紅蓮外皮原花青素的純化與分析

李綺麗，彭芳剛，劉德明，劉珍寶，吳衛國,*

（1.湖南農業大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省 重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南農業大學 作物種質創新湖南省重點實驗室，分析測試中心國家重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.中南大學藥 學院，湖南 長沙 410013）

紅蓮外皮原花青素的純化與分析

李綺麗1,2，彭芳剛1，劉德明3，劉珍寶4，吳衛國1,*

（1.湖南農業大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省 重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南農業大學 作物種質創新湖南省重點實驗室，分析測試中心國家重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.中南大學藥 學院，湖南 長沙 410013）

原花青素作為多酚的一大類廣泛存在于天然植物中。紅蓮外皮原花青素粗提取物采用大孔樹脂AB-8和聚酰胺柱進行兩次純化。純化物通過紅外光譜（infrared spectrum，IR）和電子噴霧離子化質譜（electrospray ionization-mass spectroscopy，ESI-MS）對成分進行分析，并通過反相液相色譜-質譜（reverse phase high-performance liquid chromatography- mass spectroscopy，RP-HPLC-MS/MS）聯用對組分進行分 離鑒定。結果表明：純化物中有9種原花青素單體和低聚體，其中包括兒茶素和表兒茶素（m/z 289）、棓兒茶素（m/z 305），4種原花青定二聚體的同分異構體（m/z 577）和2種原花青定四聚體的同分異構體（m/z 1 153）。

蓮子；原花青素；紅外光譜；液質聯用

蓮子是睡蓮科水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的成熟種子，在我國及東南亞作為傳統已開拓的食材和中藥材已為人所熟知。近年來，隨著種植規模的逐年增加，蓮子的產量也迅速增長，年產量可達到10萬t左右。目前市售的蓮子干品通常已經除去紅色外皮，因此蓮子產率的增長也伴隨著蓮子皮的產量增加，每年蓮子皮的產量可達到5 000 t左右。而這些蓮子皮一般只是用于動物飼料，甚至是作為廢棄物處理掉，造成了資源的極大浪費。通過對蓮子皮的初步成分分析，發現其中富含原花青 素這種具有多種生物功能活性的天然成分。因此，若能從蓮子表皮中提取分離原花青素，并開展應用研究將是一項非常有意義的工作。

原花青素是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，具有C6－C3－C6的結構特征。按結構單元的不同，原花青素主要可以分為表兒茶素/兒茶素構成的原花青定、表棓兒茶素/棓兒茶素構成的原翠雀定和表阿福豆素/阿福豆素）構成的原天竺葵定。按連接方式的不同，有由C－C和C－O－C兩類鍵相連構成的雙鏈型A型原花青素和由C4－C8或C4－C6連接構成的單鏈型B型原花青素。依據聚合度大小可分為單體黃烷如兒茶素、表兒茶素、棓兒茶素和表棓兒茶素等，低聚原花青素（聚合度（degree of polymerization，DP）為2～4）和高聚原花青素（DP≥5）[1-2]。通常從植物中提取出的原花青素都是不同聚合度的聚合 體組成的復雜混合物。研究表明，原花青素的功能活性與單體組成、單體之間連接鍵的形式以及DP的大小都有很大的關系[3-5]。因此對蓮子皮原花青素提取純化物的組成成分進行分析是十分必要的。

對于原花青素的定性分析，本實驗首先采用紅外光譜來初步判斷純化物中的化學基團，并確定物質大致組成信息（原花青定或原翠雀定）[6-7]。同時，運用反相液相色譜和液質聯用（high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS）技 術，根據液相和質譜信息來對產物組分的分子質量大小 和結構信息進行推導，從而初步確定各組分的分子結構式[8-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅蓮外皮粉來源于湖南湘潭粒粒珍有限公司。紅蓮經打磨加工后剩下的蓮子外皮粉末在工廠經收集，轉移至實驗室，過100目篩，40 ℃烘箱干燥至水分含量（5.0±0.2）%，在冷藏室（7±2） ℃條件下保存。

兒茶素、表兒茶素、棓兒茶素標準品（純度＞98%） 美國Sigma公司；丙酮、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、鹽酸等均為分析純，甲醇、乙腈、冰乙酸均為色譜純 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

AB-8大孔樹脂、聚酰胺樹脂（30～60目） 天津市光復精細化工研究所；6700紅外光譜分析儀 美國Nicolet公司；LC 1200液相色譜儀、6530四極桿-飛行時間質譜-1290UHPLC聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子皮原花青素的提取

取蓮子外 皮粉過100目篩，按料液比1∶54（m/V）、丙酮體積分數67%、pH 2.7、提取溫度 37 ℃、提取時間90 min的條件進行提取。用檸檬酸調節pH值。加塞，放入恒溫振蕩器中，于130 r/min轉速下提取。待提取液冷卻，抽濾，收集上清液旋轉蒸發回收丙酮得提取物濃縮液。濃縮液經過乙酸乙酯反復萃取3次，回收乙酸乙酯，萃取物冷凍干燥成粉末備用。

1.3.2 原花青素純化物的制備

乙酸乙酯萃取物首先 經過AB-8大孔樹脂柱層析純化，50%丙酮溶液洗脫并回收得大孔樹脂純化物。取20 mg大孔樹脂純化物加入40 mL蒸餾水配制成0.5 mg/mL溶液，以16 Bv/h的流速上20 mL的聚酰胺層析柱進一步純化，分別用4 Bv（80 mL）體積分數分別為10%、30%、50%的丙酮溶液分級洗脫，分開收集10%丙酮洗脫物（M1）、30%丙酮洗脫物（M2）、50%丙酮洗脫物（M3）旋轉蒸發，濃縮液冷凍干燥以備分析之用。

1.3.3 紅外光譜掃描

將紅蓮外皮大孔樹脂純化物與溴化鉀按2%比例混合研磨壓片，在紅外光譜儀中先對純溴化鉀薄片進行背景掃描，然后再對含有樣品的KBr薄片進行掃描，掃描波數為4 000～400 cm-1，測定其紅外光譜。

1.3.4 反相液相色譜掃描分析

反相液相色譜掃描分析在安捷倫LC 1200液相色譜儀上進行。色譜柱為C18（250 mm× 4.6 mm），流動相為：A 0.25%乙酸溶液，B乙腈。梯度洗脫如下：7%～20% B，40 min；20% B平衡5 min，直到下次進樣。流速為0.8 mL/min，280 nm雙通道紫外-可見檢測器檢測。

1.3.5 高效液相色譜-電噴霧電離質譜分析

HPLC-ESI-MS分析在安捷倫UHPLC（1290）-Q/ TOF（6530）MS系統上進行。ESI-MS條件：掃描方式：負離子掃描，碎片電壓135 V，毛細管電壓2 500 V霧化壓力30 psi，干燥氣體溫度350 ℃，質譜離子范圍50～3 000 D。

2 結果與分析

2.1 紅蓮外皮原花青素近紅外光譜分析

紅蓮外皮原花青素提取物經大孔樹脂純化后得淺紅色粉末。將粉末通過傅里葉變換紅外光譜儀掃描，得紅外光譜圖1。

圖1 紅蓮外皮原花青素紅外光譜圖Fig.1 IR spectrum of chromatographically eluted proanthocyanidins

由圖1可知，3 425 cm-1處的強吸收峰，是原花青素分子中羥基的伸縮振動，2 923 cm-1處苯環的C－H伸縮振動，1 619、1 517、1 449 cm-1處是苯環骨架C＝C的特征伸縮振動峰，1 282、1 201 cm-1處是酚羥基伸縮振動及面內彎曲振動，1 146 cm-1處是C環中的C－H伸縮振動，1 103、1 064 cm-1處是原花青素分子中C－C的伸縮振動，818 cm-1處的吸收峰可能是由于苯環上有3個相鄰的H存在產生的，771 cm-1處芳香環的不飽和C－H面外變形振動。對于原花青素基本結構單元構成的分析，主要集中在1 000～1 650 cm-1和700～850 cm-1這2個特征骨架振動波數區域。1 520～1 540 cm-1間只有一個單峰，說明蓮子皮原花青素提取物主要是由兒茶素的結構單元構成的原花青定聚合物。另外，在730～780 cm-1范圍內，原花青素純化物的紅外譜圖在770～780 cm-1處有一個單峰，730 cm-1處沒有吸收峰，進一步確定原花青素是以原花青定為主的聚原花青素[13]。

2.2 紅蓮外皮原花青素反相液相色譜掃描分析

通過聚酰胺的進一步純化，用3個不同體積分數丙酮溶液洗脫得到0%丙酮洗脫物（M1）、30%丙酮洗脫物（M2）、50%丙酮洗脫物（M3）3個洗脫片段。3個片段的液相色譜圖見圖2。

圖2 聚酰胺柱分級洗脫片段的RP-HPLC分析Fig.2 RP-HPLC analysis of fractions eluted with aqueous acetone solvents

紅蓮外皮原花青素由于聚合度的不同，分子的大小及所含羥基的數目會有很大的差別，從而導致其極性也有很大差異。因此采用分級洗脫的方法，即用不同體積分數（不同極性）是對提取物的成分加以分離和鑒定是常用的方法。聚酰胺柱分級洗脫的原理就是聚酰胺分子中含有非極性的脂肪鍵和極性的酰胺基團。當流動相為極性較強的溶劑（如水、丙酮等）時，聚酰胺作為非極性的固定相，其層析行為類似反相分配層析，故極性較大的吸附物容易被洗脫。隨著洗脫劑的極性降低，極性較小的化合物就會相繼被洗脫下來[14]。本實驗選用丙酮溶液進行洗脫。因為水的極性比丙酮大，故隨著丙酮體積分數的增大，其極性則會逐漸降低。由圖2可知，不同體積分數不同極性下洗脫下來的原花青素片段有一定的差別，但具體組分還有待做進一步的液質聯用分析才能確定。

2.3 LC-MS結果分析

對M1、M2、M33個片段進行液質聯用分析，根據準分子離子m/z進行選擇離子檢測，紅蓮外皮聚酰胺純化物中原花青素的基本組成的初步分析見表1。

表1 10%、30%和50%丙酮洗脫片段原花青素主要成分的質譜信息Table 1 Analytical data for the fractions eluted with 10%, 30% and 50% acetone in water

通過和標準品共同進樣，得出在10.531 min的為棓兒茶素（F1），21.543 min的為兒茶素（F4），28.321 min的為表兒茶素（F7）。二聚體在17.121、19.214、25.932、30.612 min時均為577，可以斷定四者為兒茶素與表兒茶素構成的原花青素二聚體的同分異構體。在22.867、35.836 min時，相對分子質量為1 153，推斷出可能是原花青定四聚體[14-18]。

由此可以看出，在丙酮體積分數較低時，洗脫出來的主要是兒茶素和表兒茶素的單體和一種原花青定二聚體。隨著丙酮體積分數的增加，洗脫出來的原花青素的聚合度也逐漸增大。此現象可以解釋為，水的極性比丙酮大，隨著丙酮體積分數的增加，丙酮溶液的極性就越來越低，根據極性相吸的原理，低濃度高極性的丙酮溶液會洗脫出原花青素成分兒茶素和表兒茶素單體應該是強極性的，而丙酮體積分數增加極性減弱，原花青素聚合度越來越大極性也越來越弱。從理論上講，原花青素分子中不僅存在氫鍵與范德華力兩種，還會存在色散力。氫鍵的作用力是由分子內羥基或不同分子之間的羥基產生的；范德華力是廣泛存在于所有分子之間的；而色散力則與分子的大小和空間構型有一定的關系，也對分子的極性產生影響。當原花青素聚合度增加時，羥基的數目也會增加使極性增大，而色散力的增加則會使極性減小，兩種完全相反的作用力會使聚合體原花青素極性發現變化。本實驗的研究表明，隨著聚合度的增加，原花青素極性降低了，故應該是色散力起了主導作用[17]。因此，通過改變洗脫液的極性以達到不同聚合度原花青素的初步分離無論在理論還是在實踐上都是可行的。另外，關于蓮屬中原花青素的研究，雖然對蓮子外皮的研究很少，但是已有科研人員對蓮蓬進行了研究。Ling Zhiqun等[18]通過對蓮蓬的原花青素的純化和分析發現，原花青素的主要相對分子質量分布為290、578、730、866、1 018和1 154等，說明聚合體主要是由兒茶素或表兒茶素組成的原花青定，而這一結論與本研究中蓮子外皮提取的原花青素主要成分基本相同。

2.4 二級質譜分析

為進一步確認原花青素的結構，對二聚體（m/z 577）和四聚體（m/z 1 153）進行了二級質譜分析。文獻報道的原花青素聚合體主要的降解方式包括：1）黃酮間連接鍵的斷裂；2）RDA反應，即逆迪爾斯-阿德爾反應，發生在C2和O，C3和C4鍵的斷裂；3）C環開環后，失去一個間苯三酚單元[21]。而原花青素的碎片斷裂方式已經被許多研究者證實[20-25]。

為便于區分原花青素結構中的黃烷醇單元，Porter提出了一種用黃烷類內部結合的位置來命名的方法，包括只有C4鍵和其他基團相連的稱為T-Unit，既有C4也有C6或者C8與其他基團相連的被稱為M-Unit，而只有C6或者C8與其他基團相連的，被稱為B-Unit[19]。

圖3 原花青定二聚體（[M-H] 577）的CID-MS-MS圖譜Fig.3 CID-MS-MS spectrum of procyanidin dimer ([M-H] of m 577)

表2 原花青定二聚體的二級質譜主要碎片Table 2 Main masses in the MS-MS spectrum of procyanidin dimer

二聚體原花青定F2、F3、F6和F8（m/z 577）二級質譜圖斷裂方式相同，均產生兩個主要碎片m/z 407、m/z 289（圖3和表2）。，為二聚體發生RDA（Retro Diels-Alder reactions）反應并脫水的產物。RDA是二聚體裂解的主要碎片，而脫水反應產物也常被檢測到，甚至比RDA反應更強烈。（m/z=289）為C4－C8鍵斷裂，失去一個（表）兒茶素單元（Cat）后的產物。

四聚體（F5、F9）的碎片分析方式相同。F5產生了5個碎片，包括m/z 1001、865、695、575、287（圖4和表3）；F9也產生了5個碎片，包括m/z 865、739、575、423、287（圖5和表4）。黃烷骨架C環的RDA裂解失去C8H8O3碎片（m/z 152），剩下碎片m/z 1 001。黃烷醇連接鍵的裂解有兩種方式。一種裂解為失去T-unit的碎片，而產生包含B-unit的二聚體和三聚體碎片即[MB-H]－（m/z 865）和[MB-H]－（m/z 577）。另一種則相反為失去B-unit的碎片，而產生包含T-unit的二聚體和三聚體碎片即[MT-H]－（m/z 865）和[MT-H]－（m/z 575）。其中m/z 865失去C6H6O3得m/z 739，m/z 575失去C8H8O3得m/z 423。準分子離子m/z 695為四聚體在黃烷醇連接鍵裂解后的RDA產物。

圖4 原花青定四聚體FCID-MS-MS圖譜Fig.4 CID-MS-MS spectrum of procyanidin tetramer F5 ([M-H]－, m/z 1 153)

表3 原花青定四聚體F3）的二級質譜主要碎片Table 3 Major masses in the MS-MS spectrum of procyanidin tetrame

表3 原花青定四聚體F3）的二級質譜主要碎片Table 3 Major masses in the MS-MS spectrum of procyanidin tetrame

m/z 裂解途徑 碎片1 153.2 [M-H]－1 001.2 [M-C8H8O3-H]－RDA裂解產物865.2 [M-C15H12O6-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去T單元（Mr288）的產物695.1[M-C15H12O6-C8H8O3-H2O-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去T單元（Mr288）后的RDA裂解產物575.1 [M-C30H26O12-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去B單元和M單位（Mr578）后的產物287.1 [M-C45H38O18-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去B單元和2個M單位（Mr866）后的產物

圖5 原花青定四聚體FCID-MS-MS圖譜Fig.5 CID-MS-MS spectrum of procyanidin tetramer F9 ([M-H]－ of m/z 1 153)

表4 原花青定四聚體F9（[M）的CID-MS-MSS圖譜Table 4 Major masses in the MS-MS spectrum of procyanidin tetrammeerr FF9 ([MM--HH]]－ ooff m/zz 1 115533))

表4 原花青定四聚體F9（[M）的CID-MS-MSS圖譜Table 4 Major masses in the MS-MS spectrum of procyanidin tetrammeerr FF9 ([MM--HH]]－ ooff m/zz 1 115533))

m/z 裂解途徑 碎片1 153.2 [M-H]－865.2 [M-C15H12O6-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去T單元（Mr288）后的產物739.2 [M-C15H12O6-C6H6O3-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去T單元（Mr288）后的RDA裂解產物575.1 [M-C30H26O12-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去B單元和M單元（Mr578）后的產物423.1 [M-C30H26O12-C8H8O3-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去B單元和M單元（Mr578）后的RDA裂解產物287.1 [M-C45H38O18-H]－ 黃酮間連接鍵的斷裂失去B單元和2個M單元（Mr866）后的產物

3 結 論

3.1 通過近紅外光譜掃描，初步確定了紅蓮外皮原花青素大孔樹脂提取物的主要結構單元是由兒茶素或表兒茶素單元構成的原花青定聚合物。

3.2 通過聚酰胺的純化，用不同體積分數丙酮溶液洗脫得到10%丙酮洗脫物（M1）、30%丙酮洗脫物（M2）、50%丙酮洗脫物（M3）3個洗脫片段。通過HPLC-ESI-MS分析發現隨著丙酮體積分數的增加，洗脫出來的原花青素的聚合度也逐漸增大，因此通過分級洗脫可以達到分離不同聚合度原花青素的目的。

3.3 通過HPLC-ESI-MS/MS對原花青素分級洗脫片段在負離子條件下的檢測和二級質譜對結構的進一步分析，使得紅蓮外皮原花青素的基本成分得到了確認，包括兒茶素、表兒茶素單體（m/z 289）、棓兒茶素單體（m/z 305），4種原花青定二聚體的同分異構體（m/z 577）和2種四聚體（m/z 1153）。其中二級質譜研究發現，4種二聚體均含有荷質比為407和289的碎片信息，一種四聚體含有1 001、865、695、575、287的碎片信息，另一種四聚體含有865、739、575、423和287的碎片信息。

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Purification and Analysis of Proanthocyanidins from Red Peel of Lotus Seeds

LI Qi-li1,2, PENG Fang-Gang1, LIU De-ming3, LIU Zhen-bao4, WU Wei-guo1,*
(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Agricultural Product Processing Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Analysis and Tes ting Center of National Key Laboratory, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 4. School of Pharmaceutical Sciences, Central South University, Changsha 410013, China)

Proanthocyanidins, a large class of polyphenols, are widely present in natural plants. In this study, proanthocyanidins extracted from the red peel of lotus seeds were purified by a macroporous resin AB-8 and a polyamide column. Chromatographic eluates were analyzed by infrared spectroscopy (IR) and electrospray ionization-mass spectroscopy ( ESI-MS). The separated components of proanthocyanidins were further confirmed by reverse phase highperformance liquid chromatography-mass spectroscopy (RP-HPLC-MS/MS) to be nine monomers and oligomers of proanthocyandins including (+)-catechin, (-)-epicatechin (m/z 28 9), (+)-gallocatechin (m/z 305), four isomeric compounds of procyanidin dimers (m/z 577) and two tetramers (m/z 1 153).

lotus seed; proanthocyanidi ns; infrared spectroscopy; reverse phase highperformance liquid chromatography-mass spectroscopy

TS264.3

A

1002-6630（2014）03-0106-05

10.7506/spkx1002-6630-201403022

2013-04-18

李綺麗（1986—），女，博士研究生，研究方向為園藝產品采后科學與技術。E-mail：liqili1986@gmail.com

*通信作者：吳衛國（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：wuweiguo1986@sina.cn