不同預處理方式對堿法提取米渣蛋白得率的影響

劉愛民，馮定山，張園園，盧存龍，曹圓圓

（安徽師范大學生命科學學 院，生態環境與生態安全安徽省高校重點實驗室，重要生物資源的保護與利用研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

不同預處理方式對堿法提取米渣蛋白得率的影響

劉愛民，馮定山，張園園，盧存龍，曹圓圓

（安徽師范大學生命科學學 院，生態環境與生態安全安徽省高校重點實驗室，重要生物資源的保護與利用研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

研究不同的預處理方式對堿法提取米渣蛋白得率的影響。結果表明：分別用質量分數0.5%檸檬酸或稀釋20倍的醋酸（0.875 mol/L）對米渣在25 ℃處理180 min，再用0.1 mol/L NaOH溶液提取，溫度50 ℃，提取時間27 h，則蛋白提取率有較大提高；蛋 白質提取率分別為84.60%和80.1%，高于未經過酸處 理的米渣蛋白提取率。質量分數為0.5%檸檬酸和 稀釋20 倍（0.875 mol/L）的醋酸預處理的大米渣蛋白質經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，用體積分數18%分離膠有利于蛋白質電泳的分離；蛋白質在提取過程中分解成小的片段，主要集中在9.5 kD和4.1 kD附近，其中4.1 kD蛋白含量較多，且用質量分數0.5%檸檬酸預處理后堿法提取的蛋白質顏色純白鮮亮，質地細膩潤滑。

大米渣；預處理；蛋白質；提取率；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

大米蛋白是一種優質植物蛋白，大米含有8%蛋白，按其溶解性分為清蛋白﹑球蛋白﹑醇溶蛋白[1]和谷蛋白，其中谷蛋白占80%以上。由于大米蛋白含量低，直接從大米中提取蛋白質的成本較高，經濟性較差[2]。在以大米為原料發酵生產味精﹑葡萄糖等工業生產中僅用了大米中的淀粉，其中的大米蛋白沒能得到很好地利用。大米經高溫液化和糖化后得到的米渣，蛋白質含量約為50%，為原料大米蛋白質含量的5～7 倍[3]，是制備大米蛋白的理想原料[4]。米渣蛋白是熱變性的大米蛋白，具有大米蛋白的一切優點，及良好的氨基酸組成配比，含有機體所需的必需氨基酸，尤其賴氨酸，具有口感溫、低過敏性和降低膽固醇等優點[5]，從經濟角度考慮，從米渣中制備大米蛋白更具經濟性和實用性。大米蛋白主要是谷蛋白，在中性條件下溶解度較低，經過高溫液化糖化后，米渣內部的蛋白溶解度進一步降低，限制了其在食品中的應用[6]。近年來已開始對米渣中蛋白質的提取進行研究，但由于米渣中蛋白質的溶解性極差，采用傳統水溶液提取的方法很難將蛋白質提取出來，因此需要增加米渣蛋白的溶解度[7-8]。目前米渣主要用作飼料原料，而作為飼料原料出售價格低，經濟效應不明顯[9]。

大米蛋白的制備主要有堿溶酸沉法﹑酶法﹑物理分離法和排雜法等[10]。采用堿溶酸沉法可提取得到純度相對較高的大米蛋白[11]，王亞林等[12]在pH 12、堿提2 h、溫度40 ℃，蛋白質提取率可達49.9%，產品蛋白質含量為71.1%。酶法制備大米蛋白主要利用蛋白酶等對大米蛋白進行降解和修飾，使其變成可溶性肽后被提取出來[13]。頓新鵬等[14]提出酶法水解米渣中蛋白質制備小分子肽方法[15]，溫度50 ℃﹑時間6 h水解條件下，蛋白質提取率能達63.4%。單純使用堿法或酶法存在優劣，人們開始考慮采用復合提取方法，既保證產品質量和產率又盡可能地降低生產成本。陳季旺等[16]通過堿酶兩步法從碎米中提取大米蛋白，大米蛋白提取率可達到70.22%，純度為85.75%。排雜法是通過各種手段，盡量把各種非蛋白成分除去，最終獲得高純度的米渣蛋白。近幾年有利用發酵法提高大米蛋白純度的相關報道，紀鳳娣等[17]對以乳酸菌發酵提純大米蛋白的方法進行了探討，并與水洗法和淀粉酶酶解法進行比較，結果表明，以乳酸菌發酵提純大米蛋白效果最好，大米蛋白由初始的65%提高到89%，雖然發酵制備的大米蛋白純度較高，但是發酵周期較長。Liao等[18]用醋酸來處理小麥谷蛋白去酰胺化，使得酶解更容易，口味更接近谷蛋白且營養更豐富。國內對米渣蛋白在食品應用的研究還處于初試階段，所以前景很廣闊[19-20]。

本實驗采用大米渣為原料，在前人研究基礎之上，改進方法，通過先弱酸處理后堿提取，使米渣蛋白改性，使之更易提取，提高其提取率和蛋白質純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米渣由某糖漿加工廠家提供大米渣干燥而成，其蛋白質含量經測定含量為58.2%。

氫氧化鈉（分析純）、95%乙醇（含量≥95%）無錫市展望化工試劑有限公司；冰乙酸（含量99.0%，17.5 mol/L） 上海試劑一廠綜合經營公司；三羥甲基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris，含量≥99.0%） 上海惠興生化試劑有限公司；無水檸檬酸（純度≥99.5%）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr，含量≥99.9%）、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide，Bis，含量≥99.0%）、N,N,N,N,-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamin，TEMED，含量≥99.0%）、超低分子質量標準蛋白（Marker 4 100～66 000 D）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，SB0485含量≥99.0%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；考馬斯亮藍R250 上海化學試劑站分裝廠。

1.2 儀器與設備

TDL80-2B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造；HWS-28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；KDN-O8消化爐 浙江托普儀器有限公司；Freezone 215L冷凍干燥機 USA LABCONCO公司；SKY-2102C恒溫搖床 上海蘇坤實業有限公司；DYY-Ⅲ24型垂直電泳槽 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米渣常規成分含量的測定

蛋白含量的測定：凱氏定氮法（固體總蛋白）[21]和GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》方法；脂肪的測定：索氏抽提法[22]和GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》方法；還原糖和總糖的測定：DNS法[23]。

1.3.2 檸檬酸和醋酸對米渣蛋白預處理

米渣先經過研磨處理，然后過100 目篩子處理，收集粒度為0.15 mm的米渣，稱取米渣分為11份，每份3 g于燒杯中，分別加入質量分數0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%檸檬酸和稀釋0、2、5、10、20倍醋酸（即濃度為17.5、8.75、3.5、1.75、0.875 mol/L）各10 mL，另外一組作為對照不做任何預處理。混合并適當攪拌，在25 ℃條件下處理60、90、120、180、240 min等不同時間，再將米渣用紗布過濾去酸，置于65 ℃烘干米渣，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL，放入50 ℃水浴鍋中慢慢攪拌均勻，處理27 h，使蛋白質在堿性狀態下溶解。3 000 r/min離心20 min，分離去渣，取蛋白液加入0.1 mol/L的鹽酸調節蛋白液至等電點4.0，4 ℃冰箱靜置一夜，蛋白質沉淀完全后3 000 r/min離心10 min后分離，真空冷凍干燥即得成品，測定含量[19]。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

NaOH提取的蛋白質液加酸中和至pH 7左右，吸取200 ?L放入離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取50 ?L與2 倍樣品緩沖液混合，100 ℃水浴10 min后立即上樣。

根據郭堯君[23]分別制備體積分數12%、15%、18%分離膠和體積分數5%濃縮膠，電泳上下槽倒入緩沖液，取出備用樣品，待溶化后12 000 r/min離心10 min后，微量注射器吸取15 ?L上樣，剛開始100 V，待染色帶進入分離膠后增加至120 V，當染料帶抵達底部約1 cm處，電壓緩緩歸零，取出膠，左上角切一小塊以標記樣品順序，考馬斯亮藍R250染色1 h左右，然后脫色2～3 h左右，直至背景清晰。

1.3.4 產品提取率的計算

式中：G為米渣蛋白得率/%；M為分離物中米渣蛋白的質量/g；N為米渣中蛋白質含量/g。

1.3.5 數據處理

Excel 2003分析和SPSS Statistics 19.0分析處理數據。

2 結果與分析

2.1 米渣基本成分分析

表1 米渣基本成分Table1 Proximate composition of rice residue

米渣各成分含量如表1所示，米渣中蛋白的含量為58.2%，含量較高，是制備米渣蛋白的良好原料。米渣中除蛋白成分外，其非蛋白成分主要有糖、脂肪、纖維等。

2.2 不同預處理方式對米渣蛋白堿法提取率的影響

2.2.1 不同質量分數檸檬酸對米渣蛋白提取率的影響

取不同質量分數檸檬酸0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%處理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度為0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其上清液等電點處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質量。

圖1 檸檬酸質量濃度對米渣蛋白質堿法提取率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of citric acid on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖1可知，在檸檬酸質量分數在0.5%以下時，用堿法提取的大米渣蛋白質提取率隨檸檬酸質量濃度增加而逐漸升高，當檸檬酸質量分數超過0.5%后，蛋白質提取率有下降趨勢。而用質量分數0.5%檸檬酸預處理后，蛋白質提取率高達84.60%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率高出38.60%。

2.2.2 檸檬酸預處理時間對米渣蛋白提取率影響

取質量分數0.5%檸檬酸常溫處理60、90、120、180、240 min后，過濾去酸，烘干米渣，粒度為0.15 mm，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其清液等電點處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質量。

圖2 檸檬酸處理時間對米渣蛋白質堿法提取率影響Fig.2 Effect of citric acid pretreatment time on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖2可知，在檸檬酸處理時間為180 min 處，蛋白質提取率已經達到最大值，為81.03%，此后隨處理時間增加，蛋白質提取率增加并不明顯，這是因為檸檬酸處理時發生去酰胺反應在180 min左右比較完全，有利于堿法提取蛋白質。

2.2.3 醋酸濃度對米渣蛋白提取率的影響

取不同稀釋濃度醋酸處理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度為0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其上清液等電點處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質量。

圖3 不同濃度醋酸對米渣蛋白堿法提取率影響Fig.3 Effect of acetic acid at different concentrations on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖3可以看出，經過醋酸預處理的米渣蛋白提取率在80%左右，而未經醋酸處理的米渣蛋白堿法提取率只有45.25%。由于醋酸對米渣蛋白有去酰胺作用，即酰胺基團中的氨基變成高親水的羧基，分子內氫鍵的減少和分子間靜電排斥的增加使米渣蛋白溶解性提高。但如果醋酸濃度太高，水洗時會浪費大量水，且腐蝕儀器設備，稀釋20倍的醋酸處理后，蛋白質提取率達80.10%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率46%高出34.1%，比王亞林等[12]在pH 12、堿提2 h、溫度40 ℃，蛋白質提取率49.9%，高出30%左右。

2.3 酸處理后堿提取的蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖4顯示，用體積分數為18%分離膠效果較好，SDS-PAGE電泳結果可以看出，質量分數為0.5%檸檬酸和稀釋20 倍醋酸預處理后蛋白電泳相似，且譜帶清晰，但醋酸預處理蛋白電泳D部分電泳是獨有的，D部分條帶明顯小于4.1 kD。兩者A部分電泳條帶拖尾較嚴重，相對分子質量集中在35～66 kD之間。B部分集中在6.5～9.5 kD（主要集中在9.5 kD附近），C部分蛋白集中在4.1 kD附近，含量較多，說明大米渣的蛋白質經過檸檬酸與醋酸處理后堿法提取對米渣蛋白有水解作用，在提取過程中米渣蛋白被分解成小片段或者亞基，這與王章存[4]測的米渣蛋白谷蛋白最低13 kD要小很多，說明蛋白質在提取過程中分解了。另外提取米渣谷蛋白邊緣不太清晰，這是糖蛋白共同特征[23]。

圖4 酸預處理后提取的米渣蛋白的SDS-PAGE圖譜（18%分離膠）Fig.4 SDS-PAGE patterns of rice residue protein obtained with acid pretreatments (18% separating gel)

2.4 酸處理后堿提取米渣蛋白樣品圖

取酸處理后和未處理的烘干米渣各0.2 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其清液等電點處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥。

圖5 不同預處理大米渣蛋白樣品Fig.5 Rice residue protein samples after different pretreatments

從圖5可以看出，圖5d原料大米渣，未過篩，樣品粗糙，色澤黃；而圖5a中用質量分數0.5%檸檬酸預處理后再堿法提取的米渣蛋白色澤純白，細膩潤滑，質地較好；圖5c為稀釋20倍（0.875 mol/L）醋酸預處理后再堿法提取的米渣蛋白，色澤有點偏黃；圖5b為未用酸處理而直接用堿法提取的米渣蛋白。由此可見，質量分數0.5%檸檬酸預處理米渣后對堿法提取米渣蛋白的樣品顏色有增白效果，產品質量較高。

3 結 論

通過分析不同預處理方式對堿提取米渣蛋白率影響可知：先用質量分數為0.5%檸檬酸或稀釋20倍（0.875mol/L）的醋酸對米渣蛋白25 ℃預處理180 min，然后用0.1 mol/L NaOH溶液、50 ℃提取27 h，米渣蛋白提取率大幅度提高，分別為84.60%和80.1%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率46%分別高出38.60%和34.1%。而質量分數0.5%檸檬酸處理后米渣提取蛋白顏色純白，細膩潤滑，質地較好。此法尚未見報道，產品質地也優于目前已報道的。

SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，酸處理后堿法提取的米渣蛋白主要集中在9.5 kD和4.1 kD左右，其中4.1 kD蛋白含量較多，蛋白質在提取過程中分解成較小的片段。

[1] KILCOYNE M, SHAH M, GERLACH J Q, et al. O-glycosylation of protein subpopulations in alcohol-extracted rice proteins[J]. Journal of Plant Physiology, 2009, 166(3): 219-232.

[2] SHIH F F, DAIGLE K W. Preparation and characterization of rice protein isolates[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2000, 77(8): 885-889.

[3] 榮先萍, 彭奇均. 米渣蛋白組成成分及提取工藝研究[J]. 應用化工, 2010, 39(6): 800-807.

[4] 王章存. 米渣蛋白的制備及其酶法水解研究[D]. 無錫: 江南大學, 2005: 1-2.

[5] JOSEPH C. Correlations between the physicochemical and functional properties of rice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(9): 1683-1686.

[6] 郭興鳳, 張娟娟, 慕運動, 等. RSM優化堿性蛋白酶提取米渣中蛋白質的工藝條件[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(2): 7-11.

[7] HAMDA J S. Characterization of protein fractions of rice bran to devise effective methods of protein solubilization[J]. Cereal Chemistry, 1997, 74(1): 662-668.

[8] LIU J, YAO H Y, CHEN Z X. Study on mechanism of solubilization of rice dreg protein concentrates[J]. Food Science, 2007, 28(2): 214-219.

[9] 王威, 曾里, 曾凡駿, 等. 中性蛋白酶提取米渣中大米蛋白的工藝研究[J]. 飼料工業, 2008, 29(6): 35-37.

[10] 陳升軍, 熊華, 李庭, 等. 米渣蛋白酶解及酶解物功能性質研究[J].食品與發酵工業, 2008, 34(5): 114-118.

[11] 江漓, 林洮, 趙小虎, 等. 除雜和酶法相結合提取米渣蛋白[J]. 食品科技, 2011, 36(12): 179-183.

[12] 王亞林, 鐘方旭. 大米糟渣堿法提取食用蛋白質的研究[J]. 武漢化工學院學報, 2001, 23(3): 8-10.

[13] ZHAO Q, XIONG H, SELOMULYA C, et al. Enzymatic hydrolysis of rice dreg protein: effects of enzyme type on the functional properties and antioxidant activities of recovered proteins[J]. Food Chemistry. 2012, 134(3): 1360-1367.

[14] 頓新鵬, 陳正望. 酶法水解米渣蛋白質制備大米小分子肽[J]. 食品科學, 2004, 25(6): 113-117.

[15] SARMADI B H, ISMAIL A. Antioxidative peptides from food proteins: a review[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1949-1956.

[16] 陳季旺, 夏文水. 堿酶兩步法提取米渣中蛋白質的研究[J]. 農業工程學報, 2006, 22(5): 169-172.

[17] 紀鳳娣, 魯緋. 大米蛋白提純方法的研究[J]. 中國釀造, 2008, 27(14): 109-111.

[18] LIAO L, LIU T X, ZHAO M M. Functional, nutritional and conformational changes from deamidation of wheat gluten with succinic acid and citric acid[J]. Food Chemistry, 2010, 123(1): 123-130.

[19] 田蔚, 林親錄, 劉一洋. 米渣蛋白的提取及應用研究[J]. 糧食加工, 2009, 34(2): 31-34.

[20] LI X, XIONG H, YANG K W, et al. Effects of rice dreg protein and its hydrolysate on growth performance and small intestine morphology of early-weaned rats[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(4): 687-693.

[21] 程覺民, 沈蓓英, 王生林. 大米蛋白質抽提工藝的研究[J]. 糧食與飼料工業, 1989, 12(5): 11-15.

[22] 陳鈞輝, 陶力, 李俊, 等. 生物化學實驗[M]. 3版. 北京: 科學出版社, 2005: 26-29.

[23] 郭堯君. 蛋白質電泳實驗技術[M]. 北京: 科學出版社, 1999: 92-118.

Effect of Different Pretreatments on the Efficiency of Alkaline Extraction of Protein from Rice Residue

LIU Ai-min, FENG Ding-shan, ZHANG Yuan-yuan, LU Cun-long, CAO Yuan-yuan
(College of Life Sciences, Key Laboratories of Biotic Environment and Ecological Safety, Conservation and Utilization of Biological Resource in Anhui Province, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

In this study, experiments were conducted to examine the effect of different pretreatments on the extraction efficiency of protein from rice residue using alkaline. The results showed the extraction efficiency of protein was increased largely compared to that without pretreatment, reaching 84.60% and 80.1%, respectively, when rice residue was soaked for 180 min in 0.5% citric acid or 0.875 mol/L acetic acid at 25 ℃ before being extracted at 50 ℃ for 27 h with 0.1 mol/L NaOH. The rice proteins extracted from both pretreated samples were could be effectively separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with 18% separating gel. During the extraction process, rice proteins were decomposed into fragments mostly having a molecular weight around 9.5 or 4.1 kD, especially around the smaller molecular weight. Moreover, the rice residue protein obtained with 0.5% citric acid pretreatment had a bright purewhite color and a smooth and delicate texture.

rice residue; pretreatment; protein; extraction efficiency; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Q819

A

1002-6630（2014）10-0103-04

10.7506/spkx1002-6630-201410019

2013-10-12

2012年度安徽師范大學創新基金項目（2012cxjj04）；農業部農村可再生能源開發利用重點實驗室開放課題（2013006）；2012年度教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20123424110004）；2012年度國 家級大學生創新創業訓練計劃項目（201210370089）；2014年度安徽省自然科學基金項目（1408085MC53）

劉愛民（1968—），女，副教授，博士，研究方向為食品加工資源化利用。E-mail：amliu9393@163.com