微波法輔助反膠束技術前萃取大豆蛋白工藝

趙曉燕，陳 軍，王憲昌，陳相艷，鄧 鵬，林 洋

（山東省農業科學院農產品研究所，山東 濟南 250 100）

微波法輔助反膠束技術前萃取大豆蛋白工藝

趙曉燕，陳 軍，王憲昌，陳相艷*，鄧 鵬，林 洋

（山東省農業科學院農產品研究所，山東 濟南 250 100）

以全脂大豆為研究對象，為提高反膠束前萃取大豆蛋白的效率，利用變頻微波萃取儀，輔助反膠束技術前萃取大豆蛋白。研究單因素即提取溫度、pH值、液料比與時間對大豆蛋白提取率的影響，通過主要因素的響應面試驗，優化提取參數，且檢測了參數之間相互作用關系。利用統計分析和優化，結果顯示，微波對前萃取大豆蛋白影響的相對大小依次為提取時間＞溫度＞pH值。結果表明：在提取溫度43.3 ℃、pH 8、萃取時間23 min時，蛋白質前萃率達到最高水平，提取率80.61%。

大豆蛋白；反膠束；微波；前萃；響應面法

大豆是一種古老的食品，大豆蛋白屬于植物性蛋白含有8種人體必需氨基酸，且比例較合理、含量較高，品質優于糧食蛋白質，與肉類的蛋白質接近，為植物性的完全蛋白質，且在眾多的植物性蛋白質中營養價值最高，在日常生活中被人們廣泛利用。另外大豆蛋白不僅具有營養價值還具有保健作用，能降低膽固醇水平而維護心血管健康等[1]。

大豆蛋白的提取方法有堿提酸沉法、膜分離方法與雙水相萃取技術等[2-4]。目前工業化生產的基本方法為堿提酸沉法，但該方法耗酸、耗堿量大，造成環境的污染與蛋白的變性；而其他方法的研究仍處于實驗室階段，沒有工業化應用。反膠束技術作為一種新的分離技術，由表面活性劑的極性頭（親水基）朝內，非極性尾（疏水基）朝外排列組成，形成一個球狀的極性核，核內是一定數量的水，稱為微水池或者微水相，該水池可以增溶蛋白質、酶等可溶性極性物質[5-8]。

近年來反膠束溶液作為新的溶劑系統萃取生物分離技術已廣泛應用于蛋白質的溶液萃取中，該方法成本低，溶劑可回收利用，萃取效率高，選擇性高，使用范圍廣，操作簡單等優點，為蛋白質和油脂的提取分離提取開辟了一條具有工業發展的途徑[9-10]。因此，反膠束技術制備蛋白質是前景看好的生產工藝路線，已成為近年來國際上蛋白生產的研究熱點。

當反膠束溶液與蛋白質水溶液或含蛋白質的固相接觸后，蛋白質可加溶于反膠束溶液的過程，稱為前萃；將含有蛋白質的反膠束溶液轉移至第2水相的過程，通過調節pH值與離子強度等，使蛋白質轉入水相、離心分離，從而分離出蛋白質，稱為后萃[9-11]。國內20世紀80年代引進了反膠束的概念，開始了對反膠束的研究，之后國內陸續有反膠束萃取氨基酸、蛋白質、酶的報道[12-13]，隨后開展了反膠束技術同時分離蛋白與油脂的研究，并取得了較好的效果[14-15]。在反膠束前萃取植物蛋白時，與其他技術相結合的研究也相繼出現，如與超聲波技術相結合前萃取植物蛋白[16]。但是，微波輔助反膠束技術前萃植物蛋白研究還鮮有報道。反膠束體系核內是一定數量的水，而水是吸收微波的最好介質。因此，反膠束與微波技術相結合萃取蛋白，在蛋白制備工業化應用中是非常有意義的集成技術。

變頻微波萃取儀利用非接觸紅外測溫，通過微波功率自動變化，來保持溫度的恒定，而普通的微波儀隨著時間的延長，溫度快速上升。本實驗在前人研究的基礎上，采用該設備，輔助二（2-乙基已基）丁二酸酯磺酸鈉（bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate，AOT）正己烷反膠束體系前萃取大豆蛋白，改進工藝條件，研究了微波溫度、緩沖溶液pH值、液料比與時間影響大豆蛋白的提取率，采用響應面試驗，建立萃取數學模型，進行條件優化，得出大豆蛋白提取率較高的較優提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆來自山東濟南（中豆25號），將大豆晾干，磨成豆粉，過100目篩，封口備用；AOT 上海聯民化工廠；正己烷、卡爾費休試劑與氯化鉀等化學試劑為分析純 上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

MAS-??型常壓微波萃取反應儀 上海新儀微波化學科技有限公司；AFK-1B水分自動測定儀 上海禾工科學儀器有限公司；K9860凱式定氮儀、SH220消化爐美國海能公司；SH-3磁力攪拌器 北京金紫光科技發展有限公司；移液槍 Eppendorf公司；CR22DⅢ高速冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 AOT反膠束溶液的配制

分別稱取一定量的AOT表面活性劑置于錐形瓶中，加入一定體積的有機溶劑正己烷（反膠束相的質量濃度為0.08 g/mL，即1 mL正己烷中加入0.08 g的AOT），超聲使表面活性劑完全溶解。加入0.05 mol/L的電解質的緩沖溶液（濃度為0.07 mol/L KH2PO4＋Na2HPO4緩沖液），振蕩后靜置，溶液透明則為反膠束體系，反之則不是。

1.3.2 大豆蛋白前萃率的計算

分別取30 mL配制好的反膠束溶液，根據1.3.1節實驗結果分別加入0.05 mol/L的電解質的緩沖溶液，使各種反膠束溶液含水量值達到最大。然后加入一定量的全脂大豆粉（精確到0.000 1 g），在一定溫度的微波萃取儀中提取一段時間，然后進行離心分離去除殘渣。實現上清液中蛋白和油脂的同時分離，再用另一1 mol/L鹽溶液水相后萃，蛋白被后萃出來，經精制、冷凍干燥得到大豆蛋白。由于表面活性劑遇冷即沉淀，油-異辛烷可先冷卻到0～4 ℃，分離出表面活性劑，然后將油-有機溶劑相減壓蒸餾，實現油脂和異辛烷兩相分離（后萃數據未展示）。利用凱氏定氮法測定前萃液中的蛋白質含量，計算蛋白前萃率。

1.3.3 微波輔助反膠束前萃取大豆蛋白的單因素試驗

取20 mL 0.08 g/mL AOT的反膠束溶液，加入1.8 mL含0.05 mol/L KCl緩沖液（pH 7.0），全脂大豆粉加入量為0.02 g/mL，在不同溫度（30、35、40、45、50、55 ℃）與pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）條件下，分別將0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g的豆粉與反膠束溶液混合，在200 r/min下振蕩5、10、15、20、30、40、50 min，然后在4 000 r/min的條件下離心10 min，離心分離得上清液，每個樣重復測定3次，采用凱氏定氮法計算蛋白含量。

1.3.4 響應面試驗

通過以上各因素試驗，分別將微波提取溫度、液料比與時間對萃取大豆蛋白的綜合影響，采用DPS13.1數據處理系統設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，如表1所示，試驗結果分析均在DPS數據處理軟件下運行。

表1 Box-Behnken設計因子水平及編碼Table1 Variables and coded levels for Box-Behnken Design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

微波溫度是影響反膠束萃取的一個重要因素，其關系如圖1A所示。溫度低于45 ℃之前，隨著溫度的升高，蛋白萃取率呈現上升趨勢；溫度超過45 ℃以后，隨著溫度的升高，蛋白萃取率呈現下降趨勢。提取溫度在45 ℃左右時為最適，說明優化實驗溫度條件應在45 ℃附近尋找。

微波萃取時，溶液的pH值對微波的萃取效率產生一定影響，針對不同的萃取樣品，溶液有一個最佳的用于萃取的酸堿度。在圖1B中，pH值達到7時，蛋白前萃率達到最大值，隨著pH值的增大而減小，這與G?klen等[17]的研究結果是一致的。

圖1 溫度（A）、pH值（B）、樣品加入量（C）和時間（D）對蛋白質前萃率的影響Fig.1 Effect of extraction time, pH, sample loading amount and extraction time on the forward extraction efficiency of soybean protein

樣品加入量對蛋白前萃率的影響如圖1C所示。在豆粉加入量小于0.6 g時，蛋白質前萃率隨豆粉加入量增加而升高，在加入量為0.6 g左右時達到最大值，此后雖然豆粉加入量增加而前萃率卻逐漸降低。綜合考慮蛋白萃取率及生產成本的情況，為了在保證前萃率較高的前提下，又有較大的產量，樣品添加量可選取在0.6 g左右。

微波萃取時間對蛋白萃取率的影響如圖1D所示。蛋白質前萃率隨提取時間的走勢，呈先升高后降低的趨勢，在提取時間少于20 min時前萃率隨提取時間的延長而升高，在20 min左右時達到最大值，本實驗選取20 min左右為提取最適時間。

2.2 Box-Behnken試驗設計及結果

2.2.1 Box-Behnken試驗結果及方差分析

根據單因素試驗結果，選擇微波溫度、時間與pH值3個因素，采用Box-Behnken試驗設計進行試驗，實驗方案與結果見表2。

根據試驗結果進行方差分析由表3可知，擬合的二次多元方程的F值為46.473 3，說明用上述回歸方程描述的因變量與全自變量之間的回歸效果顯著。從回歸方程各項方差的進一步檢驗可以看出，失擬檢驗不顯著F1=0.856 2＜F0.05（17,7）=3.49，試驗誤差小。此外，決定系數R2用來檢查模型是否合適，其值為0.986 7，對大豆蛋白提取率來說，意味著98.67%樣品變化歸因于單變量，總變量中僅有1.33%不能通過模型來說明。數據證明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，顯著水平P＜0.05則可認為所選用的二次回歸模型是恰當的。

表3 響應面模型的方差分析Table3 Analysis of variance for the developed regression model

通過多項式回歸分析，各變量的回歸系數、t值和P值如表4所示。由表4可知，溫度（X1）對蛋白前率（Y）影響最顯著，對蛋白前萃率影響強弱分別為溫度＞時間＞pH值；且溫度（X1）與pH值（X3）交互作用顯著，溫度（X1）與pH值（X3）的平方對蛋白前萃率（Y）影響顯著。剔除不顯著項后，得方程：Y=73.073 333-7.5675X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67X12-21.244 166 67X32-5.392 5X1X3。

表4 回歸系數及顯著性檢驗Table4 Regression coefficients and statistical significance in the developed regression model

2.2.2 響應面圖分析

從圖2可以直觀的分析兩因子間的互作效應。當液料比與pH值一定時，蛋白前萃率隨著萃取時間的延長和萃取溫度的增加都是先增加后減??；圖2的響應面圖呈鐘罩型，說明萃取溫度和萃取時間的交互作用比較顯著，這和表4的結果一致（交互項中X1X3的P值最小）。

圖2 萃取溫度（X1）與萃取時間（X3）互作效應圖對蛋白前萃率的影響Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperatures (X1) and times (X3) on protein forward extraction efficiency

2.2.3 因素水平優化組合及驗證性實驗

根據以上的優化試驗，對回歸方解求解，得到最佳優化條件組合為溫度43.3 ℃、pH 8、提取時間23 min，在這些條件下，蛋白質的前萃率為80.61%，與理論值預測值81.01%的相對誤差很小，而在無微波條件下，反膠束萃取大豆蛋白的前萃率約在65%左右，說明應用微波輔助反膠束技術提取大豆蛋白能有效的縮短提取時間、提高提取率。

3 討 論

本實驗采用變頻微波輔助AOT-正己烷反膠束體系萃取全脂大豆粉中的大豆蛋白，在單因素試驗中，溫度過高會影響反膠束體系的穩定性，不利于蛋白質增溶。溫度對蛋白質萃取影響主要在于3 個方面：一是溫度升高可能導致滲透現象發生使反膠束結構破壞，造成蛋白質在水油兩相中分配系數下降；二是溫度升高時分子熱運動加快使傳質過程速率加快，進而萃取速率加快；三是溫度對于蛋白質活性的影響，一般說來較低溫度下有利于生物保持其活性溫度過高會使其活性破壞[18]。萃取的最適溫度由這3 個方面相互制約決定。值得注意一點是AOT為陰離子型表面活性劑，大豆蛋白的等電點大約為4.5，當緩沖液pH 7時，蛋白大量進入極性核內，蛋白前萃率較高，這說明大豆蛋白與陰離子型表面活性劑AOT分子之間的靜電吸引力并不是影響反膠束萃取蛋白質的主要推動力[19]。當緩沖液pH 7時，大豆蛋白分子帶負電，AOT陰離子表面活性劑反膠束體系的核內壁也是帶負電，此時大豆蛋白分子卻大量進入了極性核內，那么此種過程中蛋白進入反膠團內部的主要驅動力可能是離子交換機理，具體原理有待進一步實驗研究。此外，樣品的加入量過多，反而會影響前萃率，原因是反膠束溶液的聚集數增溶蛋白質的能力是有限的，導致樣品量加入過多時，反膠束溶液增溶蛋白質的能力反而降低，蛋白質進入反膠束內核水池產生了競爭機制導致蛋白質含量會減少，當然也不排除會有別的原因[20]。

在單因素試驗的基礎上，通過響應面優化試驗，建立影響影響蛋白質前萃率的溫度（X1）、pH值（X2）、提取時間（X3）的條件優化模型：

Y=73.073 333-7.567 5X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67-0.809 166 667-21.244 166 67-5.392 5X1X3＋3.375X2X3

因素對蛋白質前萃作用的大小順序依次為：提取時間＞溫度＞pH值，得出較優前萃條件為提取時間23 min、溫度43.3 ℃、pH 8，在此條件下蛋白質前萃率最高優化指標為80.61%，與優化方案的理論值81.01%比較接近，證明優化后的條件是可靠的。與無微波的反膠束萃取的大豆蛋白相比，微波輔助萃取，時間縮短了約7 min，提取率了提高了約15%，暗示著微波輔助反膠束體系更有利于大豆蛋白前萃。因此，本研究可為大豆蛋白的研究開發及工業化生產提供理論基礎。與相關的研究相比，研究雖然提高了前萃取率，但也存在一些不足之處，如表面活性劑與油相的分離等，本研究將進一步研究反膠束溶液對蛋白質的萃取，以提高大豆蛋白質前萃與后萃率，以提高蛋白得率，以及對蛋白液和油脂中表面活性劑的去除進行研究，并利用這一技術進行擴大應用實驗。

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Microwave-Assisted Forward Extraction of Soy Protein in AOT/Hexane Reverse Micelles

ZHAO Xiao-yan, CHEN Jun, WANG Xian-chang, CHEN Xiang-yan*, DENG Peng, LIN Yang
(Institute Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

A variable-frequency microwave-assisted method was applied in order to improve the forward extraction efficiency of soy protein in sodiumbis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) reverse micelles. The effects of experimental conditions such as temperature, pH value, the ratio of solution to material and extraction time on the extraction efficiency were examined. Response surface methodology (RSM) was used for modeling and optimizing the process to gain a better understanding of the process performance. By using RSM, the effects of temperature, pH value and extraction time on the extraction efficiency were calculated and their interactions were determined. After statistical analysis, the results showed that the effect of the extraction conditions followed the decreasing order: time ＞ temperature ＞ pH, and the optimum conditions were determined as follows: temperature 43.3 ℃, pH 8.0 and time 23 min, resulting in a yield of soy protein of 80.61%. This study showed that the variable-frequency microwave-assisted extraction can quickly enhance the extraction efficiency of soy protein in AOT reverse micelles.

soy protein; reverse micelles; microwave; forward extraction; response surface methodology

TS201.4

A

1002-6630（2014）10-0088-05

10.7506/spkx1002-6630-201410016

2013-09-17

山東省科技發展計劃項目（2011GGC02044）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101389）

趙曉燕（1975—），女，副研究員，博士，研究方向為食品理論與加工應用及生物粉體技術。

E-mail：zhaoxy_2201@163.com

*通信作者：陳相艷（1973—），女，研究員，碩士，研究方向為農產品精深加工。E-mail：chenxy@saas.ac.cn