降血糖類保健食品中非法添加的8 種藥物檢測及實例分析

黃湘鷺，王靜文，曹 進，張慶生

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

降血糖類保健食品中非法添加的8 種藥物檢測及實例分析

黃湘鷺，王靜文，曹 進，張慶生

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

目的：建立檢測降血糖類保健食品中非法添加8 種藥物的方法并用于實際檢測。方法：采用高效液相色譜-串聯質譜法，以ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫。通過分子離子峰、二級碎片、色譜保留時間等信息，對宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加8種化學藥物進行鑒別和定量測定。結果：8種藥物實現了同時分離與專屬鑒定，檢出限為5.5～76 ng/g，精密度為0.22%～1.19%，回收率為74.0%～111.9%；本法適用于硬膠囊樣品；利用本法，從15 批樣品中檢測出9 批含非法添加化學藥物。結論：本方法專屬性強、靈敏度高，結果準確可靠，可作為宣稱輔助降血糖類保健食品中檢測非法添加化學藥物的方法參考。

高效液相色譜-串聯質譜法；降糖藥物；格列本脲；西地那非

隨著人們生活水平的提高和對健康品質的需求，保健食品由于可以補充人們所需營養成分、修復人體部分亞健康狀態，而越來越多的被人們使用。由于保健食品是具備一種功效或者宣稱功能的食品[1]，因此，在日常使用中，常被人們誤認為具備治療效果，而和某些病癥狀態的恢復相聯系，為了凸顯這些作用，換取更大的經濟利益，許多不法分子在保健食品中添加有關藥物以增加保健食品的功效顯示[2-4]。在一個時期的實際檢驗中發現，保健食品中非法添加化學藥物主要存在功能對應的治療藥物的添加、藥物副作用與功能對應的藥物添加等選擇方向，在添加形式上，存在一種或者多種藥物添加、藥物前體添加或者藥物衍生物添加等。由于保健食品中非法添加藥物存在劑量不明確、種類不清晰、物質相互作用不確切等風險，因此保健食品中非法添加藥物這種現象具有很強的潛在危害性，是影響食品安全的重要危害來源，需要嚴厲打擊[5]。在前期保健食品相關檢測中發現，部分降血糖類保健食品在非法添加降糖類藥物的同時，還添加了部分可用于抗疲勞的藥物，這為保健食品中非法添加藥物的危害溯源和風險鑒別提供了新的線索。因此，這里選擇常見降血糖藥物和壯陽類藥物共8種進行研究，包括磺脲類降糖藥（格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲）、非磺脲類降糖藥（瑞格列奈）和5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制劑（西地那非、他達拉非）。本實驗建立了高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MSMS）法，可快速、準確地檢測宣稱輔助降血糖類保健食品中8種藥物，為拓展降血糖類保健食品中非法添加化學藥物的篩查范圍提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格列吡嗪（純度9 9.5%）、格列齊特（純度99.9%）、瑞格列奈（純度99.7%）、格列本脲（純度100%）、格列美脲（純度99.1%）、格列喹酮（純度99.9%） 中國食品藥品檢定研究院；西地那非（純度100%） Toronto Research Chemicals；他達拉非（純度100%）振翔公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

6460 Triple Quad LC-MS配有電噴霧離子源 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Z O R B A X E c l i p s e P l u s C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：35℃；以0.1%甲酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫：0→5 min，A 90%→90%；5→5.1 min，A 90%→10%；5.1→10 min，A 10%→10%；10→10.1 min，A 10%→90%；10.1→13 min，A 90%→90%；流速0.1 mL/min；進樣量1 ?L。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源，毛細管電壓3 500 V，噴霧電壓500 V，霧化氣30 psi，氣流速度8 L/min，氣流溫度330 ℃，鞘氣流速11 L/min，掃描方式為多反應監測（multiplereactionmonitoring，MRM），正離子模式。各化學藥物監測離子對及質譜參數見表1。

表1 降糖類化學藥物監測離子對及質譜參數Table1 MRM ions pair and MS parameters of anti-diabetics

1.3.3 對照品溶液的配制

精密稱取格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達拉非適量，加甲醇溶解并制成每1 mL各含100 μg的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品混合溶液。

1.3.4 供試品溶液的配制

稱取0.5 g的硬膠囊樣品至于50 mL離心管，加甲醇25 mL超聲提取15 min，放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，混勻。離心后吸取上清液，過0.45 μm濾膜后待用。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

圖1 8種化學藥物的多反應監測離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of 8 drugs: gliquidone (a), glibenclamide (b), glimepiride (c), sildenafil (d), repaglinide (e), glipizide (f), tadalafil (g) and gliclazide (h)

本實驗分別對甲醇-水、甲醇-20 mmol/L醋酸銨、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸銨系統進行了考察，結果以甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸-20 mmol/L醋酸銨系統作為流動相時效果較好，色譜峰峰形尖銳，分離效果好，基線穩定。為減少流動相配比數量，選擇甲醇-甲酸作為流動相。圖1為8種化學藥物的多反應監測離子流圖。

2.2 特征碎片離子的選擇和質譜條件的優化

采用MRM模式對宣稱輔助降血糖類保健食品非法添加化學藥物進行分析。在電噴霧離子源正離子模式下，通過一級質譜掃描確定8 種化合物的[M+1]+準分子離子峰，通過子離子掃描對各化合物進行掃描，確定MRM模式下各特征碎片離子。8 種化合物的特征碎片離子見表1，每個化合物選擇2～4 個離子對。

采用MassHunter Optimizer軟件對8 種化合物的碎裂電壓和碰撞能量進行優化，碎裂電壓優化范圍為50～150 V，碰撞能量為5～50 eV，優化結果見表1。

2.3 方法學考察

2.3.1 檢出限及線性范圍

取硬膠囊陰性樣品0.5 g，分別加入一定量的對照品，按供試品溶液的配制方法同法配制，以3倍信噪比計算檢出限，通過添加至相應質量濃度加標樣品予以確證；精密吸取對照品混合溶液0.1、0.5、1、5、10 mL，分別置10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 ng/mL對照品工作溶液，以各組分定量離子的峰面積對其質量濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程和相關系數，結果見表2。

表2 8種化學成分的檢出限、線性范圍、回歸方程和相關系數Table2 Limit of detection (LOD), linear ranges, linear equations and correlation coefficients ( ) for 8 drugs

2.3.2 精密度實驗

取100 ng/mL對照品工作溶液，重復進樣6 次，按上述色譜質譜條件測定，格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達拉非的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.04%、1.19%、0.41%、0.62%、0.55%、0.22%、0.34%、1.03%。

2.3.3 重復性實驗

精密稱取1 號樣品6份，每份0.5 g，按供試品溶液的配制方法同法配制并測定，計算格列美脲的平均含量為1 302.64 ?g/g（RSD=3.23%），格列本脲的平均含量為46.38 ?g/g（RSD=5.59%），西地那非的平均含量為1.48 ?g/g（RSD=5.10%），他達拉非的平均含量為177.25 ?g/g（RSD=1.63%）。

2.3.4 加標回收率實驗

取硬膠囊陰性樣品0.5 g，分別加入一定量的對照品，按供試品溶液的配制方法同法配制并測定加標回收率，測定結果見表3。

表3 加標回收率Table3 Spiked recoveries

2.4 樣品測定

應用本法對市售15批宣稱輔助降血糖保健食品中格列喹酮、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、瑞格列奈、格列本脲、西地那非、他達拉非進行篩查，發現非法添加成分9批，其中單獨添加3批，復合添加6批，結果見表4。

表4 樣品含量測定Table4 Determination of 8 illegal drugs in real samples

3 討 論

根據結果對市售輔助降血糖類保健食品的非法添加化學藥品的情況進行初步分析。通過對市售15 批降糖類保健食品進行篩查，發現6 批樣品添加格列本脲，1 批添加格列美脲，5 批添加西地那非，2 批添加他達拉非。在這15 批樣品中，添加1 種降糖類化學藥品的為3 批，2 種的為1批。添加1 種壯陽類化學藥品的為3 批，2 種的為1 批。降糖類化學藥品與壯陽類化學藥品混合添加的有3 批。在定性鑒別的同時，利用MRM模式對檢出的化學藥品進行了定量。

上述檢出的化學藥品多為處方藥，必須在醫生的指導下服用。格列本脲為第二代磺酰脲類降糖藥，作用強而持久，持續時間為12～24 h，用量過大會導致持久性低血糖反應，對人體造成危害[6-9]。西地那非和他達拉非屬于PDE5的選擇性抑制劑，能抑制體內環磷酸鳥苷的降解，從而加強性興奮的陰莖勃起反應[10-13]，在宣稱抗疲勞類保健食品中有非法添加情況。但測定結果中，多種品牌的降糖類保健食品中均含有西地那非、他達拉非，且劑量范圍不等。有甚者，在降血糖保健食品中只添加壯陽藥，如樣品2、5、8號。除非藥物的原料來自同一廠家，否則意外污染的可能性不大。

另外，糖尿病慢性并發癥之一是陽痿[14-17]，PDE5抑制劑（多為西地那非）與降糖藥（多為格列本脲）的聯合使用，可以從多方面減輕糖尿病的癥狀，不法商家通過這種聯合添加的方式來增加降糖類保健食品的療效。部分陽痿患者（不管是否患有糖尿病）由于迫切想改善其癥狀，擅自服用宣稱具有壯陽效果的保健食品，而這些保健食品中可能非法添加不同程度的降糖藥，患者服用后導致了一系列降糖藥引發的嚴重副作用（比如低血糖）[18-20]，這些情況提示了保健食品非法添加藥物的一種新的篩查思路，即通過對疾病可能出現的臨床癥狀進行分析，擴展具備具體功能的保健食品的篩查范圍，這為嚴格控制保健食品的產品質量，打擊非法添加具有重要的意義。

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Determination of 8 Drugs in Antidiabetic Supplements: A Case Study

HUANG Xiang-lu, WANG Jing-wen, CAO Jin, ZHANG Qing-sheng
(National Institutes of Food and Drug Control, Beijing, 100050, China)

Objective: To develop and apply a method for the identification of 8 illegal drugs in antidiabetic supplements using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS). Methods: The chromatography was performed using a ZORBAX Eclipse Plus C18column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm), with a mobile phase consisting of 0.1% (V/V) formic acid (phase A) and methanol (phase B) by gradient elution. Eight illegal synthetic drugs (gliquidone, glibenclamide, glimepiride, sildenafil, repaglinide, glipizide, tadalafil and gliclazide) added in antidiabetic health foods were determined qualitatively and quantitatively based on the information of molecular ion mass, specific fragment ions and chromatographic retention. Results: Eight drugs could be separated and identified simultaneously. The limits of detection (LODs) of these substances were in the range of 5.5–76 ng/g, the precision expressed as relative standard deviation (RSD) for six replicate determinations was 0.22%–1.19%, and the recoveries from spiked samples were in the range of 74.0%–111.9%. The method was suitable for hard capsules. In the 15 batches of samples, the illegal synthetic drugs were found in 9 batches. Conclusion: The method has been proved to be simple, sensitive and accurate, and can be used as a reference in the detection of the illegal synthetic drugs in anti-diabetic supplements.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); antidiabetics; glibenclamide; sildenafil

R917

A

1002-6630（2014）10-0149-04

10.7506/spkx1002-6630-201410027

2013-09-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B02）

黃湘鷺（1985—），女，助理研究員，碩士，研究方向為食品、保健食品及化妝品的檢測。E-mail：xianglu_huang@126.com