龍眼皮 原花青素提取工藝優化及其抗氧化活性測定

黃尚榮，楊雪娜，張 露，鄭明星，謝金盛，付才力

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

龍眼皮 原花青素提取工藝優化及其抗氧化活性測定

黃尚榮，楊雪娜，張 露，鄭明星，謝金盛，付才力*

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

以龍眼果皮為原料提取原花青素。在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法研究提取時間、乙醇體積分數、液料比和提取溫度對龍眼皮原花青素得率的影響，并對其進行優化。得到最佳提取工藝為提取時間25 min、液料比17：1（mL/g）、乙醇體積分數51%、提取溫度50 ℃，此條件下的原花青素得率為1.21%。在利用Sephadex LH-20凝膠柱層析對原花青素進行純化后，通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除實驗和還原力測定，結果顯示龍眼皮原花青素具有較高的抗氧化活性。

龍眼皮；原花青素；響應曲面法；抗氧化活性

原花青素（proanthocyanidins，PC）是自然界中僅次于木質素的第二大類酚類物質，由黃烷醇聚合而成，因為單體與單位間鍵型的復雜性和單體單位的多樣性、多手性中心及取代基和聚合形態的多變性，原花青素的結構復雜多樣，被視為重要的生物黃酮[1]。研究表明：原花青素具有抗氧化、降血脂、預防心血管疾病、抗腫瘤、抗糖尿病等多種生物活性[2-4]。目前，原花青素主要從葡萄籽、松樹皮中提取。尋找新的原花青素來源和新型結構的原花青素已成為科研工作者的研究熱點。王燕芹等[5]利用響應曲面法優化了銀杏葉中原花青素的提取工藝；FU Caili等[6-7]從山竹皮和修蕨根中分離出的原花青素被證明具有高抗氧化活性。

龍眼（Dimocarpus longan Lour）為無患子科（Euphoraceae）植物龍眼的果實，是一種優異的鮮食和加工兼用型水果。中國為世界龍眼主產國之一，種植面積超過46.7萬平方公里，年產量超過100萬 t，居世界首位[8]。但由于缺乏有效的利用手段，占龍眼果實鮮質量17%以上的果皮、果核被當做廢物丟棄[9]，全國每年被廢棄的龍眼果皮、果核高達2萬 t以上，不僅附加值幾乎為零，還造成環境污染[8]。

龍眼皮中富含多種生理活性物質，包括多糖、多酚、黃酮、原花青素等[10-11]。He Ning等[12]系統性調查了中國12 種龍眼果皮、果肉、果核中的總酚含量、單寧含量及總原花青素含量，結果表明，每100 g龍眼果皮、果核中總原花青素的最高含量分別為140 mg和112 mg，含量較豐富。Soong和Barlow在分析新加坡市場上的龍眼的理化成分時，發現龍眼中含有原花青素二聚體[13]。然而，如何高效提取龍眼皮中原花青素，還缺乏研究報道，龍眼皮原花青素的抗氧化活性還有待研究。

本實驗在單因素試驗的基礎上，利用響應曲面法對龍眼皮原花青素的提取工藝進行優化，分析提取時間、液料比、乙醇體積分數和提取溫度對原花青素得率的影響，并建立數學模型；同時利用Sephadex LH-20凝膠柱對原花青素進行純化，并分析其抗氧化活性，為新型食品天然抗氧化劑的開發利用以及龍眼皮的深加工提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼于當地市場購買，果皮經曬干后磨粉，于-20 ℃冷藏；兒茶素標準品（純度98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 阿拉丁試劑(上海)有限公司；2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS] 美國Sigma公司；香草醛、抗壞血酸 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-100DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；N-1001真空旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；電子天平 美國丹佛儀器公司；CF16RXII高速冷凍離心機 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼皮原花青素的提取工藝

準確稱取1.0 g龍眼皮原料于100 mL錐形瓶中，加入一定體積分數乙醇，在設定的不同液料比條件下，于設定好溫度的恒溫振蕩器中提取一定時間，將提取液真空抽濾并用甲醇定容至50 mL，稀釋一定倍數后測定原花青素含量。

1.3.2 龍眼皮原花青素提取工藝優化

表1 響應曲面試驗設計因素水平編碼表Table1 Factors and levels used in response surface experimental design

在其他條件一致時，分別研究提取時間（X1）、液料比（X2）、乙醇體積分數（X3）和提取溫度（X4）對提取效果的影響。在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken試驗進行試驗設計，用Design Expert 8.0軟件進行響應面優化分析，確定最佳提取工藝。因素水平編碼表如表1所示。

1.3.3 龍眼皮原花青素的純化

在最優工藝條件下提取龍眼皮原花青素，旋轉蒸發除去乙醇，3 000×g離心15 min，上清液加入一定體積的三氯甲烷萃取，收集水相。將水相旋轉蒸發濃縮至一定體積，經0.45 μm濾膜過濾，上樣至Sephadex LH-20凝膠柱（凝膠柱先用體積分數50%甲醇溶液平衡），用體積分數50%甲醇溶液洗脫至洗脫液無色，再用500 mL體積分數70%丙酮洗脫，收集丙酮洗脫部分，將洗脫液真空濃縮、冷凍干燥，即獲得純化的原花青素，于-20 ℃冰箱中儲藏備用。

1.3.4 原花青素含量測定

為了減少樣品基質對測定結果的影響，保證原花青素測定數據的可靠性，在不同液料比條件下對龍眼皮原花青素進行提取，并同時采用香草醛-鹽酸法[14]、香草醛-硫酸法[15]測定提取液中原花青素含量，考察兩種方法之間的差異并進行測定方法的復核和確認。以兒茶素標準品分別繪制標準曲線，測定提取液中龍眼皮原花青素的質量濃度，并換算成質量，按下式計算得率：

香草醛-硫酸法：以兒茶素為標準品，分別配制質量濃度為15、30、45、60、75、90 μg/mL的標準液，繪制標準曲線。得到回歸方程Y=0.006 3X＋0.009 3，R2=0.998 3。

香草醛-鹽酸法：以兒茶素為標準品，分別配制質量濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL的標準液，繪制標準曲線。得到回歸方程Y=0.003X＋0.044，R2=0.991 3。

1.3.5 龍眼皮原花青素的體外抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考Villa?o等[16]的方法。取不同質量濃度的樣品0.1 mL，加入3.9 mL質量濃度為25 mg/L的DPPH甲醇溶液（現用現配），搖勻，暗處反應30 min后在515 nm處測吸光度。以VC作為對照。計算半抑制濃度（half maximal（50%） inhibitory concentration，IC50）。

按下式計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

參考Re等[17]的方法，略作修改。ABTS儲備液（7 mmol/L）與過硫酸鉀（終物質的量濃度2.45 mmol/L）按1：0.5比例混合，混合液于室溫下暗處反應12～16 h產生ABTS自由基。ABTS自由基溶液使用前用甲醇稀釋至734 nm處的吸光度為（0.700±0.020）。

1 mL不同質量濃度的樣品中加入4 mL ABTS自由基溶液，30 ℃條件下反應6 min后于與734 nm波長下測吸光度。以VC作為對照，計算IC50。

按下式計算ABTS自由基清除率：

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。1.3.5.3 還原力

參考Yen等[18]的方法。取1 mL不同質量濃度的樣品，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（200 mmol/L，pH 6.6），2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6]溶液。在50 ℃反應20 min后，加入1 mL 10%的三氯乙酸，4 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，在700 nm處測吸光度。吸光度越高說明還原力越強。以VC作為對照。IC50值定義為：吸光度達到0.5時樣品的質量濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比的選擇

在提取時間25 min，乙醇體積分數40%，提取溫度50 ℃的條件下，液料比對原花青素得率的影響見圖1所示。

圖1 液料比對原花青素提取效果的影響Fig.1 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction efficiency of proanthocyanidins

原花青素的測定方法較多。從測定方法的靈敏度、準確性及簡便性來講，目前應用較多的是酸化香草醛法[14-15]。周蕓等[14]在探索蓮房原花青素制備工藝時，采用香草醛-鹽酸法測定蓮房原花青素含量；而孫蕓等實驗表明，在測定葡萄籽原花青素含量時，香草醛-硫酸法是優異的測定方法[15]。為了避免所采用的原花青素測定方法不適用于龍眼皮這種樣品基質，確保原花青素檢測數據的可靠性，實驗對不同液料比條件下的原花青素提取液，同時采用香草醛-鹽酸法[14]、香草醛-硫酸法[15]測定原花青素含量，考察它們之間的差異并進行方法復核。由圖1可知，兩種測定方法測定原花青素含量，結果相差不大。文獻[19]表明，在測定醇溶液中原花青素含量的香草醛反應體系中，以硫酸催化的反應靈敏度高于鹽酸。因此，本實驗采用香草醛-硫酸法測定原花青素含量。

圖1進一步表明，隨著液料比逐漸增加，原花青素得率呈增大趨勢。但當液料比達到15：1時，提取達到飽和。再增大提取劑的量，反而促進雜質的溶出，不利于有效成分的提取。這可能是由于液料比增大時，原花青素與提取劑在單位時間內存在較大的質量濃度梯度，擴散系數大，有利于原花青素溶出。因此在設計中心組合試驗時，以10：1、15：1、20：1（mL/g）為液料比的3 個水平。

2.1.2 提取時間的選擇

在液料比10：1（mL/g），乙醇體積分數40%，提取溫度50 ℃的條件下，提取時間對原花青素得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對原花青素提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖2可知，隨著提取時間延長，原花青素得率逐漸增大。但是當提取時間超過25 min后，原花青素得率逐漸下降。故提取時間選擇在20～30 min為宜。

2.1.3 乙醇體積分數的選擇

在提取時間25 min，液料比15：1（mL/g），提取溫度50 ℃的條件下，乙醇體積分數對原花青素得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對原花青素提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of proanthocyanidins

由圖3可知，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素的得率逐漸增加。當乙醇體積分數達到50%時原花青素得率達到最大，之后隨著乙醇體積分數的增加原花青素得率呈下降趨勢。原花青素為極性化合物，適宜的乙醇溶液更容易將原花青素與其他大分子物質所形成的鏈接鍵打斷，提高原花青素得率；乙醇體積分數過大，會使一些醇溶型雜質、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與原花青素競爭同乙醇-水分子結合，而導致得率下降[20]。因此，選擇乙醇體積分數在40%～60%為宜。

2.1.4 提取溫度的選擇

在提取時間25 min，液料比15：1（mL/g），乙醇體積分數50%的條件下，提取溫度對原花青素得率的影響見圖4所示。

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，原花青素的得率不斷增加，到50 ℃時達到最高；繼續升高溫度，提取率反而下降。這可能是由于溫度升高加速細胞破裂，有利于原花青素溶出；但由于原花青素是熱敏性物質，高溫會加速其分解，因此提取溫度不宜過高。選擇40～60 ℃為宜。

2.2 響應曲面試驗

利用Design-Expert軟件對表2試驗結果進行回歸分析，得到回歸方程：

對模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型的顯著水平遠遠小于0.05，表明模型效應顯著；失擬項P=0.101 2≥0.05，表明方程對試驗的擬合度較好。此外，X2、、、、對原花青素得率的影響顯著，表明液料比（X2）在所取水平范圍內對原花青素得率的變動有顯著影響。而一次項X1、X3、X4即提取時間、乙醇體積分數及提取溫度對回歸方程的影響不顯著，而對應的平方項影響顯著，說明三個因素所采取的試驗水平，整體已經較好的接近最優解附近的曲面中心區域。因此，在優化龍眼皮原花青素提取工藝時，合理的液料比具有至關重要的作用。由F值可知，各因素對龍眼皮原花青素得率的影響依次為X2（液料比）＞X3（乙醇體積分數）＞X1（提取時間）＞X4（提取溫度）。

表2 響應曲面試驗設計及結果Table2 Design matrix and corresponding results of RSM experiments

表3 方差分析表Table3 Analysis of variance for the regression model

利用Design-Expert軟件中的響應面和等高線圖對4因素間的交互作用進行分析，結果如圖5～10所示。

圖5 提取時間和液料比的響應面和等高線Fig.5 Response surfaces and contour plots for extraction time and ratio of liquid to material

由圖5可知，液料比不變時，提取時間對原花青素得率的影響呈先增大后減小的趨勢，但趨勢不明顯。而當提取時間不變時，隨著液料比增大，原花青素的得率逐漸增大，之后趨于平緩。由于等高線與兩因素坐標的交點數中，數量多的即為主效應因子[21]，相比之下，液料比對原花青素得率的影響更為顯著。

由圖6可知，當乙醇體積分數不變時，提取時間對原花青素得率的影響呈現增加后降低的趨勢。而當提取時間不變，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素得率出現先增加后降低的趨勢，變化較為顯著，在中心點附近達到最高值。乙醇體積分數對原花青素得率影響較為顯著。

圖6 提取時間和乙醇體積分數的響應面和等高線Fig.6 Response surfaces and contour plots for extraction time and ethanol concentration

圖7 提取時間和溫度的響應面和等高線Fig.7 Response surfaces and contour plots for extraction time and temperature

由圖7可知，當提取溫度不變時，提取時間對原花青素得率的影響呈先增加后降低的趨勢。當提取時間不變時，提取溫度對原花青素得率的影響與提取時間類似。兩者對原花青素得率的影響相差不大。

圖8 液料比和乙醇體積分數的響應面和等高線Fig.8 Responsive surfaces and contour plots for ratio of liquid to material and ethanol concentration

從圖8可以看出，乙醇體積分數不變時，隨著液料比的增大，原花青素的得率逐漸增大。在液料比不變時，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素得率出現先增加后降低的趨勢。與乙醇體積分數相比，液料比對原花青素得率的影響更為顯著。

圖9 液料比和溫度的響應面和等高線Fig.9 Response surfaces and contour plots for ratio of liquid to material and ethanol concentration

由圖9可知，當提取溫度一定時，隨著液料比的增大，原花青素得率逐漸增加，后趨于平緩，液料比大致在17：1（mL/g）時，原花青素提取率最高。液料比不變時，隨著提取溫度的升高，原花青素得率呈先上升后下降的趨勢。與提取溫度相比，液料比為影響原花青素得率的主要因素。

圖10 乙醇體積分數和溫度的響應面和等高線Fig.10 Responsive surfaces and contour plots for ratio of ethanol concentration and temperature

由圖10可知，當溫度一定時，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素得率先增加后降低，在中心點附近達到最大值。當乙醇體積分數處于一定水平時，隨著溫度的升高，原花青素得率也呈先增大后下降的趨勢，但變化較不顯著。與溫度相比，乙醇體積分數為影響原花青素得率的主要因素。

利用已建立的數學模型在實驗范圍內優化出最優條件為提取時間25 min、液料比17：1（mL/g）、乙醇體積分數51%、提取溫度50 ℃，在此條件下，龍眼皮原花青素得率為1.21%。為驗證模型的可靠性，在此條件下進行8次平行試驗，龍眼皮原花青素的平均得率為1.23%。與理論預測值相比，其相對誤差約為1.33%，說明優化結果可靠。

2.3 龍眼皮原花青素的抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種相對穩定的自由基，常用于評估抗氧化劑的抗氧化能力[22]。龍眼皮原花青素對DPPH自由基的清除能力見圖11。

圖11 龍眼皮原花青素的DPPH自由基清除能力Fig.11 DPPH radical scavenging activities of proanthocyanidins from longan pericarp and VC as positive control

由圖11可知，當質量濃度小于0.2 mg/mL時，龍眼皮原花青素對DPPH自由基的清除能力呈一定的量效關系，清除率隨著原花青素質量濃度的增加而逐漸增大。當原花青素質量濃度達到0.2 mg/mL時，清除率在90%以上。與VC相比，龍眼皮原花青素呈現出較好的抗氧活性，兩者的IC50值分別為0.083 mg/mL和0.103 mg/mL（表4）。

2.3.2 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基是通過過硫酸鉀氧化ABTS產生的一種自由基，在波長734 nm處有最大吸收。在有氫供體抗氧化劑存在的條件下，ABTS自由基發生還原作用而褪色[17]。龍眼皮原花青素對ABTS自由基的清除能力見圖12。

圖12 龍眼皮原花青素的ABTS自由基清除能力Fig.12 ABTS radical scavenging activities of proanthocyanidins from longan pericarp and VC as positive control

由圖12可以看出，ABTS自由基清除率隨著原花青素和VC質量濃度的增大而增大。當質量濃度小于20 μg/mL時，龍眼皮原花青素比VC具有更強的ABTS自由基清除能力；當質量濃度大于20 μg/mL時，ABTS自由基清除率達到90%以上。兩者的IC50值分別為6.64 μg/mL和9.28 μg/mL（表4）。

2.3.3 還原力

還原力強的樣品能很好的提供電子，其供應的電子除了可使Fe3+還原成Fe2+外，也可以參與自由基反應，使自由基生成穩定物質。因此，物質的還原能力與其抗氧化活性之間也有明顯的相關性，還原力的高低可以間接反應抗氧化能力的強弱[23]。龍眼皮原花青素的還原力如圖13所示。

圖13 龍眼皮原花青素的還原力Fig.13 Reducing power of proanthocyanidins from longan pericarp and VC as positive control

由圖13可知，波長700 nm處的吸光度隨龍眼皮原花青素質量濃度的增加而增大，說明還原力與原花青素濃度呈良好的線性關系。在相同質量濃度水平下，VC對照組的吸光度比原花青素的吸光度高，但相差不大。兩者的IC50值分別為0.061 mg/mL和0.054 mg/mL，說明龍眼皮原花青素具有較好的還原力（表4）。

表4 龍眼皮原花青素及VC的IC50值Table4 IC50 values of proanthocyanidins from longan pericarp and VC as positive control

3 結 論

通過單因素試驗和響應曲面優化，確定龍眼皮原花青素的最優提取工藝為提取時間25 min、液料比17：1（mL/g）、乙醇體積分數51%、提取溫度50 ℃，此條件下的原花青素得率為1.21%。用Sephadex LH-20凝膠柱對原花青素進行純化，并進行體外抗氧化活性評價，包括DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及還原力。3 個體系的IC50值分別為0.083 mg/ mL，6.64 μg/mL與0.061 mg/mL，表明龍眼皮原花青素具有很好的抗氧化活性。

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Optimized Extraction and Antioxidant Activity of Proanthocyanidins from Longan Pericarp

HUANG Shang-rong, YANG Xue-na, ZHANG Lu, ZHENG Ming-xing, XIE Jin-sheng, FU Cai-li*
(College of Biological Science and Technology, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China)

The extraction of proanthocyanidins from longan pericarp was optimized using response surface methodology. The effects of extraction time, solvent-to-solid ratio, ethanol concentration and extraction temperature on the yield of proanthocyanidins were investigated. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: an extraction time of 25 min, a ratio of liquid to material of 17:1 (mL/g), an ethanol concentration of 51% and a temperature of 50 ℃. Under these conditions, the yield of proanthocyanidins was 1.21%. The extract was then purified by Sephadex LH-20 column. The purified proanthocyanidins had high antioxidant activity as indicated by scavenging activities against, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) radicals and reducing power.

longan pericarp; proanthocyanid ins; response surface methodology; antioxidant activity

TS201.1

A

1002-6630（2014）10-0068-08

10.7506/spkx1002-6630-201410013

2013-09-11

福建省自然科學基金項目（2012J05056）；福建省教育廳科技項目（JA12032）；福州大學校人才基金項目（1164）

黃尚榮（1988—），男，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：516078470@qq.com

*通信作者：付才力（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：caili_fu@hotmail.com