R2=0.995 1，因此該回歸方程擬合度較好?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明：X1、X2、X4、X1X2、X1X3、、、、對(duì)花青素得率影響高度顯著；X3、X2X3對(duì)得率影響顯著。各試驗(yàn)因素對(duì)紫薯花青素得率大小的影響依次是酶添加量（X4）＞提取溫度（X1）＞提取時(shí)間（X2）＞液料比（X3）。

2.4.3 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見(jiàn)圖8～10，分析提取溫度、提取時(shí)間、液料比、酶添加量4個(gè)因素對(duì)紫薯花青素提取得率的交互作用。

圖8 提取溫度（X1）和提取時(shí)間（X2）對(duì)花青素得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of temperature X1and time X2on the yield of anthocyanins

圖9 提取溫度（X1）和液料比（X3）對(duì)花青素得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of temperature X1and solid-to-liquid ratio X3on the yield of anthocyanins

圖10 提取時(shí)間（X2）和液料比（X3）對(duì)花青素得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of extraction time X2and solid-to-liquid ratio X3on the yield of anthocyanins

由圖8提取溫度和提取時(shí)間的交互作用可知，隨著提取時(shí)間和提取溫度的增加，花青素的得率先增加后降低，響應(yīng)曲面的坡度陡峭，表明這兩個(gè)因素的交互效應(yīng)顯著，當(dāng)提取時(shí)間在32 min左右、提取溫度為50 ℃左右時(shí)花青素得率較高；由圖9可知，隨著提取溫度和液料比的增加，花青素的得率呈先增加后減小的趨勢(shì)，響應(yīng)曲面的坡度陡峭，表明這兩個(gè)因素的交互效應(yīng)顯著，當(dāng)液料比在20：1（mL/g）左右時(shí)，花青素的得率較高；由圖10可知，隨著提取時(shí)間和液料比的增加，花青素得率增加到最大值后下降，等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用較強(qiáng)。比較以上各圖可以看出，提取溫度（X1）和提取時(shí)間（X2）對(duì)花青素得率的影響高度顯著，表現(xiàn)為曲線相對(duì)較陡；其次液料比（X3）曲線較平滑，對(duì)花青素得率的影響較顯著。

2.4.4 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗(yàn)證

對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到花青素得率預(yù)測(cè)最大值時(shí)各因素水平為提取溫度50.72 ℃、提取時(shí)間32.61 min、液料比20.17：1、酶添加量53.75 U/mL，預(yù)測(cè)得率可達(dá)到3.719‰。

為檢測(cè)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，將上述最優(yōu)條件調(diào)整為：提取溫度51 ℃，提取時(shí)間33 min，液料比20：1，酶添加量54 U/mL，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，其得率的實(shí)測(cè)值為（3.581±0.016）‰，該值落在響應(yīng)值的95%預(yù)測(cè)區(qū)間[3.532 9‰，3.904 8‰]內(nèi)，表明所建回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。

2.5 不同提取方法的比較

稱取紫薯粉2.0 g，分別用鹽酸-乙醇浸提法、微波法、超聲波法、酶-超聲波輔助提取方法提取花青素，不同方法的提取時(shí)間和花青素得率結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同提取方法的比較Table4 Comparison of different extraction methods

由表4可知，酶-超聲波輔助同步提取法較單純鹽酸-乙醇浸提法，花青素得率提高了2.73 倍，而提取時(shí)間縮短了75%；在相同的條件下，酶-超聲波輔助同步提取法較單純微波法和超聲波法，花青素得率分別提高了32.4%和17.8%；酶-超聲波輔助法提取花青素得率較高。

3 結(jié) 論

紫薯花青素經(jīng)雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)光譜掃描分析，得到其最大吸收波長(zhǎng)為520 nm。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，得到酶-超聲波輔助法提取紫薯花青素的最佳工藝條件為提取溫度51 ℃、提取時(shí)間33 min、液料比20：1、酶添加量54 U/mL，此條件下，花青素得率可達(dá)到3.581‰。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法花青素得率為0.96‰，酶-超聲波輔助法與傳統(tǒng)方法相比，花青素得率提高了2.73倍；與微波法、超聲波法相比，花青素得率分別提高了32.4%和17.8%。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Methodology

ZHANG Man1, PAN Li-jun1,2,*, JIANG Shao-tong1,2, MO Yu-wen1
(1. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, Hefei 230009, China)

The ultrasonic-assisted enzymatic extraction of anthocyanins from purple sweet potato was optimized by Box-Behnken experimental design and response surface methodology to increase the yield of anthocyanins. The optimum extraction conditions were obtained as follows: in a solvent made up of 0.1% hydrochloride and ethanol (50:50, V/V) at 51 ℃, hydrolysis with 54 U/mL cellulase for 33 min at a ultrasonic power of 100 W. The yield of anthocyanins was up to (3.581 ± 0.016)‰ under these conditions. Compared with the traditional solvent extraction method, the extraction duration was shortened and the yield of anthocyanins was increased by 2.73 folds using this method, and by 32.4% and 17.8%, respectively, compared with microwave-assisted method and ultrasonic-assisted method.

purple sweet potato; anthocyanins; cellulose; ultrasonic; response surface methodology

TS202.3

A

1002-6630（2014）10-0023-06

10.7506/spkx1002-6630-201410005

2013-08-07

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD02B04）

張慢（1986—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：zhangman.opq@163.com

*通信作者：潘麗軍（1955—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：panlijun1955@163.com