固相萃取-超高效液相色譜法快速檢測辣椒面中剛果紅

鐘慈平，魏 煒，王正虹，邱 宏，胡黎黎，顧萬江，甘 源，唐小琴，李 林*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市疾病預防控制中心，重慶 400042；3.西南大學校醫院，重慶 400716）

固相萃取-超高效液相色譜法快速檢測辣椒面中剛果紅

鐘慈平1，魏 煒1，王正虹2，邱 宏2，胡黎黎2，顧萬江2，甘 源2，唐小琴2，李 林3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市疾病預防控制中心，重慶 400042；3.西南大學校醫院，重慶 400716）

目的：建立測定辣椒面中剛果紅染料含量的超高效液相色譜方法。方法：采用氨水-乙醇（30：70，V/V）提取劑，超聲加熱輔助提取3 次，合并提取液、濃縮后過HLB固相萃取小柱，以5 mL 1%甲酸-甲醇溶液淋洗、5 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液、氮吹濃縮后定容測定。使用BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速0.4 mL/min；檢測波長498 nm；柱溫40 ℃。結果：回收率為72%～96%，方法檢出限為0.029 0 mg/kg，相對標準偏差為2.16%～5.97%（n=6），線性方程相關系數達到0.999 9。結論：本方法簡便、快速、準確、靈敏，適用辣椒面中剛果紅染料含量的測定。

超高壓液相色譜；辣椒面；剛果紅；含量測定

剛果紅又名直接大紅4B，由聯苯胺雙重氮化、與1-氨基萘-4-磺酸偶合而成，屬于典型的直接偶氮染料。分子式為C32H22N6Na2O6S2，相對分子質量為696.67。棕紅色粉末，溶于水呈黃紅色，溶于乙醇呈橙色，幾乎不溶于乙醚[1-2]。剛果紅一般用作醫學臨床診斷、生物染色劑及化學指示劑等[3-4]。研究發現其具有一定致癌性，歐盟等國家嚴格禁止其在食品中使用[5-8]。近年來食品安全事件頻發，尤其是非法添加物甚至是有毒物質不斷被檢出。染料由于著色力強、堅牢度大且價格低廉而被一些不法商家大量使用，“蘇丹紅事件”以及國內的“火鍋羅丹明事件”等層出不窮。GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》中明確規定食品中禁止添加工業染料[9]，由于蘇丹紅、羅丹明B、堿性橙這幾類染料的檢測方法已比較成熟，商販可能開始轉移使用其他紅色類染料，其中，剛果紅價格便宜、著色效果優秀、使用比較廣泛，因此有必要建立一種靈敏、準確、快速的檢測食品中非法添加剛果紅染料的方法。

關于紡織物和印染廢水中剛果紅的檢測已有研究[10-13]，但基于食品基質的研究鮮有報道。目前，食品中工業染料的檢測方法主要是液相色譜法[14-16]和液相色譜-質譜聯用法[17-19]，其中普通高效液相色譜法研究較多，但耗時較長、精確度不高；而超高效液相色譜具有快速高效、高分離度等特點，目前逐漸用于食品藥品等分析檢測中[20]。由于食品基質復雜，樣品的凈化富集必不可少，一般采用固相萃取、液-液萃取、凝膠凈化等方法[21-22]。本研究采用氨化乙醇作為提取劑，超聲加熱輔助提取，以HLB固相萃取小柱對樣品進行凈化，建立了對染料具有較大吸附的辣椒面中剛果紅超高效液相色譜檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒面購自某市大型超市、批發市場、農貿市場等；剛果紅（純度95%） 中國上海試劑三廠；甲醇、乙腈（色譜純） 德國Merck公司；氨水、無水乙醇、乙酸銨、甲酸（均為分析純） 重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設備

AcquityTMUPLC液相色譜儀（配有AcquityTM型TUV檢測器）、Acquity UPLC BEH C18柱、Oasis HLB萃取柱（6 mL/2 00 mg）、Sep-pak NH2氨基柱（3 mL/500 mg）、MCX萃取柱（6 mL/200 mg）、WAX萃取柱（6 mL/200 mg） 美國Waters公司；AR1140電子天平 北京賽多利斯儀器公司；KQ-500E超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器公司；Milli-Q超純水設備 美國Millipore公司；Multifugc X1R高速離心機 安徽科大創新股份公司；TU-1950紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；N-EVAP-45氮吹儀 美國Organomation Associates公司；HWS28型恒溫水浴鍋 上海一恒科技公司；Cleanert PA聚酰胺萃取柱（100～200目，1 g/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司；PSA萃取柱（1 000 mg/6 mL） 杭州富裕科技服務公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPL CBEHC18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長498 nm；進樣量5.0 μL。以保留時間結合光譜掃描圖定性，采用外標法定量。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取剛果紅標準品0.100 0 g，用50%乙腈溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL的標準品儲備液備用。采用逐級稀釋方法，用空白基質提取液和體積分數10%的乙腈溶液將標準品儲備液配制成質量濃度為0.2、0.5、1、2、4 μg/mL的標準品系列。

1.3.3 超聲提取

稱取2.000 0 g左右辣椒面于50 mL離心管中，加入20 mL石油醚除脂2 次，揮干石油醚后加入氨化乙醇提取液25 mL，振蕩提取15 min，65 ℃條件下超聲處理20～30 min，以4 000 r/min離心8 min，收集上清液于100 mL燒杯中，殘渣繼續以15 mL提取液重復提取2 次，合并上清液。80 ℃水浴蒸發至10 mL以下（不得揮干），用50%乙腈溶液（含1%甲酸）溶解并轉移至比色管中定容。

1.3.4 樣品凈化

取1.0 mL樣品提取液，過HLB固相萃取柱（事先以6 mL甲醇、6 mL純水活化，6 mL pH 4的檸檬酸平衡），以5 mL pH 4的檸檬酸淋洗1 次、5 mL 1%甲酸-甲醇溶液淋洗、水洗至中性，以5 mL 10%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，45 ℃條件下氮氣吹至近干，用50%乙腈溶液稀釋定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后采用超高效液相色譜測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

對剛果紅標準物質（10 μg/mL）進行紫外-可見掃描（圖1），發現剛果紅在236 nm和498 nm波長附近具有較大吸收峰，由于在236 nm附近有較強的雜質干擾，故可選擇498 nm作為定量檢測波長。

圖1 剛果紅的光譜掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of Congo red

2.1.2 柱溫和流動相的選擇

表1 流動相洗脫程序Table1 Gradient elution program

比較了不同流動相的分離效果，當甲醇-乙酸銨作為流動相時，分離度沒有乙腈-乙酸銨好，且存在基線干擾，因此選擇乙腈-乙酸銨作為流動相。由于超高壓液相色譜儀出峰比較快且干擾物出峰時間比較接近，需采用梯度洗脫的方式進行分離，經優化的梯度洗脫條件如表1所示。將混標溶液（剛果紅與赤蘚紅、誘惑紅、胭脂紅、紅2G、日落黃、檸檬黃、直接紅Ⅱ）按照表1的梯度條件在40 ℃柱溫條件下進樣分析，發現目標物與干擾物質全部在4 min內出峰，各峰之間分離度高且峰形良好（圖2），在目標物出峰位置沒有干擾峰，表明色譜條件能滿足分析要求。

圖2 8種合成色素和直接紅染料超高效液相色譜圖（4 μg/mL）Fig.2 UPLC chromatogram of mixed standard solution of eight synthetic colorants and Direct Red dye (4 μg/mL)

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 提取劑的選擇

圖3 氨水體積分數對辣椒面中剛果紅提取回收率的影響Fig.3 Effect of ammonia concentration (by volume) on the recovery of Congo red from chili powder

以不含剛果紅染料辣椒面作為基質，加入標準物質，比較甲醇、無水乙醇、乙腈、丙酮、50%甲醇溶液、50%乙腈溶液、正己烷-乙腈（1：1）等提取劑的超聲提取效果，提取濃縮液于15 000 r/min高速離心后過濾膜，進行檢測。結果表明，提取回收率都很低，不能滿足實驗要求。參考 文獻[23-25]，選擇氨化甲醇、氨化乙醇和氨化乙腈（氨水體積分數均為20%）作為提取劑，發現回收率均有所提高，其中氨化乙醇的回收率最高。因此考察了不同體積分數的乙醇氨水提取2次的回收率（圖3）。

由圖3可知，隨著氨化乙醇中氨水體積分數的增加，回收率呈上升趨勢。當氨水體積分數達到30%～40%時，回收率達到最大且趨于穩定。但進一步提高氨水體積分數，剛果紅回收率有所下降。考慮提取試劑成本和對環境的污染等因素，最終采用30%氨水的乙醇作為提取劑。

2.2.2 超聲溫度的選擇

采用氨水體積分數為30%的氨化乙醇對加標辣椒面超聲提取2次，比較了常溫（25～30℃）和65℃條件下的回收率。結果發現超聲溫度提高至65℃時，回收率達到90.62%，明顯高于同條件下常溫超聲提取的效果（圖4）。

圖4 超聲溫度對辣椒面中剛果紅回收率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the recovery of Congo red from chili powder

2.2.3 超聲提取次數的選擇

在65℃條件下，氨水體積分數為30%的氨化乙醇作為提取劑，考察不同超聲次數對辣椒面中剛果紅染料的提取效果。

圖5 超聲提取次數對辣椒面中提取剛果紅回收率的影響Fig.5 Effect of number of extraction cycles on the recovery of Congo red from chili powder

由圖5可知，隨著提取次數的增加，剛果紅回收率呈上升趨勢，提取3～5次時，回收率達到90%以上且提高幅度較小，趨于穩定。因此，可選擇3次超聲提取辣椒面中的剛果紅。

2.3 凈化條件的選擇

由于食品樣品基質比較復雜，提取液高速離心后直接進樣分析，雜峰較多，基質成分干擾很大且很容易堵塞液相分離柱。因此參考文獻[26-28]并結合實驗室條件分別選取了Agela聚酰胺柱、HLB柱、WAX柱、MCX柱、Sep-pak NH2氨基柱、PSA柱作為萃取柱，考察凈化效果。實驗發現，酸性條件下剛果紅在HLB柱、Sep-pak NH2氨基柱和PSA柱上吸附很好，堿性條件下可順利洗脫，回收率都達到96%以上。但HLB柱對雜質的洗脫能力最強，因此可選擇HLB小柱對樣品進行萃取。

圖6 不同萃取柱對辣椒面中提取剛果紅回收率的影響Fig.6 Effect of different extraction columns on the recovery of Congo red from chili powder

2.4 標準曲線方程和檢出限

按照2.1.2節的色譜條件進樣分析，以標準品質量濃度為橫坐標（X）、其相應的峰面積作為縱坐標（Y）進行線性回歸得到回歸方程：Y=34 213.07X＋46.31，相關系數為0.999 9，剛果紅在0.2～4 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。儀器檢出限為0.006 μg/mL，該方法的檢出限為0.029 0 mg/kg。

2.5 方法的回收率、精密度和重復性

表2 剛果紅在辣椒面中的回收率和相對標準偏差（n=6）Table2 Average recoveries and RSD of Congo red from spiked chili samples (n=6)

選取不含剛果紅的辣椒粉作為基質，對剛果紅染料進行加標回收率實驗，結果見表2。每一添加水平平行測定6次，取平均值，考察方法的回收率和精密度，同時做樣品空白實驗。結果表明，在10 mg/kg和20 mg/kg添加水平條件下剛果紅的回收率較高，相對標準偏差滿足實驗求。而加標質量濃度為2 g/kg時，回收率只有72%，相對較低，主要原因可能是由于辣椒基質對樣品的吸附造成的。

2.6 實際樣品測定

對采自某市大型超市、批發市場、農貿市場等的20份辣椒面樣品進行檢測，結果均未檢測出剛果紅染料。

3 結 論

本研究以對染料具有較強吸附作用的辣椒面作為基質，采用氨水體積分數為30%的氨化乙醇提取劑，65℃超聲提取3次，HLB萃取小柱凈化樣品。采用超高效液相色譜測定，選擇498 nm作為檢測波長，乙腈-乙酸銨溶液作為流動相，柱溫40℃，方法的回收率達到72%～96%，相對標準偏差為2.16%～5.97%（n=6），檢出限為0.029 0 mg/kg，線性方程相關系數達到0.999 9。剛果紅在4 min內出峰并與雜質峰分離度良好。該法具有較高精確度和準確度，檢出限低，能滿足實驗檢測要求，可快速、準確地檢測出辣椒面中的剛果紅染料。同時也可用于食品安全風險評估，為國家制定相關標準提供了一定的理論依據和實驗數據。

[1] 楊新瑋, 羅鈺言, 肖剛, 等. 染料[M]. 4版. 北京: 化學工業出版社, 2005: 294.

[2] 賀鋒萍, 侍芳, 潘碌亭. 液相色譜/質譜聯用檢測剛果紅及其微電解降解的研究[J]. 環境污染與防治, 2011, 33(4): 71-73.

[3] LORENZO A, YANKNER B A. β-amyloid neurotoxicity requires fi bril formation and is inhibited by congo red[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(25): 12243-12247.

[4] JALANDONI-BUAN A C, DECENA-SOLIVEN A A, CAO E P, et al. Characterization and identifi cation of Congo red decolorizing bacteria from mo nocultures and consortia[J]. Philippine Journal of Science, 2010, 139(1): 71-78.

[5] RAMSAY J A, NGUYEN T. Decoloration of textile dyes by Trametes versicolor and its effect on dye toxicity[J]. Biotechnology Letters, 2002, 24(21): 1757-1761.

[6] GRAY L E, Jr, OSTBY J S, KAVLOCK R J, et al. Gonadal effects of fetal exposure to the azo dye congo red in mice: infertility in female but not male offspring[J]. Fundamental and Applied Toxicology, 1992, 19(3): 411-422.

[7] BAFANA A, JAIN M, AGRAWAL G, et al. Bacterial reduction in genotoxicity of Direct Red 28 dye[J]. Chemosphere, 2009, 74(10): 1404-1406.

[8] European Commission. Review the toxicology of a number of dyes illegally present in food in the EU[J]. The EFSA Journal, 2005, 263: 1-71.

[9] 衛生部. GB 2760—2011 食品添加劑使用標準[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011.

[10] DIN M I, HUSSAIN Z, MIRZA M L, et al. Biosorption of toxic congo red dye from aqueous solution by eco-friendly biosorbent Saccharum bengalense: kinetics and thermodynamics[J]. Desalination and Water Treatment, 2013, 51(28): 1-11.

[11] GOPINATH K P, MUTHUKUMAR K, VELAN M. Sonochemicaldegradation of Congo red: optimization through response surface methodology[J]. Chemical Engineering Journal, 2010, 157(2): 427-433.

[12] KHADHRAOUI M, TRABELSI H, KSIBI M, et al. Discoloration and detoxicifi cation of a Congo red dye solution by means of ozone treatment for a possible water reuse[J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 161(2): 974-981.

[13] MITTAL A, THAKUR V, MITTAL J, et al. Process development for the removal of hazardous anionic azo dye Congo red from wastewater by using hen feather as potential adsorbent[J]. Desalination and Water Treatment, 2014, 52(1): 227-237.

[14] QI P, ZENG T, WEN Z, et al. Interference-free simultaneous determination of Sudan dyes in chili foods using solid phase extraction coupled with HPLC-DAD[J]. Food Chemistry, 2011, 125(4): 1462-1467.

[15] DIXIT S, KHANNA S K, DAS M. A simple method for simultaneous determination of basic dyes encountered in food preparations by reversed-phase HPLC[J]. Journal of AOAC International, 2011, 94(6): 1874-1881.

[16] ZACHARIS C K, KIKA F S, TZANAVARAS P D, et al. Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of fi ve banned fat-soluble colorants in spices using a narrow-bore monolithic column[J]. Talanta, 2011, 84(2): 480-486.

[17] HOU X, LI Y, CAO S, et al. Analysis of para red and Sudan dyes in egg yolk by UPLC-MS-MS[J]. Chromatographia, 2010, 71(1/2): 135-138.

[18] LI C, WU Y L, SHEN J Z. UPLC-ESI-MS/MS analysis of Sudan dyes and Para Red in food[J]. Food Additives and Contaminants, 2010, 27(9): 1215-1220.

[19] SCHUMMER C, SASSEL J, BONENBERGER P, et al. Low-level detections of Sudan Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in spices and chili-containing foodstuffs using UPLC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(9): 2284-2289.

[20] DADáKOVá E, K?í?EK M, PELIKáNOVá T. Determination of biogenic amines in foods using ultra-performance liquid chromatography (UPLC)[J]. Food Chemistry, 2009, 116(1): 365-370.

[21] SUN H, WANG L, AI L, et al. A sensitive and validated method for determination of melamine residue in liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction[J]. Food Control, 2010, 21(5): 686-691.

[22] 趙珊, 張晶, 丁曉靜, 等. 凝膠凈化/超高效液相色譜電噴霧質譜法檢測調味油中11種禁用偶氮染料及羅丹明B[J]. 分析測試學報, 2012, 31(4): 448-452.

[23] 曾泳艇, 黎永樂, 張協光. 固相萃取. 超高效液相串聯質譜法同時測定食品中紅色2G、酸性大紅、酸性橙Ⅱ和酸性金黃G[J]. 廣東化工, 2012, 39(3): 151-160.

[24] 劉艷琴, 王浩, 楊紅梅, 等. 固相萃取-高效液相色譜法同時測定食品中9 種人工合成色素[J]. 糧油加工, 2010, 40(12): 168-171.

[25] 劉艷琴, 王浩, 楊紅梅, 等. 固相萃取-HPLC 法同時測定糕點中8種人工合成色素[J]. 食品研究與開發, 2010, 31(2): 139-142.

[26] 曹鵬, 喬旭光, 婁喜山, 等. 固相萃取結合超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測食品中的6 種工業染料[J]. 分析化學, 2011, 39(11): 1670-1675.

[27] 奚星林, 邵仕萍, 徐娟, 等. 固相萃取-高效液相色譜法同時測定食品中12 種合成色素[J]. 中國食品衛生雜志, 2012, 24(3): 217-222.

[28] SUN H, SUN N, LI H, et al. Development of multiresidue analysis for 21 synthetic colorants in meat by microwave-assisted extractionsolid-phase extraction-reversed-phase ultrahigh performance liquid chromatography[J]. Food Analytical Methods, 2013, 6(5): 1291-1299.

Determination of Congo Red in Chili Powder by Solid Phase Extraction Coupled with Ultra-High Performance Liquid Chromatography

ZHONG Ci-ping1, WEI Wei1, WANG Zheng-hong2, QIU Hong2, HU Li-li2, GU Wan-jiang2, GAN Yuan2, TANG Xiao-qin2, LI Lin3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Chongqing Center for Disease Control and Prevention, Chongqing 400042, China; 3. Hospital of Southwest University, Chongqing 400716, China)

Objective: To establish a method for determining Congo red in chili powder by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC). Methods: Samples were extracted with a mixture of ammonia and ethanol (30:70, V/V). The extraction process was aided by ultrasonic treatment and repeated three times. The combined extract was concentrated and then clean-up on an HLB solid-phase extraction cartridge by washing with 5 mL of 1% formic acid in methanol and elution with 5 mL of 10% ammonia in methanol. The collected eluate was concentrated under a stream of nitrogen prior to analysis. The chromatographic separation was achieved within 4 min on a BEH C18column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) by gradient elution using acetonitrile as mobile phase A and 10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase B at a fl ow rate of 0.4 mL/min. The detection wavelength was set at 498 nm and the column temperature was maintained at 40 ℃. Results: Average recoveries of Congo red from chili samples spiked three concentration levels ranged from 72% to 96% with relative standard deviation of 2.16%–5.97% (n = 6). The detection limit of the proposed method was 0.029 0 mg/kg, and the correlation coeffi cient for the calibration curve was 0.999 9. Conclusion: This method is simple, rapid, accurate, sensitive and suitable for detecting Congo red dye in chili powder.

ultra-high performance liquid chromatography (UPLC); chili powder; Congo red; quantitative determination

TQ613.12

A

1002-6630（2014）10-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201410037

2013-07-10

鐘慈平（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：zcp772@163.com

*通信作者：李林（1957—），男，教授，主任醫師，研究方向為食品營養與衛生。E-mail：lilinlqc@163.com