響應面法優化酶輔助閃式提取二氫槲皮素工藝

柴 婧，付警輝，張衛鵬，鄭毅男，劉文叢

（吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

響應面法優化酶輔助閃式提取二氫槲皮素工藝

柴 婧，付警輝，張衛鵬，鄭毅男，劉文叢*

（吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

目 的：利用響應面法對纖維素酶輔助閃式提取二氫槲皮素的工藝條 件進行優化。方法：以二氫槲皮素的提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，應用Box-Behnken試驗設計，對影響提取率的條件（乙醇體積分數、加酶量和液料比）進行 優化。結果：最佳提取條件為乙醇體積分數60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時間120 s。結論：閃式提取操作簡便、節能、省時，可應用于二氫槲皮素大規模生產。

長白落葉松；二氫槲皮素；纖維素酶；閃式提取；響應面分析法

二氫槲皮素又名花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精等，化學名為5,7,3’,4’-四羥基二氫黃酮醇，分子式為C15H12O7，相對分子質量為304.25。二氫槲皮素廣泛存在于落葉松、水紅花、刺玫薔薇等60 余種植物當中[1-2]，其具有很多生物學活性，如抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗癌、抑制惡性腫瘤細胞生長[5]、調節酶活性[6]、防曬美白[7]、治療惡性淋巴細胞病變[8]等，因此被廣泛應用于食品、藥品、化妝品、工業、農業等多個領域[9]。

大部分植物的細胞壁都是纖維素構成，其有效成分往往被包裹在細胞壁內。纖維素酶廣泛的應用于植物的提取工藝中，它可以破壞植物的細胞壁，使構成植物細胞壁等不易利用的植物纖維分解成葡萄糖，從而有利于有效成分從植物中溶出[10-12]。閃式提取法是應用閃式提取器，利用植物組織破碎原理從而使有效成分從植物體中大量溶出的一種提取方法，具有快速、簡便、不需加熱等特點，可以節約大量的時間和能源，適合大規模工業生產[13-15]。

目前，落葉松中二氫槲皮素的提取方法及工藝優化主要有浸漬法[16]、回流提取法[17]、有機溶劑萃取法[18-20]、超聲提取法[21]、微波輔助提取法[22-23]、沉淀分離法[24-25]等，每種提取方法都存在著各自的優缺點。而用纖維素酶預處理后采用閃式提取長白落葉松中二氫槲皮素的方法鮮有研究。本研究以長白落葉松為原料，用纖維素酶預處理后，用閃式提取器提取長白落葉松中的二氫槲皮素，采用響應面分析法，根據Box-Behnken試驗設計原理，對提取工藝條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

落葉松取材于吉林省臨江市，由吉林農業大學鄭毅男教授鑒定為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）植物長白落葉松（Larix olgensis Henry var. koreana Nakai）。二氫槲皮素對照品（≥87.5%） 美國Sigma公司；乙醇、甲酸（均為分析純） 北京化工廠；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；纖維素酶 廣州蘇柯漢微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JHBE-50S閃式提取器 河南金鼎科技有限公司；BP211D型電子天平 德國Sartorius公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FW400A高速萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀（配有LC solution工作站、SPD-20A紫外檢測器） 日本島津公司；SZ-93自動雙重水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 二氫槲皮素高效液相色譜檢測方法

1.3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取二氫槲皮素對照品50 mg，用甲醇-水（2：3，V/V）定容于50 mL容量瓶中，分別移取0.5、1、4、6、8、10 mL對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（2：3）定容至刻度，得質量濃度分別為0.044、0.088、0.35、0.525、0.7、0.875 mg/mL的對照品溶液。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

取過30 目篩后的干燥長白落葉松粉末10 g，加入60%乙醇1 000 mL，閃式提取一次，時間為120 s，過濾，減壓回收溶劑，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.1.3 色譜條件

色譜柱：C O S M O S I L 5 C18-M S-Ⅱ（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1‰甲酸溶液（35：65，V/V）；流速1 mL/min；檢測波長288 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.3.1.4 標準曲線的繪制

將1.3.1.1節制備的對照品溶液進行含量分析。以二氫槲皮素對照品的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.1.5 精密度

精密吸取1.3.1.1節所制備對照品溶液20 μL，連續分析5次，測定峰面積，考察方法的精密度。

1.3.1.6 重復性

精密稱取過篩后長白落葉松干燥粉末5份，每份10 g。按1.3.1.2節方法制備供試品溶液進行分析，測定峰面積，考察方法的重復性。

1.3.1.7 穩定性

取1.3.1.2節供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、10 h進行分析，測定峰面積，考察方法的穩定性。

1.3.1.8 回收率

精密稱取5 份二氫槲皮素含量為19.08 mg/g的的長白落葉松樹材木屑（過30 目篩）10 g，加入二氫槲皮素對照品溶液10 mL（質量濃度分別為4.4、3.5、2.6 mg/mL），按1.3.1.2節方法制備供試品溶液后測定。

1.3.2 二氫槲皮素提取工藝的優化

1.3.2.1 單因素試驗

將烘干后長白落葉松粉碎，過30 目篩，取10 g過篩后木屑，加入一定量的纖維素酶和蒸餾水，用緩沖液調pH值至5，55 ℃水浴2 h，100 ℃滅活10 min。加入一定量的乙醇，進行閃式提取，提取1 次，過濾，減壓濃縮，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔濾膜過濾后測定含量，計算出二氫槲皮素提取率（每g干燥長白落葉松木屑所能提取出的二氫槲皮素質量/mg）。以二氫槲皮素的提取率為指標，選取乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、閃式提取時間（60、90、120、150、180 s）、加酶量（1、2、3、4、5 mg/g）和液料比（60：1、80：1、100：1、120：1、140：1）（mL/g）進行單因素試驗。

1.3.2.2 響應面分析試驗

綜合單因素試驗結果，應用響應面分析法對提取工藝參數進行優化。選取對二氫槲皮素提取率影響較大的3個因素：乙醇體積分數、加酶量和液料比。通過Design Expert 8.0軟件，根據Box-Behnken試驗設計原理，對提取工藝進行響應面分析。分析因素和水平設計如表1所示。

表1 響應面分析試驗因素與水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 二氫槲皮素高效液相色譜圖及方法評價結果

由如圖1可知，二氫槲皮素的保留時間為7.8 min左右。方法的線性回歸方程為Y=21 878 879.12X-1 951 064.44，R2=0.999 7，線性范圍0.044～0.875 mg/mL，計算得長白落葉松樹材木屑中二氫槲皮素平均含量為19.06 mg/g，與已知含量19.08 mg/g接近；本方法的精密度、重復性良好（RSD分別為1.3%、2.6%）；10 h內穩定性良好（RSD為1.9%）；平均加樣回收率（n=9）為99.2%，RSD為2.5%。表明該方法適于二氫槲皮素的測定。

圖1 二氫槲皮素對照品（A）和供試品（B）高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dihydroquercetin standard (A) and sample from pine wood chips (B)

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對二氫槲皮素提取率的影響

固定閃式提取時間120 s、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察乙醇體積分數對二氫槲皮素提取率的影響。由圖2可知，隨著乙醇體積分數的升高，二氫槲皮素的提取率也隨之增加，當乙醇體積分數達到60%時，二氫槲皮素的提取率達到最高，這是因為二氫槲皮素難溶于水，易溶于乙醇，隨后又隨著乙醇體積分數的增加而降低。因此，Box-Behnken試驗選取的乙醇體積分數的范圍為50%～70%。

圖2 乙醇體積分數對二氫槲皮素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of dihydroquercetin

2.2.2 閃式提取時間對二氫槲皮素提取率的影響

固定乙醇體積分數50%、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察閃式提取時間對二氫槲皮素提取率的影響。由圖3可知，雖然在150 s時，提取率有所降低，但所考察提取時間范圍內二氫槲皮素的提取率并沒有顯著變化，因此在響應面優化試驗中不再作為考察因素。

圖3 閃式提取時間對二氫槲皮素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.3 加酶量對二氫槲皮素提取率的影響

固定乙醇體積分數50%、閃式提取時間120 s、液料比70：1（mL/g），考察加酶量對二氫槲皮素提取率的影響。由圖4可知，隨著加酶量的增加，二氫槲皮素的提取率有所增加，在加酶量為3 mg/g時達到最大值，隨后又隨著加酶量的增加而有所降低，纖維素酶的用量應和落葉松木屑質量形成一定的比例才能發揮纖維素酶的最佳作用。因此，Box-Behnken試驗選取的加酶量的范圍為2～4 mg/g。

圖4 加酶量對二氫槲皮素提取率的影響Fig.4 Effect of cellulase concentration on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.4 液料比對二氫槲皮素提取率的影響

圖5 液料比對二氫槲皮素提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of dihydroquercetin

固定乙醇體積分數50%、閃式提取時間120 s、加酶量3 mg/g，考察液料比對二氫槲皮素提取率的影響。由圖5可知，隨著液料比的增加，二氫槲皮素的提取率增加，在液料比達到100：1（mL/g）時，二氫槲皮素的提取率達到最大值，隨著液料比繼續增加，二氫槲皮素的提取率趨于平穩，液料比的增加，可使落葉松木屑充分的與溶劑接觸，使有效成分快速溶解到溶劑中。因此Box-Behnken試驗選取的液料比的范圍為80：1～120：1（mL/g）。

2.3 響應面優化工藝條件

試驗設計及結果見表2，試驗號1～12為析因試驗，試驗號13～17為中心試驗。以二氫槲皮素提取率（Y）為響應值，各因素經回歸擬合后，得二次多項回歸方程為：

Y=23.22-0.026A＋0.29B＋0.10C＋0.06AB＋0.13AC＋0.067BC-0.14A2-0.32B2-0.41C2

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3為回歸模型方差分析結果，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），R2=0.991 7，失擬項不顯著，說明該模型與實際實驗擬合程度較好，可以用于二氫槲皮素提取的預測。從F值的分析結果（A（F=2.06）、B（F=257.65）、C（F=32.92））可以看出，在所選的各因素水平范圍內，對二氫槲皮素提取率影響大小的順序為：加酶量＞液料比＞乙醇體積分數。

從圖6可以看出，圖中均存在極值，即響應面的最高點，說明試驗所選范圍較合理。從圖6A可以看出，加酶量對二氫槲皮素提取率的影響較大，而乙醇體積分數相對較為平緩，說明乙醇體積分數對提取率的影響較小，兩者交互作用較弱。由圖6B可知，液料比的響應面變化更明顯、變化范圍更大；相反，乙醇體積分數變化較為平緩，從液料比的等高線與坐標軸的交點較多也可以看出液料比對二氫槲皮素的影響較大，等高線為橢圓形，極值對應的點接近橢圓形的中心，說明兩因素有很強的交互作用。從圖6C可以看出，加酶量相對于液料比對提取率的影響更大，并且兩者有一定的交互作用，但等高線幾乎為圓形，說明作用不是很強。

表3 回歸模型方差分析結果Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖6 各因素交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of three process conditions on the extraction yield of dihydroquercetin

2.4 提取工藝條件的確定

結合回歸模型分析結果可知，酶輔助閃式提取二氫槲皮素的最佳工藝條件為乙醇體積分數60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時間120 s。考慮到實際操作的可行性，將最優提取工藝調整為乙醇體積分數61%、加酶量3.5 mg/g、液料比104：1（mL/g）、提取時間120 s，實驗重復3 次，在此條件下二氫槲皮素的理論提取率為23.30 mg/g，實際提取率為23.22 mg/g。因此，響應面分析法所優化的最佳提取工藝數據真實可靠，可應用到酶輔助閃式提取二氫槲皮素的實際生產中。

3 結 論

應用響應面分析法對酶輔助閃式提取二氫槲皮素的提取工藝進行研究，采用合理的實驗設計，對提取工藝進行全面的剖析和評測，從而得到二氫槲皮素的最佳提取工藝：乙醇體積分數60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取時間120 s。應用此條件，二氫槲皮素的理論提取率為23.30 mg/g，實際提取率為23.22 mg/g。實際值與理論值基本相符，證明試驗模型可靠。將纖維素酶應用到二氫槲皮素的提取，可以大幅度的提高提取率，閃式提取方法簡便、節能、省時，可應用于二氫槲皮素的提取和生產。

[1] 崔寶玉, 劉玉, 劉喆, 等. 二氫懈皮素的研究進展[J]. 黑龍江科學, 2010, 1(4): 37-40.

[2] 張宏偉, 鄭偉. 二氫槲皮素的研究進展[J]. 口腔護理用品工業, 2011, 20(2): 25-28.

[3] ZARUBAEV V, GARSHININAL A, KALININA N, et al. Antiinfluenza activity of dihydroquercetin against lethal influenza virus infection[J]. Antiviral Research, 2010, 7(4): 50-86.

[4] 劉妍, 王遂. 二氫槲皮素的提取及抗氧化性研究[J]. 化學研究與應用, 2011, 21(1): 107-111.

[5] 翟延君, 程飛, 王添敏, 等. 花旗松素對人宮頸癌Hela細胞的體外抗腫瘤活性及其機理研究[J]. 中成藥, 2011, 33(12): 2052-2055.

[6] THERIAULT A, WANG Qi, van IDERSINE S C, et al. Modulation of hepatic lipoprotein synthesis and secretion by taxifolin[J]. Journal of Lipid Research, 2000, 41(12): 1969-1979.

[7] MIYAZAWA M, TAMURA N. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of Polygonum hydropiper L. (Benitade)[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(3): 595-597.

[8] AMBIKA DEVI M, DAS N. In vitro effects of natural plant polyphenols on the proliferation of normal and abnormal human lymphocytes and their secretions of interleukin-2[J]. Cancer Letters, 1993, 69(3): 191-196.

[9] 喬華, 謝鋆, 張曉云. 花旗松素的生物活性及其應用[J]. 中草藥, 2003, 34(8): 15-17.

[10] 陳榮珠, 張明亮, 蔡少麗, 等. 淺談纖維素酶及其應用[J]. 農產品加工, 2013, 55(4): 55-58.

[11] 劉曉晶, 李田, 翟增強. 纖維素酶的研究現狀及應用前景[J]. 安徽農業科學, 2011, 39(4): 1920-1921.

[12] 楊友坤, 朱鳳香, 王衛平, 等. 纖維素酶及其應用現狀[J]. 安徽農學通報, 2009, 15(3): 59-62.

[13] 謝捷, 李紅娟, 朱興一, 等. 響應面法優化閃式提取牛蒡苷的工藝優化[J]. 食品科學, 2010, 31(24): 33-36.

[14] 范成杰, 江道峰, 凌宗士. 響應面法優化黃芩中黃芩苷閃式提取工藝[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(6): 48-51.

[15] 劉延澤. 植物組織破碎提取法及閃式提取器的創制與實踐[J]. 中國天然藥物, 2007, 5(6): 401-407.

[16] 劉妍, 王遂. 二氫槲皮素的提取及抗氧化性研究[J]. 化學研究與應用, 2011(1): 107-111.

[17] 於洪建, 王暢. 從落葉松木屑中提取二氫槲皮素的方法: 中國, CN101993429A[P/OL]. (2011-03-30) [2013-07-30]. http://dbpub.cnki. net/grid2008/dbpub/detail.aspx?QueryID=9&CurRec=1&dbcode=SCP D&dbname=SCPD2011&filename=CN101993429A&urlid=&yx=&ui d=WEEvREcwSlJHSldSdnQ0UHBIV0FkcXZUVUwzWVdaOXI2Zk Z1MVZvZ2pobEoxZkNOeU9jUlN5aEdIRlI0RHlZPQ==.

[18] 才建輝, 戰鳳軍. 落葉松中萃取二氫槲皮素的方法: 中國, CN101333203[P/OL]. (2008-12-31) [2013-07-30]. http://dbpub.cnki. net/grid2008/dbpub/detail.aspx?QueryID=12&CurRec=1&dbcode=SCPD &dbname=SCPD0009&filename=CN101333203&urlid=&yx=&uid=W EEvREcwSlJHSldSdnQ0UHBIV0FkcXZUVUwzWVdaOXI2ZkZ1M VZvZ2pobEoxZkNOeU9jUlN5aEdIRlI0RHlZPQ==.

[19] 金建忠. 落葉松中二氫槲皮素的提取工藝研究[J]. 林產化工通訊, 2005(4): 12-15.

[20] 王正平, 劉瑩. 一種從落葉松中提取二氫槲皮素的方法: 中國, CN1844095[P/OL]. (2006-10-11) [2013-07-30]. http://dbpub. cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?QueryID=15&CurRec=1&dbcod e=SCPD&dbname=SCPD0009&filename=CN1844095&urlid=&yx= &uid=WEEvREcwSlJHSldSdnQ0UHBIV0FkcXZUVUwzWVdaOXI 2ZkZ1MVZvZ2pobEoxZkNOeU9jUlN5aEdIRlI0RHlZPQ==.

[21] 馬春慧, 李偉, 孫震, 等. 乙醇超聲法提取二氫槲皮素工藝優化[J].中國造紙, 2010, 42(2): 78-80.

[22] 馬春慧, 孫震, 黃金明, 等. 超聲-微波交替法提取落葉松二氫槲皮素[J].化工進展, 2010, 30(1): 134-139.

[23] 韓俊鳳, 賈林艷. 落葉松中二氫槲皮素提取新工藝研究[J]. 安徽農業科學, 2009, 49(24): 11385-11387.

[24] 金建忠, 申屠超, 許惠英, 等. 落葉松中二氫槲皮素的提取及鑒定[J].浙江林業科技, 2004, 33(5): 16-18.

[25] 魏艷, 陳曉青, 馬志祥, 等. 紅蓼不同提取部位花旗松素和總黃酮含量的測定[J]. 中成藥, 2008(12): 1853-1855.

Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Dihydroquercetin by Response Surface Methodology

CHAI Jing, FU Jing-hui, ZHANG Wei-peng, ZHENG Yi-nan, LIU Wen-cong*
(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To optimize the celluase-assisted extraction of dihydroquercetin from Larix olgensis Henry var. koreana Nakai wood chips by response surface methodology (RSM). Methods: Dihydroquercetin was extracted with ethanol in a herbal blitzkrieg extractor from pine wood chips pre-hydrolyzed with celluase. On the basis of the results of single-factor experiments, a Box-Behnken design was performed to optimize three extraction conditio ns including ethanol concentration, enzyme dosage and liquid-to-solid ratio. Results: The optimal extraction conditions were determined as hydrolysis with an enzyme dosage of 3.48 mg/g and subsequent extraction for 120 s with 60.93% ethanol in water at a liquid-to-solid ratio of 103.64:1 (mL/g). Conclusion: The proposed extraction procedure can provide a simple, energy-saving and time-saving way for massive production of dihydroquercetin.

Larix olgensis Henry var. koreana Nakai; dihydroquercetin; cellulase; extraction; response surface methodology (RSM)

R931.6

A

1002-6630（2014）10-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201410017

2013-07-30

吉林省科技廳項目（20115064）

柴婧（1988 —），女，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：chaijing880426@qq.com

*通信作者：劉文叢（1968—），男，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：jwlw6803@126.com