超聲波場中酶法合成L-抗壞血酸豆蔻酸酯及其抗氧化性

羅慧文，李 卓

（暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

超聲波場中酶法合成L-抗壞血酸豆蔻酸酯及其抗氧化性

羅慧文，李 卓*

（暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632）

以固定化脂肪酶（Novozym?435）為催化劑，在超聲波場中合成L-抗壞血酸豆蔻酸酯，分別測定L-抗壞血酸豆蔻酸酯的清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力。結果表明：超聲波可以顯著加速底物在叔丁醇中的溶解，并使反應時間由48 h縮短到4 h，產(chǎn)率達77.58%，純化后產(chǎn)物純度為98.1%，固定化脂肪酶可重復利用4 次。L-抗壞血酸豆蔻酸酯具有很強的抗氧化性能，在等質(zhì)量濃度條件下與L-抗壞血酸棕櫚酸酯相當，優(yōu)于特丁基對苯二酚，同時添加入油脂時其抗氧化能力也較優(yōu)。

超聲波；脂肪酶催化合成；L-抗壞血酸豆蔻酸酯；抗氧化性

L-抗壞血酸（VC）是較強的水溶性抗氧化劑，但其親水性限制了其在脂溶性食品方面的應用。當疏水性的長鏈脂肪酸基團與L-抗壞血酸分子經(jīng)過酯化反應連接后，其親油性增加，使之具有抗氧化性和乳化性兩種性能[1-3]。L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成方法有多種，一類是得率較高，但反應條件劇烈化學合成法[3]，一類是反應條件溫和、副反應少的脂肪酶催化酯合成反應[3]。目前已有報道的研究主要集中在少數(shù)幾種L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成和性質(zhì)研究，如L-抗壞血酸棕櫚酸酯（L-ascorbyl palmitate，L-AP）等[4-13]。制約L-抗壞血酸脂肪酸酯產(chǎn)率提高的因素是水溶性的L-抗壞血酸在溶液的溶解度小和底物局部濃度不均勻。而超聲波產(chǎn)生的高頻振動不僅能促進底物L-抗壞血酸的溶解，并且可以使底物均勻分散在溶劑中，提高底物與酶的有效碰撞次數(shù)，有助于反應的加速進行[14-16]。本實驗合成一種新型L-抗壞血酸脂肪酸酯——L-抗壞血酸豆蔻酸酯（L-ascorbyl myristate，L-AM），并確定在超聲波場中酶法合成的最佳合成條件，對產(chǎn)物的純度和結構進行了分析鑒定，同時測試了固定化脂肪酶（Novozym?435）可以重復使用的次數(shù)。另外對L-抗壞血酸豆蔻酸酯進行了抗氧化性測試，從羥自由基體系、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基體系、還原力測試以及氧化誘導時間測定等方面進行研究，以期為新型L-抗壞血酸脂肪酸酯衍生物的合成與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸 天津西爾斯化工有限公司；豆蔻酸、無水硫 酸鎂、三氯乙酸 廣州化學試劑廠；鄰二氮菲沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司；叔丁醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯化鐵、硫酸亞鐵 天津市富宇精細化工有限公司；變色硅膠 國藥集團試劑有限公司；4?分子篩河南環(huán)宇分子篩有限公司；以上材料均為分析純；DPPH美國Sigma-Aldrich公司；葵花籽油、大豆油 金龍魚股份有限公司。

1.2 儀器與設備

SB25-12DTDN超聲波處理機 寧波新芝生物科技有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海榮亞生化儀器廠；FZG-4型真空干燥箱 南京華奧干燥設備有限公司；X-5顯微熔點測定儀 北京泰克儀器有限公司；TD4K-Z臺式低速離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司；UV-1601紫外-可見分光光度儀 北京瑞利分析儀器有限公司；EQUINOX 55型紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器公司；4000Q Trap質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；743型Rancimat氧化穩(wěn)定性測試儀 瑞士萬通（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 合成方法

L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、叔丁醇50 mL、固定化脂肪酶（Novozym?435）0.35 g、4 ?分子篩5 g，同時加入圓底燒瓶，超聲功率密度0.40 W/cm2、水浴恒溫55 ℃、反應時間4 h。

收集反應液，用布氏漏斗減壓抽濾進行固液分離，溶液經(jīng)減壓蒸餾分離出溶劑叔丁醇，真空干燥進一步分離出溶劑叔丁醇，將溶液用乙酸乙酯溶解，水洗分液后，溶液用無水硫酸鎂干燥12 h，再經(jīng)減壓抽濾除去干燥劑，所得濾液減壓蒸餾分離出乙酸乙酯，之后經(jīng)兩次甲苯重結晶，正己烷洗滌，最后真空干燥5 h得到產(chǎn)物，稱質(zhì)量并計算產(chǎn)率。

紅外光譜使用傅里葉變換紅外光譜儀測定，晶體直接測量，掃描范圍500～4 000 cm-1。質(zhì)譜由AB SCIEX公司4000Q Trap質(zhì)譜儀測定，負離子模式，電噴霧離子源，質(zhì)量掃描范圍0～1 000。

1.3.2 純度測定

采用GB 16314—1996《食品添加劑：L-抗壞血酸棕櫚酸酯》的碘量法方法測定產(chǎn)物的純度[17]，并且用顯微熔點儀測定產(chǎn)物熔程。

1.3.3 羥自由基清除能力測定

基于Fenton反應的原理，具體測定過程如下：配制0.2 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液、0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液、0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.01%過氧化氫和一系列質(zhì)量濃度梯度的L-AM乙醇溶液。取5支5 mL試管，標號1、2、3、4和空白，每只試管加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液與1 mL鄰二氮菲無水乙醇溶液，充分振蕩均勻，在1、2、3、4號試管中分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品，再分別加入1 mL 0.01%過氧化氫；空白試管中加入2 mL蒸餾水以補充體積。將5 支試管置于37 ℃恒溫水浴鍋中保存1 h后，取出，用分光光度儀在536 nm波長處分別測定每支試管溶液的吸光度，并記錄[18-22]。結果與特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、L-AP、VC等幾種抗氧化劑進行比較。計算依據(jù)參照式（1）：

1.3.4 DPPH自由基清除能力測定

測定過程如下：配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液、一系列質(zhì)量濃度梯度的L-AM的乙醇溶液。取若干10 mL試管，分別加入2 mL的DPPH自由基乙醇溶液，以及不同的質(zhì)量濃度L-A M酯樣品的乙醇液，空白組加入2 mL DPPH溶液與2 mL乙醇，所有試管振蕩搖勻后，將其放入暗室靜置30 min。取出樣品，以無水乙醇對分光光度儀進行調(diào)零，測定各試液在517 nm波長處的吸光度A樣品，空白組吸光度記為ADPPH，并與TBHQ、VC、L-AP等幾種抗氧化劑進行比較[18-22]。樣品對DPPH自由基清除率按式（2）計算：

1.3.5 L-AM的還原能力測定

基于普魯士藍法[11]的改進，測定L-AM的還原能力。配制一定梯度的乙醇溶液、0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液、2.5 mL 1%的鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）、0.1%的三氯化鐵溶液、10%的三氯乙酸溶液。取10 mL離心管，分別加入0.5 mL L-AM樣品溶液2.5 mL磷酸緩沖溶液和2.5 mL鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6），振蕩混勻，置于50 ℃恒溫水浴鍋中，20 min后取出并迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。取上清液2.5 mL于試管中，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，振蕩搖勻后，室溫條件下靜置10 min。利用分光光度儀于700 nm波長處檢測樣品的吸光度（此處的吸光度越高，則樣品的還原能力越強）[18-22]。并與TBHQ、VC、L-AP等幾種抗氧化劑進行比較。

1.3.6 L-AM在油脂中的抗氧化性

測定L-AM在油脂中的抗氧化性，首先將各種抗氧化劑配制成1.0 mg/mL的乙醇溶液，分別加入油樣，配成相應200 μg/kg級的試樣3 g并標記。通過測定油樣氧化誘導期，比較各抗氧化劑的抗氧化性[23-26]。并與TBHQ、VC、L-AP等幾種抗氧化劑進行比較。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上測定均做3 個平行實驗，最后結果取3 次測定結果的平均值。

2 結果與分析

2.1 L-AM產(chǎn)物的合成及分離純化

2.1.1 溶劑對產(chǎn)率的影響

圖1 溶劑對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of solvents on the yield of L-ascorbic myristate

溶劑的極性與溶解性是否合適，對脂肪酶催化合成的效率有很大影響。實驗分別選用正己烷、氯仿、叔戊醇、叔丁醇、四氫呋喃、丙酮、乙醇和甲醇作為溶劑，探究不同的溶劑對L-AM產(chǎn)率的影響。分別選用不同的溶劑，保持其他條件恒定：L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4 ?分子篩5 g、脂肪酶0.35 g、恒溫水浴溫度55 ℃、超聲密度0.40 W/cm2、反應4 h。如圖1所示，以正己烷、氯仿、乙醇及甲醇為溶劑時L-AM的產(chǎn)率幾乎為0，四氫呋喃溶劑中L-AM的產(chǎn)率約為14%，丙酮作為溶劑時的產(chǎn)率將近45.21%，相比之下，叔戊醇和叔丁醇是更為理想的溶劑，兩者作為溶劑合成L-AM的產(chǎn)率最高，分別為76.89%和75.33%。常壓條件下叔丁醇（沸點為82.5 ℃）相比叔戊醇（沸點為102 ℃）的沸點低，純化處理階段，叔丁醇在減壓蒸餾過程中更易揮發(fā)除去，故叔丁醇為最理想的溶劑。

2.1.2 反應時間對產(chǎn)率的影響

圖2 反應時間對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of L-ascorbic myristate

以反應的時間為單因素，保持其他條件恒定：叔丁醇50 mL、L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4?分子篩5 g、脂肪酶0.35 g、恒溫水浴溫度55 ℃、超聲密度0.40 W/cm2，分別反應1、2、3、4、5、6 h，其產(chǎn)率變化如圖2所示，反應時間由1 h變化至3 h的過程中，L-AM產(chǎn)率隨時間的延長有明顯的提高，3～4 h產(chǎn)率提高的速率減緩，4 h以后產(chǎn)率基本維持在75%左右，進一步延長時間對產(chǎn)率的提高作用不顯著，故選取4 h為最佳反應時間。

2.1.3 溫度對產(chǎn)率的影響

圖3 溫度對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of L-ascorbic myristate

以恒溫水浴的溫度為變量，保持其他條件恒定：叔丁醇50 mL、L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4 ?分子篩5 g、脂肪酶0.35 g、超聲密度0.40 W/cm2、反應4 h。探究反應溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃條件下，L-AM產(chǎn)率的不同。如圖3所示，反應溫度在55～60 ℃的范圍內(nèi)，L-AM的產(chǎn)率最高。溫度過低或者溫度過高時，固定化脂肪酶的活性收到較大影響，且溫度較高不利于L-AM的抗氧化基團連烯二醇結構的穩(wěn)定，故選取55 ℃作為最佳反應溫度。

2.1.4 脂肪酸與L-抗壞血酸物質(zhì)的量比對產(chǎn)率的影響

圖4 底物的物質(zhì)的量比對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of substrate molar ratio on the yield of L-ascorbic myristate

以豆蔻酸與L-抗壞血酸的物質(zhì)的量比為單因素，保持其他條件恒定：叔丁醇50 mL、4?分子篩5 g、脂肪酶0.35 g、恒溫水浴溫度55 ℃、超聲密度0.40 W/cm2、反應4 h。豆蔻酸的量由10 mmol變化至50 mmol時，產(chǎn)率的變化如圖4所示。豆蔻酸的量在30～50 mmol的范圍內(nèi)，L-AM產(chǎn)率最高，繼續(xù)增加豆蔻酸的量對產(chǎn)率提升無明顯作用，故選擇豆蔻酸的加入量為30 mmol，即豆蔻酸與L-抗壞血酸的物質(zhì)的量比為3：1，此時產(chǎn)率可以有效提高，確定3：1為豆蔻酸與L-抗壞血酸的最佳物質(zhì)的量比。

2.1.5 超聲功率密度對產(chǎn)率的影響

圖5 超聲功率密度對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power density on the yield of L-ascorbic myristate

酶底物的擴散速率對酶的催化效率有極大影響，反應過程中采用超聲波振動使底物分散均勻，超聲波的功率對底物擴散速率影響顯著。以超聲功率為變量，保持其他條件恒定：脂肪酶0.35 g、L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4 ?分子篩5 g、叔丁醇50 mL、水浴恒溫55 ℃、反應時間為4 h。分別選用超聲功率為0.00、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 W/cm2。得其產(chǎn)率變化如圖5所示，可得產(chǎn)率隨著超聲功率的增加而提高，超聲波產(chǎn)生的高頻振動不僅能促進底物L-抗壞血酸的溶解，并且可以使底物均勻分散在溶劑中，提高底物與酶的有效碰撞次數(shù)，因此L-AM產(chǎn)率顯著提高，由于超聲波最大功率為0.40 W/cm2，故選取0.40 W/cm2為最佳超聲功率。

2.1.6 固定化脂肪酶使用次數(shù)對產(chǎn)率的影響

圖6 固定化酶的使用次數(shù)對L-AM產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of number of reuse cycles of immobilized lipase on the yield of L-ascorbic myristate

本實驗結果的最終目的是投入工業(yè)化生產(chǎn)，成本的考慮尤為重要。原料中，固定化酶的價格相對較高，需要重復使用，但隨著重復使用次數(shù)的增加，酶的活性會隨之衰減，以酶的重復使用次數(shù)為變量，保持其他條件恒定：脂肪酶0.35 g、L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4 ?分子篩5 g、叔丁醇50 mL、水浴恒溫55 ℃、超聲功率密度0.40 W/cm2、反應時間為4 h。隨著重復次數(shù)變化，產(chǎn)率變化如圖6所示：酶使用的次數(shù)在1～4 次的范圍內(nèi)，產(chǎn)率基本恒定，酶活力變化程度不大，當重復使用次數(shù)超過4 次以后，產(chǎn)率有明顯下降，酶活力衰減較明顯。原因可能是固定化脂肪酶在超聲波的高頻振動作用下，結構發(fā)生變化甚至破壞，且在回收利用過程中固定化酶有損耗，故兼顧效率和成本的情況下，選取酶的重復使用次數(shù)為4 次。

2.2 產(chǎn)物的鑒定

2.2.1 產(chǎn)物的純度測定

產(chǎn)物經(jīng)過分離提純后為白色有光澤的針狀晶體，用GB 16314—1996的碘量法[8]測定產(chǎn)物的純度為98.1%，測得熔點為107.9～109.6 ℃。

2.2.2 產(chǎn)物的紅外光譜檢測

圖7 7 L-抗壞血酸豆蔻酸酯的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrum of L-ascorbic myristate

從圖7可得出：3 394、2 915、1 731 cm-1分別出現(xiàn)了—OH鍵的吸收峰、CH2的C—H鍵伸縮振動吸收峰、羧酸酯基的伸縮振動吸收峰，在1 654 cm-1出現(xiàn)了L-抗壞血酸的C=C的吸收峰和指紋區(qū)的吸收峰（1 288、1 149、725 cm-1）進一步證明了L-抗壞血酸豆蔻酸酯的結構特征。

2.2.3 產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測

圖8 8 L-抗壞血酸豆蔻酸酯的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum of L-ascorbic myristate

由圖8可知，分子離子峰m/z 385.7（M-1）和m/z 772.2（2M）證實了所得產(chǎn)物為L-AM。

2.3 產(chǎn)物的抗氧化性測定

2.3.1 L-AM對羥自由基的清除能力

如圖9所示，利用鄰二氮菲Fe2+氧化法測定L-AM對羥自由基的清除能力，以吸光度的大小來反映抗氧化劑清除羥自由基能力的高低。在產(chǎn)物質(zhì)量濃度為50～400 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，4 種氧化劑對羥自由基的清除能力均逐漸增強，其中TBHQ對羥自由基清除能力增強的速率最緩慢，依次是L-AP和L-AM，以L-抗壞血酸的羥自由基清除能力的增強速率最快、清除能力最強。

圖9 9 L-AM對羥自由基的清除能力的測定Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of L-ascorbic myristate

2.3.2 L-AM對DPPH自由基的清除能力

圖10 10L-AM對DPPH自由基清除能力的測定Fig.10 DPPH? radical scavenging capacity of L-ascorbic myristate

如圖10所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，清除率有明顯提高。在相同的質(zhì)量濃度下，TBHQ對DPPH自由基清除能力最強，然后依次是抗壞血酸、L-AM、L-AP最弱。

2.3.3 L-AM的還原性能力

由圖11可知，各試樣的還原力隨著產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而增強。據(jù)以上分析，可知還原力的由強到弱，依次是L-抗壞血酸、L-AM、L-AP、TBHQ。

2.3.4 L-AM在油脂中的抗氧化性能

如圖12所示，分別采用兩種不同的油對4 種抗氧化劑的抗氧化性能作比較，4 抗氧化劑對兩種油脂均有抗氧化作用，且在大豆油中抗氧化作用更明顯。因為葵花籽油中不飽和脂肪酸更多，因而氧化速度更快。在同一油脂的實驗結果中，可得L-抗壞血酸抗氧化性最弱，其次是TBHQ，L-AP和L-AM的抗氧化能力較強，且L-AM的抗氧化能力稍強于L-AP。分析原因：L-抗壞血酸清除羥自由基、DPPH自由基能力及其還原力在相同質(zhì)量濃度下雖均強于其他3 種抗氧化劑，但L-抗壞血酸的油溶性沒有其他三者強，抗氧化的基團無法與油脂進行良好的接觸，直接導致抗氧化能力較低。而L-AM兼具良好的油溶性及抗氧化性，其分子側(cè)鏈碳原子比L-AP分子的側(cè)鏈碳原子少了兩個碳原子，所以相同質(zhì)量濃度的L-AM的連烯二醇結構所占比重大于L-AP，導致L-AM的抗氧化能力稍大于L-AP。

圖12 12L-L-AM在油脂中的抗氧化性能Fig.12 Antioxidant activity of L-ascorbic myristate in oils

3 結 論

在合成反應過程中，超聲波可以促進L-抗壞血酸的溶解，加速固定化脂肪酶在叔丁醇中催化合成L-AM，縮短反應平衡時間，并且能夠提高產(chǎn)率。同時適當過量的豆蔻酸，合適的溶劑、反應時間、反應溫度以及超聲功率密度可以使產(chǎn)率達到最高，最佳的條件為脂肪酶0.35 g、L-抗壞血酸10 mmol、豆蔻酸30 mmol、4?分子篩5 g、叔丁醇50 mL、水浴恒溫55 ℃、超聲功率密度0.40 W/cm2、反應時間4 h，最高產(chǎn)率達到77.58%。抗氧化實驗表明，L-AM具有很強的清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力，在一定質(zhì)量濃度下優(yōu)于L-AP、TBHQ，并且克服L-抗壞血酸油溶性不良的缺點，添加入油脂后的抗氧化作用明顯，因此，L-AM是一種有潛力的抗氧化劑，有一定的應用價值。

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Synthesis and Antioxidant Activity of Lipase-Catalyzed L-Ascorbyl Myristate in Ultrasonic Field

LUO Hui-wen, LI Zhuo*
(Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The synthesis catalyzed by immobilized lipase (Novozym?435) of L-ascorbyl myristate in ultrasonic field was studied. The dissolution rate of the reactants could be accelerated greatly by using ultrasonic, and the reaction time could be reduced from 48 h to 4h. The productivity reached 77.58%, and the purity of purified products was 98.1%. The immobilized lipase could be reused 4 times in ultrasonic field. L-ascorbyl myristate showed strong antioxidant activity similar to that of L-ascorbyl palmitate and superior to that of tertiary butylhydroquinone (TBHQ) at an equal concentration as indicated by hydroxyl radical and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacities and reducing power. The antioxidant activity of L-ascorbyl myristate was still strong even when added to oils.

ultrasound; lipase-catalyzed synthesis; L-ascorbyl myristate; antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）10-0115-06

10.7506/spkx1002-6630-201410021

2013-07-03

羅慧文（1992—），女，本科，研究方向為食品科學與工程。E-mail：lhwmango@163.com

*通信作者：李卓（1988—），男，碩士，研究方向為食品添加劑的制備與應用。E-mail：totti880824@163.com