蘆丁抑制牛血清白蛋白糖基化

李曉明，鄧榮華，孔陽輝，夏秋琴，呂麗爽*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

蘆丁抑制牛血清白蛋白糖基化

李曉明，鄧榮華，孔陽輝，夏秋琴，呂麗爽*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

目的：考察蘆丁對糖及活性二羰基化合物誘導(dǎo)的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）糖基化的抑制效果。方法：建立牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）、牛血清白蛋白-乙二醛（bovine serum albumin-glyoxal，BSA-GO）、牛血清白蛋白-還原糖反應(yīng)體系，利用熒光光 譜的方法考察MGO、GO和還原糖對于BSA糖基化的影響，并考察蘆丁對于3個反應(yīng)體系中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的抑制作用。結(jié)果：MGO、GO、還原糖濃度分別為0.5、0.5、10 mmol/L時引發(fā)BSA蛋白糖基化反應(yīng)較為顯著。對于上述3個體系，蘆丁的添加濃度分別為0.25、0.25、1 mmol/L時，能有效地抑制AGEs的形成。結(jié)論：蘆丁能有效地抑制BSA-MGO、BSA-GO、BSA-還原糖體系的牛血清白蛋白糖基化。

牛血清白蛋白；二羰基化合物；蘆丁；糖基化終末產(chǎn)物

蛋白糖基化是在糖及活性二羰基化合物的作用下，蛋白質(zhì)中的氨基酸基團與活性羰基作用引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物學功能改變的反應(yīng)。活性二羰基化合物丙酮醛和乙二醛是形成糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的前體，屬于高反應(yīng)活性糖基化因子，比葡萄糖的活性高200～50 000倍[1]。蛋白糖基化反應(yīng)會形成分子內(nèi)或者分子間交聯(lián)，最終產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的晚期AGEs。研究表明：由于這類產(chǎn)物具有不可逆性，外源攝入過多的AGEs[2-4]或者內(nèi)源性產(chǎn)生AGEs的積累[5-6]，會引起阿茲海默癥[7]以及糖尿病并發(fā)癥如糖尿病性腎病[8]和糖尿病性視網(wǎng)膜疾病[9]，從而對機體造成很大的損傷。研究發(fā)現(xiàn)AGEs的致病機制主要包括兩個方面：第一，糖類物質(zhì)直接與蛋白質(zhì)交聯(lián)，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改變其功能。第二，AGEs與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結(jié)合，激活下游信號通路，改變細胞的功能，從而影響其生理活性[10]。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人體內(nèi)一種最常見的蛋白質(zhì)，其糖基化的速度是血紅蛋白的9倍，能反映近期血糖的水平。熒光法測定HSA蛋白糖基化顯示，短期內(nèi)熒光值可從3 mmol/mol Lys增加至6 mmol/mol Lys[11]。BSA和HSA有80%以上的同源性[12]且結(jié)構(gòu)組成上相似，其差異性主要是BSA與HSA中的疏水性氨基酸不同，而蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)并沒有本質(zhì)的區(qū)別。且由于BSA安全、易得，因此可替代HSA被廣泛地應(yīng)用于模擬人體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化的研究。

自然界黃酮種類繁多，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為：黃酮類、黃酮醇、異黃酮、查耳酮、黃烷3-醇以及花青素。研究發(fā)現(xiàn)兒茶素、根皮素、染料木素、原花青素等黃酮類化合物能夠在生理條件下抑制AGEs的形成[13-16]。基于對黃酮醇類化合物對蛋白糖基化抑制規(guī)律的研究尚不夠完善，本實驗選取水溶性好的雙糖苷蘆丁來表征黃酮醇類化合物，通過不同條件誘導(dǎo)蛋白糖基化體系，探討蘆丁抑制AGEs形成的規(guī)律。AGEs的組成部分由于蛋白質(zhì)的交聯(lián)，其結(jié)構(gòu)具有一定的熒光吸收，故可以采用熒光光譜法測定AGEs的含量來反映AGEs的總含量[17-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（分子生物級）、青霉素鏈霉素混合液 生工生物工程（上海）有限公司；丙酮醛、乙二醛美國Sigma公司；葡萄糖、果糖、半乳糖 上海國藥集團化學試劑有限公司；核糖 上海如吉生物科技有限公司；蘆丁（98%） 南京廣潤生物制品有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 上海久億化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F200 多功能酶標儀 瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計 上海三信儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁對MGO（或GO）誘導(dǎo)牛血清蛋 白糖基化的影響

1.3.1.1 不同濃度MGO（或GO）和不同階段BSAMGO（GO）體系中AGEs形成量的測定

依據(jù)文獻[15]的測定方法加以改進,用濃度為0.2 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解BSA，在10 mL的離心管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液、3 mg/mLBSA稀釋液3 mL，再分別加入不同稀釋濃度的MGO（或GO）溶液3 mL，使其最后的濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.5 mmol/L。37 ℃水浴加熱，在0、4、8、12、24、72、144、288、432、720 h分別取樣500 μL于2 mL離心管中，－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定λEx/λEm=340 nm/465 nm熒光值，增益設(shè)定為55，以磷酸鹽緩沖液代替MGO溶液作為空白，以不含蘆丁組為對照組，做3組平行實驗。

1.3.1.2 蘆丁對BSA-MGO（GO）體系中AGEs形成的抑制

依據(jù)文獻[15]的測定方法加以改進,用濃度為0.2 mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解BSA，在10 mL的離心管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和4.5 mg/mL BSA稀釋液2 mL，再加入PBS稀釋的MGO（GO）溶液，使其最終濃度為500 ?mol/L。在上述的溶液體系中加入不同濃度的DMSO溶解的蘆丁溶液，使其最終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5 mmol/L，37 ℃水浴加熱，在0、24、72、144、288、432、720 h時分別取樣500 μL于2 mL離心管，－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定熒光值，計算AGEs抑制率。

AGEs抑制率/%=（1－Rfu蘆丁樣品組/Rfu空白組）×100

式中：Rfu蘆丁樣品組為蘆丁樣品組相對熒光值；Rfu空白組為空白組相對熒光值。

1.3.2 蘆丁對不同還原糖引起的牛血清蛋白糖基化的影響

1.3.2.1 不同還原糖種類和濃度對BSA-還原糖體系中AGEs形成量影響的測定

依據(jù)文獻[20]的測定方法加以改進,用濃度為0.2 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解BSA，在10 mL的離心管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和3 mg/mL BSA稀釋液3 mL，再加入稀釋后不同濃度的葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖溶液3 mL，使其最后的濃度分別為5、10、20、50、100 mmol/L，37 ℃水浴加熱，720 h后－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定熒光值，計算AGEs抑制率。

1.3.2.2 蘆丁抑制BSA-還原糖體系中AGEs形成的過程

依據(jù)文獻[20]的測定方法加以改進,用濃度為0.2 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解BSA，在10 mL的離心管中加入0.2 mL青霉素和鏈霉素的混合溶液和4.5 mg/mL BSA稀釋液2 mL，再加入稀釋后的葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖溶液，使其最后的濃度分別為10 mmol/L，在上述的溶液體系中加入不同濃度DMSO溶解的蘆丁溶液，使其最終濃度分別為1、5、50、250、1 000 ?mol/L，37 ℃水浴加熱，720 h后－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定熒光值，計算AGEs抑制率。

1.3.2.3 蘆丁抑制BSA-核糖體系中AGEs形成的過程

參照1.3.2.2節(jié)實驗方法制備BSA與核糖反應(yīng)體系，37 ℃水浴加熱條件下，在0、24、72、144、288、432、720 h分別取樣500 μL于2 mL離心管，－20 ℃冷凍貯藏。解凍后測定熒光值，計算AGEs抑制率。

1.4 統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2010 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對MGO誘導(dǎo)牛血清蛋白糖基化的抑制效果

2.1.1 MGO濃度對BSA-MGO體系中AGEs形成量的影響

圖1 MGO濃度對BSA-MGO體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig.1 Effect of methylglyoxal concentration on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-methylglyoxal system

由圖1可知，不同濃度的MGO（0.1～1.5 mmol/L）在24 h之內(nèi)隨著反應(yīng)時間的增長，與BSA發(fā)生糖基化反應(yīng)，形成了具有熒光吸收的糖基化終末產(chǎn)物。24 h后，隨著時間的增加，晚期糖基化終產(chǎn)物的量不再增加。隨著MGO濃度的增加，相對熒光值不斷升高，AGEs產(chǎn)量增加，表明MGO濃度與熒光值存在量效關(guān)系。當MGO濃度為0.5 mmol/L時，牛血清蛋白糖基化反應(yīng)已經(jīng)非常顯著，故確定后續(xù)實驗中選取誘導(dǎo)牛血清蛋白糖基化的MGO濃度為0.5 mmol/L。

2.1.2 蘆丁抑制BSA-MGO體系中AGEs形成的活性

圖2 蘆丁濃度對BSA-MGO體系對AGEs形成的影響Fig.2 Effect of rutin concentration on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-methylglyoxal system

由圖2可知，在0.25～2.5 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，蘆丁有明顯的抑制AGEs形成的效果，且產(chǎn)生的AGEs的量隨著蘆丁濃度的增加減少。當蘆丁濃度為0.25 mmol/L，反應(yīng)24 h后蘆丁對AGEs的抑制率達到79.42%；當蘆丁濃度增加到0.5 mmol/L，反應(yīng)24 h后對AGEs的抑制率高達95.93%。

2.2 蘆丁對GO誘導(dǎo)牛血清蛋白糖基化的抑制效果

2.2.1 GO濃度對BSA-GO體系中AGEs形成量的影響

圖3 GO濃度對BSA-GO體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig.3 Effect of glyox al concentration on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-glyoxal system

由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的增長，BSA不斷與不同濃度的GO（0.1～1.5 mmol/L）發(fā)生反應(yīng)，形成了具有熒光的糖基化終末產(chǎn)物。隨著GO濃度的增加，體系中相對熒光值不斷升高，表征產(chǎn)生AGEs越多。當GO濃度為0.5 mmol/L時，牛血清蛋白糖基化程度已經(jīng)非常顯著，因此在后續(xù)實驗中選擇GO誘導(dǎo)牛血清蛋白糖基化的濃度為0.5 mmol/L。另外，GO引起糖基化的反應(yīng)比MGO緩慢。整個反應(yīng)周期內(nèi)糖基化終產(chǎn)物的量始終在不斷增加。與MGO相比，GO和牛血清蛋白糖基化的反應(yīng)活性低、速度慢，且在相同的時間內(nèi)糖基化終產(chǎn)物的熒光強度明顯低于MGO。說明GO產(chǎn)生的AGEs低于MGO產(chǎn)生的AGEs。

2.2.2 蘆丁抑制BSA-GO體系中AGEs形成的活性

圖4 蘆丁濃度對BSA-GO體系對AGEs形成的影響Fig.4 Effect of rutin concentration on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-glyoxal system

由圖4可知，在0.25～2.5 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，蘆丁具有一定的抑制AGEs形成的作用，且抑制作用隨著蘆丁濃度的增加增強。當蘆丁濃度為0.25 mmol/L時，蘆丁抑制BSA-GO體系A(chǔ)GEs形成的效果相當顯著，隨著時間延長到24 h時，蘆丁對AGEs的抑制率達到53.26%；當蘆丁濃度增加到0.5 mmol/L、作用時間為24 h時，蘆丁對AGEs的抑制率稍有增加，為57.71%。隨著反應(yīng)時間的不斷增長，蘆丁對AGEs的抑制率也逐漸增加，當作用時間為30 d，蘆丁濃度為0.5 mmol/L時，其對AGEs的抑制率可達到93.48%。MGO體系在蘆丁濃度相同的條件下對AGEs的抑制率達到90%以上，作用時間只需24 h，遠遠短于GO體系中的30 d。

2.3 蘆丁對不同還原糖引起的牛血清蛋白糖基化的抑制效果

2.3.1 還原糖種類和濃度對BSA-還原糖體系中AGEs形成量的影響

體系的還原糖濃度為5～100 mmol/L條件下，選取葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖4種不同種類的糖，研究其對BSA-還原糖體系中AGEs形成的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 糖濃度和種類對BSA-還原糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig.5 Effect of concentration and species of sugar on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-sugar system

由圖5可知，720 h時，隨著還原糖濃度的增加，蛋白糖基化反應(yīng)加強，AGEs產(chǎn)量增加。其中由果糖和核糖引發(fā)的蛋白糖基化，AGEs量隨著濃度增大顯著增加；而由葡萄糖和半乳糖引發(fā)的AGEs產(chǎn)量隨濃度變化不顯著。說明不同種類的糖引發(fā)蛋白糖基化的活性存在顯著的差異，核糖和果糖更易于引發(fā)牛血清蛋白糖基化，產(chǎn)生較多AGEs，且AGEs與糖的濃度存在量效關(guān)系。在相同濃度下核糖引發(fā)牛血清蛋白糖基化的活性大于果糖。

2.3.2 蘆丁抑制不同還原糖引起的牛血清蛋白糖基化的活性

圖6 蘆丁濃度對BSA-還原糖體系對AGEs形成的影響Fig.6 Effect of rutin concentration on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-sugar system

由圖6可知，720 h時，在牛血清白蛋白在BSA-還原糖體系中，蘆丁具有明顯抑制AGEs形成的功效，且抑制率隨著蘆丁濃度的增加，其對AGEs的抑制率顯著增加。當蘆丁濃度為0.25 mmol/L時，對葡萄糖、果糖、半乳糖、和核糖與牛血清蛋白產(chǎn)生的AGEs的抑制率分別為56.05%、52.13%、49.29%、47.24%；而當蘆丁濃度增大為1 mmol/L的時候，對4種糖的抑制率分別達到71.53%、75.73%、76.89%、74.14%。另外，實驗結(jié)果還表明還原糖的種類對于蘆丁抑制BSA-還原糖體系中AGEs形成量影響不大。

2.3.3 蘆丁在不同階段抑制BSA-核糖體系中AGEs形成的功效

圖7 蘆丁對BSA-核糖體系A(chǔ)GEs形成的影響Fig.7 Effect of rutin on the formation of advanced glycation end products in bovine serum albumin-ribose system

核糖是一種人體內(nèi)存在的主要五碳糖，其引發(fā)蛋白糖基化的活性最強。由圖7可知，隨著時間的增加，牛血清蛋白與核糖作用產(chǎn)生的AGEs量逐步增加，當反應(yīng)到12 d時，產(chǎn)生熒光性的AGEs的量趨于平穩(wěn)。濃度為1 mmol/L的蘆丁，能有效的抑制體系中AGEs的產(chǎn)生。在反應(yīng)初期，蘆丁抑制AGEs的活性隨著時間的增加而增大；當作用時間為24 h時，蘆丁對AGEs的抑制率達到67.53%；12 d時，其抑制率達到68.6%。

3 討 論

通過對BSA-MGO、BSA-GO體系中形成AGEs的考察，表明在模擬生理條件下，一定濃度的MGO和GO能夠強烈地引發(fā)牛血清蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)，并產(chǎn)生大量具有熒光吸收的AGEs。且兩者相比，MGO誘導(dǎo)糖基化的能力較GO更強。在人體內(nèi)，這類活性二羰基化合物主要來源于糖與蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的Amadori分子重排產(chǎn)物、絲氨酸和蘇氨酸的分解產(chǎn)物或者磷酸丙糖的分解產(chǎn)物[11]。它們通常會作用于蛋白質(zhì)的關(guān)鍵性氨基酸，例如Arg、Lys[21-22]，并經(jīng)過一系列的重排和氧化還原反應(yīng)，最終產(chǎn)生AGEs[23]。

通過對BSA-還原糖體系中形成AGEs的考察，表明在模擬生理條件下，一定濃度的還原糖能夠和蛋白質(zhì)發(fā)生緩慢的美拉德反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)的糖基化。糖基化作用機理主要是糖與蛋白質(zhì)中的氨基作用形成Schiff堿，進而產(chǎn)生Amadori分子重排產(chǎn)物；通過裂解不穩(wěn)定的Schiff堿或者Amadori分子重排產(chǎn)物分解得到的二羰基化合物，二羰基化合物再與氨基酸上的活性氨基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生AGEs[11]。實驗中通過比較核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖與牛血清蛋白的糖基化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，核糖引發(fā)蛋白糖基化的作用最強，形成AGEs的量最多。各種糖的反應(yīng)活性依次為：核糖>果糖>葡萄糖/半乳糖。而核糖是人體細胞核的重要組成部分，是人類生命活動中不可缺少的物質(zhì)，因此，體內(nèi)核糖引發(fā)的蛋白糖基化作用不容忽視。

實驗表明還原糖引起蛋白糖基化的反應(yīng)與二羰基化合物引發(fā)蛋白糖基化相比，其反應(yīng)速率較慢，12 d才能完成；而二羰基化合物非常活潑，尤其是MGO，只要24 h即可與牛血清完成蛋白的糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的AGEs。究其原因，還原糖與蛋白質(zhì)中游離氨基發(fā)生一系列反應(yīng)過程中產(chǎn)生中間產(chǎn)物——活性二羰基化合物，進而形成AGEs[11]。因此研究由活性二羰基化合物引起的蛋白糖基化具有更為重要的的實際意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠有效抑制分別由活性二羰基化合物和還原糖引發(fā)的蛋白糖基化反應(yīng)。蘆丁抑制活性二羰基化合物的反應(yīng)發(fā)生在24 h之內(nèi)。在濃度為0.25 mmol/L時，24 h時蘆丁抑制MGO和GO引發(fā)的蛋白糖基化形成AGEs的抑制率分別為79.42%、53.26%。蘆丁對蛋白糖基化的抑制作用不受糖種類的影響，且在反應(yīng)初期就達到較好的抑制率，當濃度為0.25 mmol/L時，24 h抑制率達60%以上。國外文獻報道，部分黃酮類化合物抑制活性二羰基化合物引發(fā)蛋白糖基化的作用機理為通過捕獲MGO和GO二羰基化合物形成加合物，從而抑制AGEs的形成[13-15]。推測蘆丁也是通過捕獲糖分解產(chǎn)生的活性二羰基化合物，從而在一定程度上抑制BSA-糖體系中AGEs的形成，但其作用機制以及具體作用過程有待進一步實驗驗證。

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Inhibitory Effect of Rutin on the Formation of Advanced Glycation End Products (AGEs) from Bovine Serum Albumin

LI Xiao-ming, DENG Rong-hua, KONG Yang-hui, XIA Qiu-qin, Lü Li-shuang*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Purpose: To study the inhibitory effect of rutin on the formation of advanced glycation end products (AGEs) in bovine serum albumin (BSA) system caused by sugar or dicarbonyl compounds metabolized by sugar. Methods: BSAMGO (methylglyoxal), BSA-GO (glyoxal) and BSA-reducing sugar reaction systems were established. The effects of MGO, GO and reducing sugar concentrations on the formation of AGEs were investigated by fluorescence spectrophotometry. The inhibitory effect of rutin on the formation of AGEs was investigated at various concentrations added in three reaction systems. Results: Non-enzymatic glycation of BSA was obviously observed in these three systems with MGO, GO and sugar at 0.5, 0.5 mmol/L and 10 mmol/L, respectively. Rutin addition at concentrations of 0.25, 0.25 mmol/L and 1 mmol/L could effectively inhibit the formation of AGEs in the three systems. Conclusion: Rutin can effectively inhibit AGEs in BSAMGO, BSA-GO and BSA-sugar systems.

bovine serum albumin; dicarbonyl compounds; rutin; advanced glycation end product

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0085-05

10.7506/spkx1002-6630-201403018

2013-04-16

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（CXLX12_0417）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012850）；江蘇省教育廳自然科學基金項目（12KJB5500005）

李曉明（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：lixiaoming2000@163.com

*通信作者：呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向為功能性食品成分的分離及活性。E-mail：lishuanglv@126.com