二維多通道色譜法分離松多酚的條件優化

曾祥宏，王振宇,2,，李 輝，左麗麗

（1.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，極端環境研究所，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

二維多通道色譜法分離松多酚的條件優化

曾祥宏1，王振宇1,2,*，李 輝1，左麗麗1

（1.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，極端環境研究所，黑龍江 哈爾濱 150090；2.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以東北紅松松塔為原料，采用本課題組設計的二維多通道色譜分離設備，確定其分離松多酚的最佳工藝條件。首先通過靜態吸附解吸實驗，篩選二維多通道色譜分離設備的固相介質和洗脫劑；然后進行單因素動態試驗，考察影響二維多通道色譜設備分離效果的4 個因素：上樣量、上樣質量濃度、洗脫速率和色譜柱數量。結果表明：X-5大孔樹脂為二維多通道色譜設備分離松多酚的最佳固相介質，0.5%甲酸-60%乙醇溶液為其最佳洗脫劑，其對松多酚的最大吸附量為 38.74 mg/g，解吸率達72.08%；二維多通道色譜設備分離松多酚的最佳工藝條件：上樣量256 mg、上樣質量濃度2.0 mg/mL、洗脫速率（200±20）mL/min和色譜柱聯用數量4 根。在此條件下，松多酚純度由2.37%提高到了23.257%，產率達到46.81%。

二維多通道色譜；松多酚；分離純化；大孔樹脂

近些年，研究發現松科植物體內含有大量具有一系列獨特理化性質和生物活性的多酚類化合物，即松屬植物多酚，簡稱松多酚。松多酚是一種色素類天然抗氧化劑[1]，研究發現，其具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]、抗輻射[6]、降血糖血脂[7-8]等多種生理功能，因此開發松多酚具有廣闊的市場前景。但是，大批量、工業化生產高純度的松多酚成為制約其市場化的瓶頸。

大孔吸附樹脂是一種高分子聚合物，由于其特殊的空間結構和穩定的物理化學性質，使其具有很好的吸附性和選擇性，逐漸運用于活性物質的分離純化[9-10]。目前，以大孔吸附樹脂為固相介質的色譜分離純化技術在植物功能性化學成分的分離、純化以及富集中的應用日趨廣泛[11-12]，同時，對多酚類化合物的分離純化也有著大量的應用[13]；但是所采用的色譜分離技術大部分都是傳統的柱色譜分離、液相色譜分離和逆流色譜分離技術，它們具有分離效率低、洗脫劑消耗大、分離量小、分離周期長等缺點[14-19]。因此，本課題組在傳統柱色譜分離技術的基礎上設計了二維多通道色譜分離設備，本實驗將運用該設備，確定其分離純化松多酚的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松種子外殼（紅松松塔），產地黑龍江省伊春。

大孔樹脂 天津歐瑞生物科技有限公司；福林-酚天津市光復精細化工研究所；沒食子酸、無水碳酸鈉、濃硫酸、濃鹽酸、95%乙醇等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LD5-2A低速離心機 北京醫用離心機廠；RE-3000旋轉蒸發器 上海亞榮生化器廠；721型可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；DFY-500 500 g搖擺式高速中藥粉碎機 浙江溫嶺市大海藥材器械廠；JCW-1000W超聲波發生器 山東省濟寧市超聲電子儀器；101-2A型電熱鼓風干燥箱 天津市秦斯特儀器有限公司；二維多通道色譜分離設備 課題組自主設計；規格4 cm×20 cm色譜柱 定制。

1.3 方法

1.3.1 二維多通道色譜法的構建

1.3.1.1 構建原理

二維多通道色譜分離純化設備，是一種利用目標物質與介質的吸附原理進行液體分離操作的傳質系統。在傳統色譜柱的基礎上，將一根整體的傳統色譜柱，分割成若干小的色譜柱，設立吸附域和分離域，然后通過管道和閥門連接，再由中央分配系統控制，從而形成串聯模式、單通道和多通道并聯多種分離純化模式。原理如圖1所示。

圖1 二維多通道色譜分離設備設計原理圖Fig.1 Schematic representation of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.2 設備構成

根據原理圖設計，為了使設備更加簡捷化，對設備各部分進行模板集成化處理，最終由5大主要系統構成，分別為自動化控制系統、中央分配系統、檢測系統、柱吸附分離體系和料液控制體系，如圖2所示。

圖2 二維多通道色譜分離設備CAD設計圖Fig.2 CAD diagram of two-dimensional multi-channel chromatographic separator

1.3.1.3 操作流程

啟動二維色譜設備進樣，樣品在二維多通道色譜分離設備的吸附域吸附3 h，然后水洗，直至水洗液為澄清時停止水洗。然后開啟二維多通道色譜分離設備的串聯模式，由靜態試驗確定的洗脫劑進行分離洗脫；當串聯模式的出水口，出現顏色變化時立即停止分離洗脫，關閉串聯模式；然后啟動二維色譜并聯模式，洗脫樣品，收集2 個柱體積。

1.3.2 松多酚粗提物制備[20]

首先，對紅松松塔進行預處理，放入烘箱烘干，溫度50 ℃、時間12 h；烘干后粉碎并過30 目篩。然后，稱取一定質量處理后的紅松松塔原料，以1：20的料液比加入60%乙醇提取液，超聲萃取2次，超聲功率1 000 W，每次超聲1～2 h；合并初提液，離心處理，5 000 r/min離心5 min；取上清液并抽濾處理。最后，對處理好的初提液進行旋蒸濃縮，至無醇味，得松多酚粗提物以備用。

1.3.3 福林酚試劑法測定多酚[21]

1.3.3.1 標準曲線的建立

準確稱取10 mg沒食子酸，加入蒸餾水定容至100 mL，混合均勻得100 μg/mL的沒食子酸標準母液，然后由標準母液配制質量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸溶液。取0.5 mL各質量濃度沒食子酸溶液，分別置于10 mL的比色管，然后加入1.0 mL的福林試劑混合，在室溫條件下保持5 min；再加入1.0 mL 10%的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至3.0 mL。在室溫條件下反應2 h，以相應試劑為空白對照，測定溶液在760 nm波長處吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程。

1.3.3.2 松多酚含量的測定

取一定量的松多酚提取物樣品，根據情況稀釋50或100 倍；然后取0.5 mL稀釋過的松多酚粗提液樣品，置于10 mL的比色管，根據繪制標準曲線的方法做同樣的處理，同樣以相應試劑為空白對照，在760 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算得到松多酚粗提物含量。

1.3.4 大孔樹脂的篩選[11]

本研究選取的6 種大孔樹脂的型號及物理結構參數如表1所示。

表1 6 種大孔樹脂物理結構參數Table1 Physical structure parameters of 6 kinds of macroporous resins

取一定量已預處理的6 種固相介質，進行烘干處理（60 ℃、8 h），然后準確稱取0.5 g，放入錐形瓶，95%乙醇浸泡，24 h后水洗至中性，真空抽干以備用。隨后，加入40 mL 2.173 mg/mL的松多酚粗提液；置于恒溫振蕩器，溫度（30±2）℃、振速100 r/min、時間10 h，待充分吸附后過濾，測定濾液吸光度，然后計算松多酚在各樹脂中的吸附量和吸附率。

將上述以吸附的6 種固相介質進行水洗，至水洗液無色；然后加入40mL 60%乙醇，置于恒溫振蕩器（溫度（30±2） ℃、振速100 r/min、時間10 h），靜置20 min，取洗脫液，測定吸光度，計算各樹脂的解吸情況。計算公式如下：

式中：Q1為吸附量/（mg/g）；E1為吸附率/%；Q2為解吸量/g；E2為解吸率/%；m為樹脂濕質量/g；C0為起始多酚質量濃度/（mg/mL）；C1為達到吸附平衡時溶液中多酚質量濃度/（mg/mL）；C2為解吸液中多酚質量濃度/（mg/mL）；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL。

1.3.5 乙醇洗脫體積分數的篩選

選取20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 7 個乙醇梯度，按上步的解吸實驗操作，確定洗脫液的最佳體積分數。

1.3.6 甲酸體積分數對解吸的影響

為了進一步增強洗脫劑對固相介質的解吸效果，故探究不同體積分數甲酸對洗脫效果的影響。在已選定洗脫劑的條件下，分別選取含有0.5%、1.0%、1.5%、 2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%甲酸的洗脫劑，進行靜態解吸實驗，然后測定吸光度，計算各樹脂的解吸情況。

1.3.7 單因素試驗

二維多通道色譜分離松多酚的條件由上述單因素試驗直接確定，實驗順序為上樣量、上樣質量濃度、洗脫速率和色譜柱數量，并且按照實驗順序確定的單因素條件作為下個因素的固定條件。

上樣量：選取6 個水平，分別為80 mL×1.6 mg/mL、120 mL×1.6 mg/mL、160 mL×1.6 mg/mL、200 mL×1.6 mg/mL、240 mL×1.6 mg/mL、280 mL×1.6 mg/mL。

上樣質量濃度：在上樣量確定的情況下，選取的上樣質量濃度分別為1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL。

洗脫速率：在上兩個因素確定的條件下，選取（100±20）、（200±20）、（300±20）、（400±200、（500±20）、（600±20）mL/min 6 個不同洗脫流速。

色譜柱數量：在上述條件確定的條件下，選取1 根柱聯用、2 根柱聯用、3 根柱聯用、4 根柱聯用、5 根柱聯用5種不同柱數量的聯用洗脫情況。

1.3.8 純度計算

根據福林-酚試劑法測定所收集樣品的多酚含量，并取一定體積的樣品，置于平皿，放入烘箱烘干至質量恒定，稱量干質量。公式如下：

2 結果與分析

2.1 總多酚標準曲線的建立

以溶液在760 nm波長處的吸光度為縱坐標、沒食子酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標，建立總多酚標準曲線方程：y=0.019 9x-0.007 5，R2=0.999 7。根據回歸方程，得松多酚提取物中多酚含量為8.259 8 mg/g。

2.2 大孔樹脂的篩選

由于大孔樹脂的極性、孔徑、比表面積、平均孔徑等理化性質的不同，其分離目標物質的效果也不同[9]。大孔樹脂分離天然活性成分利用的是其吸附的可逆性，在生產制備上，大孔樹脂的選取不僅要求吸附量大，而且解吸效果也要較好[22]。因此，吸附性能和解吸性能是大孔樹脂作為固相介質篩選的重要依據。表2顯示，從吸附性看，不同型號的樹脂對松多酚的吸附程度不同，與樹脂的極性呈正相關，其中吸附量和吸附率較高的是極性樹脂S-8、NAK-2、NAK-9和中等極性的ADS-17，而弱極性和非極性的較低；S-8的吸附性最好，吸附量和吸附率分別達到了75.19 mg/g和86.43%。產生這種情況的原因可能和多酚類物質屬于中等極性化合物有一定的關系，同時又有一定的疏水性，因此根據相似相容原理，極性和中等極性的大孔樹脂更易與多酚類物質吸附。從解吸性看，解吸效果較好的是X-5和D101，均達到了50%以上。綜合吸附和解吸兩個參數，S-8的吸附性能最佳，吸附量達到75.19 mg/g，而解吸量僅僅只有17.05 mg/g；而X-5吸附性能不佳，吸附率僅僅達到44.53%，但解吸較好，解吸率達到63.73%，解吸量為24.69 mg/g。因此，確定X-5大孔樹脂作為二維多通道色譜法分離松多酚的固相介質。這一結果，與其他學者分離純化多酚類活性成分所篩選樹脂的極性基本一致，都為弱極性吸附樹脂[22-24]。

表2 6 種大孔樹脂對松多酚的吸附與解吸Fig.2 Adsorption and desorption capacities of 6 kinds of macroporous resins

2.3 X-5大孔樹脂吸附性的考察

2.3.1 X-5大孔樹脂對松多酚的動力吸附

圖3 X-5樹脂對松多酚的動力吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curves of pine polyphenols on X-5 resin

大孔樹脂吸附目標物質是一個由快速吸附到最終吸附飽和的動態過程，由于每種樹脂的理化性質的不同和吸附物性質的差異，故大孔樹脂吸附的動態過程差異較大，有的幾十分鐘即可達到平衡，但有些需要幾個小時。由圖3可以看出：在開始的一段時間內，X-5大孔樹脂對松多酚吸附量在逐漸增大。隨著時間的延長，吸附逐漸達到飽和。當吸附2 h左右時，X-5樹脂對松多酚的吸附達到平衡，吸附量不再增加，趨于穩定，其吸附量為39 mg左右。因此該吸附平衡時間作為了二維多通道色譜分離設備分離松多酚吸附域的吸附時間的參考標準，為了保證吸附完全，選取3 h作為吸附域最終的吸附時間。

2.3.2 X-5樹脂對松多酚的等溫吸附

在等溫吸附實驗中，通常采用朗繆爾和費倫德利希吸附模型 描述大孔樹脂與吸附物之間的相互作用，揭示其吸附過程[12-13,25]。朗繆爾吸附模型公式[25]如式（7）所示：

式中：Qe為樹脂吸附能力；Ce為松多酚平衡濃度；Qm為經驗常數；K為朗繆爾常數。

費倫德利希吸附模型[25]公式如式（8）所示：

式中：Qe為樹脂吸附能力；Ce為松多酚平衡濃度；k為費倫德利希常數；1/n為經驗常數。

X-5吸附松多酚的等溫吸附曲線如圖4所示，同時根據上述公式得兩吸附模型參數如表3、4所示，綜合比較兩吸附模型的相關系數，X-5大孔樹脂對松多酚的吸附過程更趨于朗繆爾單分子吸附模型，在不同溫度下其吸附模型的線性擬合R2＞0.99。在費倫德利希模型，1/n的值是判斷其吸附模型是否易于發生的依據[25]；在0～0.5之間說明費倫德利希模型易于發生，反之大于0.5，則不易發生。在表4中1/n的值均大于0.5，故X-5大孔樹脂對松多酚的吸附過程不符合費倫德利希模型。

圖4 X-5樹脂對松多酚的等溫吸附曲線Fig.4 Absorption isotherms of pine polyphenol on X-5 resin

同時如圖4可知，在25、35 ℃和45 ℃三個梯度溫度，X-5大孔樹脂對松多酚的吸附能力隨著溫度的升高而降低，25 ℃時X-5樹脂對松多酚的吸附最佳。同時，在這3 個溫度梯度下，X-5大孔樹脂對松多酚的吸附，隨著松多酚質量濃度的增加而不斷的增強，當松多酚質量濃度達到2.0 mg/mL左右時，其吸附達到飽和。隨后繼續增加質量濃度，X-5大孔樹脂對松多酚的吸附量不再增加，甚至略有下降。這可能是因為剛開始松多酚濃度的提高，使目標吸附物質的量也隨之提高，增加了松多酚與大孔樹脂的相互作用；當達到吸附平衡時，繼續增加松多酚的質量濃度，樹脂表面接觸的松多酚分子過多，延緩了多酚分子進入大孔樹脂的內部空間結構，同時質量濃度的增加也增大了競爭多酚吸附雜質的量，從而松多酚的吸附量略有下降。這與其他學者研究多酚質量濃度對吸附影響的結果是一致的[24,26-27]。X-5大孔樹脂對松多酚的吸附過程符合朗繆爾單分子層吸附模型，在25 ℃條件下（即室溫）對松多酚的吸附較佳，松多酚質量濃度在2.0 mg/mL左右較佳。

表3 不同溫度條件下X-5大孔樹脂對松多酚的朗繆爾吸附模型參數Table3 Langmuir parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

表4 不同溫度條件下X-5大孔樹脂對松多酚的費倫德利希吸附模型參數Table4 Freundlich parameters of pine polyphenol on X-5 resin at different temperatures

2.4 X-5大孔樹脂解吸性的考察

2.4.1 乙醇體積分數對解吸的影響

通常洗脫劑的極性決定著大孔樹脂的解吸效果[9,28]，將吸附松多酚飽和的X-5大孔樹脂等分成份，分別用不同體積分數的乙醇溶液作為解吸劑，測定解吸液中松多酚含量，計算解吸率，結果如圖5所示。60%乙醇的解吸最高，達到63.73%，且較快達到解吸平衡。因此，選擇60%的乙醇作為進一步研究的洗脫劑。

圖5 乙醇體積分數對解吸的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption capacity

2.4.2 不同甲酸體積分數洗脫液對解吸的影響

從一些研究中發現，大孔樹脂在弱酸性的條件下有利于多酚類活性成分的洗脫[29-30]。因此，利用不同體積分數的甲酸對洗脫液進行酸化，從而洗脫液酸化程度對X-5大孔樹脂的解吸影響，結果如圖6所示。不同酸化程度的洗脫液對X-5大孔樹脂的解吸有一定的作用；適當的加入少許的甲酸能夠提高洗脫劑的解吸能力，在甲酸的體積分數達到0.5%時，洗脫劑的解吸能力最強，解吸率達到72.08%；隨后隨著甲酸濃度的增加，洗脫劑的解吸能力逐漸減弱。這可能是因為多酚在中性條件下易離解，離解物與樹脂的結合力可能比非離解物大，經弱酸化的洗脫液可以抑制多酚的離解，可能會改善洗脫效果；隨后酸化的程度不斷增加，有可能導致松多酚結構的改變，與樹脂的結合力增加，從而降低了洗脫劑的解吸能力。

圖6 不同甲酸體積分數洗脫液對解吸的影響Fig.6 Effect of formic acid concentration of the eluent on desorption capacity

2.5 二維多通道色譜分離設備線上條件優化

2.5.1 上樣量對分離松多酚的影響

圖7 上樣量對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響Fig.7 Effect of sample loading amount for pine polyphenol purity

從圖7可以看出，上樣量對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響較大。從二維多通道色譜分離設備的單一域來看，在不同上樣量的條件下，吸附域分離純化松多酚較為穩定，分離獲得的松多酚純度基本在4%～6%之間，沒有太大波動，說明上樣量對二維多通道色譜分離設備吸附域的分離影響較小；但對二維多通道色譜分離設備的分離域影響較大，各分離域分離獲得的松多酚純度高低不一，波動較大。從分離效果的整體來看，二維多通道色譜分離設備分離效果明顯，在上樣量為160 mL×1.6 mg/mL時，分離域-1分離的松多酚效果最好，純度達19.907%。故選取160 mL×1.6 mg/mL的上樣量作為上樣條件。

2.5.2 上樣質量濃度對分離松多酚的影響

從圖8可以看出，松多酚的上樣質量濃度對二維多通道色譜分離設備分離松多酚產生了顯著的影響。同樣的，從單一域可以看出，吸附域的分離效果波動較小，但分離純化的效果不佳；分離域的分離效果顯著，波動大。隨著上樣濃度的改變，二維多通道色譜分離設備分離松多酚的效果峰值也發生了改變，由1.6 mg/mL的分離域-1轉變為了2.0 mg/mL的分離域-2，其分離獲得的松多酚純度達到了23.257%。因此，二維多通道色譜分離設備分離松多酚的上樣質量濃度選取2.0 mg/mL。

圖8 上樣質量濃度對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響Fig.8 Effect of sample concentration on pine polyphenol purity

2.5.3 洗脫速率對分離松多酚的影響

洗脫速率對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響如圖9所示。可知，洗脫速率對分離松多酚的影響顯著。從整體分離效果看，在較低的洗脫速率的條件下，二維多通道色譜分離設備分離松多酚的效果比在較高洗脫速率條件下，分離效果好。二維多通道色譜分離設備的各個色譜域，在流速為（200±20）mL/min時，分離效果都達到峰值；其中分離效果最好的是分離域-2，分離獲得的松多酚純度達到23.257%。

圖9 洗脫流速對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響Fig.9 Effect of eluent flow rate on pine polyphenol purity

2.5.4 色譜柱數量對分離松多酚的影響

圖10 色譜柱數量對二維多通道色譜分離設備分離松多酚的影響Fig.10 Effect of number of chromatographic columns used on pine polyphenol purity

從圖10可以看出，不同數量的色譜柱聯 用對二維多通道色譜分離設備分離松多酚有著顯著的作用。整體看，多柱聯用的二維多通道色譜分離設備的分離效果要優于單柱聯用。二維多通道色譜分離設備分離松多酚并不是色譜柱聯用的數量越多越好，在4 根色譜柱聯用時，二維多通道色譜分離設備分離松多酚的效果即達峰值。與其他數量色譜柱聯用相比，4 柱聯用的效果，無論是整體分離效果還是單柱分離都優于其他數量色譜柱聯用的效果。從而，確定二維多通道色譜分離設備分離松多酚的色譜柱聯用數量為4 根柱聯用。

按上述優化的分離純化條件，使松多酚的純度由2.37%提高到了23.257%，純化倍數高達9.8。說明分離條件優化后的二維多通道色譜分離設備對松多酚有著很好的分離純化作用。

3 結 論

本研究通過靜態吸附解吸和單因素動態試驗，確定了二維多通道色譜法分離松多酚的最佳工藝，條件：X-5樹脂為固相介質、0.5%甲酸-60%乙醇溶液為洗脫劑、上樣量256 mg、上樣質量濃度2.0 mg/mL、洗脫速率（200±20）mL/min和色譜柱4柱聯用。在此條件下，松多酚純度高達23.257%，較原松多酚提取液（2.37%）提高了9.8 倍，同時產率達到46.81%。因此，二維多通道色譜分離設備對松多酚的分離純化具有較好的效果；同時，較其他松多酚分離純化技術，二維多通道色譜分離設備具有操作自動化、洗脫液消耗少、生產周期短、處理量大等優勢，對于松多酚工業化、大批量生產具有一定的參考價值和意義。

[1] 趙海田, 王振宇, 程翠林, 等. 松多酚類活性物質抗氧化構效關系與作用機制研究進展[J]. 食品工業科技, 2012, 33(2): 458-461.

[2] SATOH K, KIHARA T, IDA Y, et al. Radical modulation activity of pine cone extracts of Pinus elliottii var. elliottii[J]. Anticancer Research, 1999, 19(1A): 357-364.

[3] ZULAICA-VILLAGOMEZ H, PETERSON D M, HERRIN L, et al. Antioxidant activity of different components of pine species[J]. Holzforschung, 2005, 59(2): 156-162.

[4] HSU T Y, SHEU S C, LIAW E T, et al. Anti-oxidant activity and effect of Pinus morrisonicola Hay. on the survival of leukemia cell line U937[J]. Phytomedicine, 2005, 12(9): 663-669.

[5] 李寅珊, 劉光明, 李冬梅. 松屬植物化學成分及抗腫瘤活性研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2012(3): 726-727.

[6] TURTOLA S, SALLAS L, HOLOPAINEN J K, et al. Long-term exposure to enhanced UV-B radiation has no significant effects on growth or secondary compounds of outdoor-grown Scots pine and Norway spruce seedlings[J]. Environmental Pollution, 2006, 144(1): 166-171.

[7] LIAZID A, SCHWARZ M, VARE LA R M, et al. Evaluation of various extraction techniques for obtaining bioactive extracts from pine seeds[J]. Food and Bioproducts Processing, 2010, 88(2/3): 247-252.

[8] PINELO M, RUBILAR M, SINEIRO J, et al. Extraction of antioxidant phenolics from almond hulls (Prunes amygdalus) and pine sawdust (Pines pinaster)[J]. Food Chemistry, 2004, 85(2): 267-273.

[9] 白奪龍, 楊開華. 大孔吸附樹脂分離純化技術及應用[J]. 海峽藥學, 2007, 19(9): 96-99.

[10] 王躍生, 王洋. 大孔吸附樹脂研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2006(12): 961-965.

[11] LI H, LIU J, LI D, et al. Study on separation and purification of genistein in the soybean residue using macroporous resin adsorption[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2012, 51(1): 44-49.

[12] CHANG X L, WANG D, CHEN B Y, et al. Adsorption and desorption properties of macroporous resins for anthocyanins from the calyx extract of roselle (Hibiscus sabdariffa L.)[J]. Journal of Agricultural a nd Food Chemistry, 2012, 60(9): 2368-2376.

[13] LIN L Z, ZHAO H F, DONG Y, et al. Macroporous resin purification behavi or of phenolics and rosmarinic acid from Rabdosia serra (MAXIM.) HARA leaf[J]. Food Chemistry, 2012, 130(2): 417-424.

[14] 劉志祥, 曾超珍, 張玥. AB-8大孔樹脂分離純化枸骨葉總黃酮的工藝研究[J]. 食品科學, 2010, 31(12): 76-79.

[15] 孫印石, 劉政波, 王建華, 等. 高速逆流色譜分離制備陳皮中的黃酮類化合物[J]. 色譜, 2009(2): 244-247.

[16] 章能勝, 王金彬, 汪小艷, 等. 高速逆流色譜法從蝙蝠蛾擬青霉中快速分離制備麥角甾醇純品[J]. 色譜, 2010(1): 68-72.

[17] 余霞, 張衛明, 石雪萍, 等. 高速逆流色譜法分離純化續隨子種子中的七葉內酯[J]. 色譜, 2010(8): 809-812.

[18] 雷宇佳, 高明哲, 王莉, 等. 制備型高效液相色譜法分離純化川西獐牙菜提取物中的龍膽苦苷[J]. 色譜, 2010(9): 902-904.

[19] 田娜, 劉仲華, 黃建安, 等. 高 效制備液相色譜法從荷葉中分離制備黃酮類化合物[J]. 色譜, 2007(1): 88-92.

[20] 蘇曉雨, 王振宇. 紅松種子殼多酚物質的提取及抗氧化特性[J]. 農業工程學報, 2009(增刊1):198-203.

[21] KONG K W, MAT-JUNIT S, AMINUDIN N, et al. Antioxidant activities and polyphenolics from the shoots of Barringtonia racemosa (L.) Spreng in a polar to apolar medium system[J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 324-332.

[22] 李均, 陳炳華, 王晶晶, 等. AB-8大孔樹脂對中 華補血草根多酚的吸附洗脫特性[J]. 食品與發酵工業, 2009, 35(4): 65-69.

[23] 徐青, 盧瑩瑩, 辛建美, 等. 大孔樹脂吸附分離海蘆筍中黃酮類化合物工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(2): 115-119.

[24] 吳道宏, 歐陽玉祝. 大孔樹脂對盤龍參多酚的吸附工藝優化[J]. 應用化工, 2011, 40(12): 2080-2083.

[25] DU H B, WANG H, YU J, et al. Enrichment and purification of total flavonoid C-glycosides from abrus mollis extracts with macroporous resins[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 201 2, 51(21): 7349-7354.

[26] 金瑩, 孫愛東. 大孔樹脂純化蘋果多酚的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(4): 160-163.

[27] 熊建華, 湯凱潔, 羅秋水, 等. 大孔吸附樹脂純化金銀花葉總多酚的工藝優化[J]. 食品與機械, 2011, 27(3): 52-55.

[28] 李臻, 吳暉, 賴富饒. 大孔樹脂對溪黃草多酚吸附分離的工藝優化[J]. 食品科技, 2012, 37(9): 192-196.

[29] 查培, 廉宜君, 楊金鳳, 等. XDA-1型大孔樹脂對沙棗多酚分離純化工藝研究[J]. 食品工業, 2012, 33(12): 89-91.

[30] 胡明明, 張國文, 何力. 大孔吸附樹脂分離純化花生殼多酚的研究[J].食品科技, 2011, 36(11): 197- 200.

Optimization of Two-Dimensional Multi-Channel Chromatographic Separation of Pine Polyphenols

ZENG Xiang-hong1, WANG Zhen-yu1,2,*, LI Hui1, ZUO Li-li1
(1. School of Food Science and Engineering, Institute of Extreme Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

A two-dimensional multi-channel chromatographic separator designed by our research group was us ed to purify polyphenols extracted from the pinecones of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. from north-eastern China. The chromatographic conditions were optimized. The stationary and eluent were selected by static adsorption and desorption experiments. Onefactor-at-a-time design was used to investigate four factors influencing the separation efficiency of polyphenols by dynamic adsorption, sample loading amount, sample concentration, eluent flow rate, and number of chromatographic columns used. Results indicated that X-5 macroporous resin was the best stationary phase for polyphenol separation and the best elutent comprised a mixture of 0.5% formic acid and 60% ethanol in water, providing maximum adsorption quantity of 38.74 mg/g and maximum desorption rate of 72.08%. The optimal experimental conditions for chromatographic separation of polyphenols were 256 mg of sample at a concentratio n of 2.0 mg/mL, eluent flowing at a rate of (200±20) mL/min and using 4 chromatographic columns. Under these conditions, the purity of polyphenols was increased from 2.37% to 23.257%, and the recovery was 46.81%.

two-dimensional multi-channel chromatographic separator; pine polyphenols; separation and purification; macroporous resin

TS201.2

A

1002-6630（2014）10-0185-07

10.7506/spkx1002-6630-201410035

2013-03-11

曾祥宏（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物分離工程及植物功能活性成分。E-mail：437027356@qq.com

*通信作者：王振宇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食用植極端環境營養學、生物分離工程及功能性食品。

E-mail：wzy219001@hit.edu.cn