苦蕎10 kD過敏原的重組表達(dá)及部分性質(zhì)分析

陳 鵬，封 雪，王 磊，鄧丹丹，李學(xué)俊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

苦蕎10 kD過敏原的重組表達(dá)及部分性質(zhì)分析

陳 鵬，封 雪，王 磊，鄧丹丹，李學(xué)俊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以苦蕎種子灌漿期cDNA文庫(kù)中獲得的苦蕎10 kD過敏原基因序列TBAP10（tartary buckwheat 10 kD allergen protein，TBAP10；GenBank登錄號(hào)JK729379.1）為基礎(chǔ)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET47b-TBAP10，重組蛋白在大腸桿菌BL21 Star（DE3）中以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)包涵體復(fù)性和鈷離子螯合層析純化目的蛋白，并對(duì)其過敏活性、熱穩(wěn)定性及在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。Western blotting顯示該蛋白與苦蕎16 kD過敏蛋白Fag t2存在免疫交叉反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA證明重組蛋白TBAP10具有與蕎麥過敏患者血清IgE特異的結(jié)合活性；TBAP10具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，能耐受15 min的沸水浴；模擬胃腸環(huán)境的消化結(jié)果顯示TBAP10對(duì)胃蛋白酶具有強(qiáng)的耐受性，但對(duì)胰蛋白酶無耐受性。

原核表達(dá)；過敏蛋白；免疫性質(zhì)；模擬胃腸消化

過敏性疾病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在過去10年里食物過敏患者增長(zhǎng)了近一倍。有資料顯示，高達(dá)6%的兒童以及3%～4%的成年人對(duì)一種或多種食物過敏[1]。食物過敏最常見的臨床癥狀表現(xiàn)為皮膚瘙癢、濕疹、蕁麻疹、頭暈、惡心、嘔吐、腹瀉，甚至少數(shù)人還會(huì)發(fā)生過敏性休克。因此，食品過敏已成為備受關(guān)注的食品安全問題。

蕎麥由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值而日益獲得人們的青睞，但對(duì)部分人來說，攝食蕎麥會(huì)引起過敏。1909年，Smith[2]報(bào)道了被稱為“蕎麥中毒”的蕎麥過敏癥。1972年，Horesh[3]首次報(bào)道美國(guó)兒童對(duì)蕎麥過敏的研究結(jié)果，證實(shí)其病理機(jī)制為IgE介導(dǎo)的I型速發(fā)過敏反應(yīng)。Noma等[4]于2001年首次報(bào)道了蕎麥過敏的致死病例。蕎麥中引起過敏的主要組分是蛋白質(zhì)。Yoshioka等[5]于2004年鑒定出甜蕎22 kD過敏蛋白為IgE抗體的主要結(jié)合蛋白，并證明有6個(gè)氨基酸為IgE結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)；2006年，Morita等[6]證實(shí)了這一結(jié)果并鑒定出甜蕎15 kD的過敏蛋白；Marija等[7]的研究結(jié)果顯示蕎麥過敏蛋白主要存在于種子貯藏蛋白的低分子質(zhì)量區(qū)，并鑒定出分子質(zhì)量為9、16、19、24 kD的過敏蛋白。隨著全球范圍內(nèi)食用蕎麥人數(shù)的激增，有關(guān)蕎麥過敏的報(bào)道也在不斷的增加。Sammut等[8]首次報(bào)道英國(guó)蕎麥過敏的成人病例，利用皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)證實(shí)其為IgE介導(dǎo)的致敏反應(yīng)，并在報(bào)道中指出隨著蕎麥消費(fèi)量的增加，蕎麥過敏現(xiàn)象在英國(guó)將越來越普遍。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)苦蕎22、24、56 kD過敏原進(jìn)行了克隆和重組表達(dá)研究，并利用體外IgE結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了過敏活性的分析[9-12]。迄今為止對(duì)于苦蕎低分子質(zhì)量過敏蛋白的深入研究報(bào)道較少。Jeon等[13]首先鑒定出苦蕎中存在有分子質(zhì)量約為10 kD的過敏原，Chen Peng等[14]克隆了苦蕎16 kD過敏蛋白基因（GenBank登錄號(hào)：ADW27428.1），建立了該過敏蛋白基因的重組表達(dá)體系并對(duì)其分子特性進(jìn)行了分析，在利用兔抗苦蕎16 kD過敏原的多克隆抗體對(duì)苦蕎種子清蛋白進(jìn)行Western雜交分析時(shí)，檢測(cè)到更低分子質(zhì)量的雜交信號(hào)，推測(cè)其可能是與16 kD過敏原同源的苦蕎10 kD過敏原。

為了進(jìn)一步探究苦蕎10 kD過敏原的性質(zhì)和生物學(xué)功能，本研究以苦蕎種子灌漿期cDNA文庫(kù)中獲得的10 kD過敏蛋白基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建其重組表達(dá)體系，并檢測(cè)重組蛋白的過敏活性，為分析該蛋白的核心過敏表位、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及研制低敏脫敏治療疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

原核表達(dá)載體pET47b、含有TBAP10基因的質(zhì)粒pTriplEx2-TBAP10、大腸桿菌菌株BL21 Star（DE3）和TOP10 本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

蕎麥過敏患者血清（血清中總IgE為350.3 IU/mL，來自于陜西省寶雞市一名對(duì)蕎麥過敏的31歲女性患者，在接觸蕎麥皮枕頭后出現(xiàn)咳嗽、流眼淚，哮喘等癥狀；食用含蕎麥?zhǔn)称泛蠹闯霈F(xiàn)腹瀉、嘔吐、渾身起麻疹，呼吸困難等癥狀）、兔抗苦蕎16 kD過敏原Fag t2多克隆抗體本實(shí)驗(yàn)室保存；辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗人IgE 美國(guó)Gaithersburg MD公司；辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG博奧森公司；胃蛋白酶和胰蛋白酶 美國(guó)Amresco公司；限制性核酸內(nèi)切酶SacⅡ和SmaⅠ、T4 DNA連接酶、蛋白分子質(zhì)量Marker 加拿大Fermentas公司；IProof DNA聚合酶 美國(guó)Bio-Rad公司；DNA Marker 大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取及PCR產(chǎn)物純化試劑盒 安徽優(yōu)晶生物工程有限公司；金屬離子螯合層析介質(zhì)Talon Resin 美國(guó)Clontech公司；引物合成及測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成；重組蛋白的分子質(zhì)量測(cè)定由BGI（華大基因）完成。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Spectra Max M2酶標(biāo)儀 Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎10 kD過敏原基因的序列分析

應(yīng)用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nh.gov/BLAST）在線軟件對(duì)文庫(kù)中獲得的基因序列（登錄號(hào)為JK729379.1）進(jìn)行同源性分析。利用SignalP 3.0 Server（http://www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)編碼的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用ExPASy在線軟件對(duì)其進(jìn)行等電點(diǎn)及分子質(zhì)量預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)的同源性比較采用ClustalX2程序進(jìn)行分析。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)TBAP10的基因設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物GM1-1：5’-GACTCCCCGCGGGGGACAGCCAAAT GAGGTCGAA-3’（下劃線為SacⅡ酶切位點(diǎn)）和下游引物GM1-2：5’-GCGCGCCCCGGGTTACTCGTAA ACCCTAGTACCCATCC-3’（下劃線為SmaⅠ酶切位點(diǎn)）。以質(zhì)粒pTriplEx2-TBAP10為模板，PCR獲得目標(biāo)基因。PCR擴(kuò)增體系為（25 ?L）：5×PCR Buffer 5 ?L，dNTPs（10 mmol/L） 0.5 ?L，上下游引物（10 ?mol/L）各1 ?L，pTriplEx2-TBAP10質(zhì)粒45 ng，IProof DNA聚合酶0.5 U。PCR反應(yīng)條件：96 ℃、2 min，95 ℃、15 s，59 ℃、25 s，72 ℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后進(jìn)行SacⅡ/SmaⅠ雙酶切，質(zhì)粒pET47b采用SacⅡ/SmaⅠ雙酶切，膠回收大片段后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。經(jīng)菌落PCR及雙酶切鑒定的陽性克隆送北京奧科生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pET47b-TBAP10。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pET47b-TBAP10轉(zhuǎn)入BL21 Star（DE3），挑取陽性克隆接種于5 mL（含50 μg/mL Kan）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新的5 mL LB培養(yǎng)基中（含50 μg/mL Kan），37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)6 h，取1 mL菌液，離心收集菌體。同時(shí)，以BL21 Star（DE3）和轉(zhuǎn)入pET47b空載體的BL21 Star（DE3）作為對(duì)照。收集的菌體中加入50 ?L 2×Loading buffer和50 ?L ddH2O，混勻，沸水浴中煮5～10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清用質(zhì)量濃度為12.5 g/100 mL的SDS-PAGE鑒定。目的蛋白的可溶性分析參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

1.2.4 重組蛋白的分離純化及蛋白分子質(zhì)量的測(cè)定

包涵體的純化、復(fù)性和Talon Resin純化參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。將純化的目的蛋白保存在20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl溶液中（質(zhì)量濃度為0.763 mg/mL），送往華大基因測(cè)定蛋白分子質(zhì)量。

1.2.5 重組蛋白免疫活性的鑒定

1.2.5.1 Western blotting鑒定重組蛋白

質(zhì)量濃度為15 g/100 mL的SDS-PAGE分離純化的TBAP10，石墨電極半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜條件為50 mA、50 min。以兔抗苦蕎16 kD多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗。Western blotting的具體操作過程參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.2.5.2 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)重組蛋白的IgE結(jié)合活性

蕎麥過敏患者血清用血清稀釋液（0.1 g/100 mL BSA-PBS，0.05%吐溫-20，pH7.0）稀釋20倍[17]，TBAP10用血清稀釋液稀釋8倍（終質(zhì)量濃度為0.1 ?g/?L），苦蕎蛋白粗提液用血清稀釋液稀釋83倍（終質(zhì)量濃度為0.1 ?g/?L）。

酶標(biāo)板用1 μg/孔苦蕎蛋白粗提液于4 ℃包被過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）（8 mmol/L Na2HPO4?12H2O、1.4 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl）洗板5次，以100 ?L PBS＋1 g/100 mL BSA（含0.05%吐溫-20，pH 7.4）緩沖液37 ℃封閉1h。PBS緩沖液洗板5次，在不同的微孔中分別加入100 ?L稀釋后的過敏患者血清，50 ?L稀釋后的TBAP10與50 ?L稀釋后的過敏患者血清混合液，同時(shí)以50 ?L稀釋后的苦蕎蛋白粗提液與50 ?L稀釋后的過敏患者血清的混合液為對(duì)照，37 ℃孵育1 h。PBS緩沖液洗板5次，每孔加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體（用血清稀釋液稀釋2 000倍）100 ?L，37 ℃孵育3 h。PBS緩沖液洗板5次，加入底物TMB溶液，37 ℃反應(yīng)15 min，立即加入2 mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的光密度值（OD450nm）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。競(jìng)爭(zhēng)抑制率的計(jì)算參照如下公式[18]。

式中：ODIFS為無抑制劑樣品的OD450nm值，即蕎麥過敏患者血清的ODIFS；ODTS為待測(cè)樣品的OD450nm值，即苦蕎蛋白粗提液與蕎麥過敏患者血清的ODTS1或TBAP10與蕎麥過敏患者血清的ODTS2。

1.2.6 重組蛋白的熱穩(wěn)定性分析

取8個(gè)1.5 mL離心管，每管各加入500 ?L純化的TBAP10（蛋白質(zhì)量濃度為0.763 mg/mL），沸水浴持續(xù)保溫，分別在0、5、10、15、20、30、40、60 min時(shí)取樣，12 000 r/min離心15 min，取上清，分別加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮5～10 min，12 000 r/min離心2 min，分別取等量上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離膠質(zhì)量濃度為12.5 g/100 mL。

1.2.7 重組蛋白在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性

模擬胃液（3.2 mg/mL胃蛋白酶，34 mmol/L NaCl， 2 mol/L HCl調(diào)pH值為1.2）參照文獻(xiàn)[19]配制。取9個(gè)1.5 mL離心管，每管加入100 ?L模擬胃液，37 ℃保溫10 min，然后各管中依次加入37 ℃預(yù)熱的目的蛋白溶液100 ?L（蛋白質(zhì)量濃度為0.763 mg/mL），準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為15、30s和2、8、15、30、60、90 min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立刻加入25 ?L 0.168 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。0 s中的樣品是將100 ?L模擬胃液先與25 ?L Na2CO3中和終止反應(yīng)，再加入100 ?L的目的蛋白。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，每管取20 ?L于干凈的1.5 mL離心管中，分別加入5 ?L 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮5～10 min，12000 r/min離心2 min，取20 ?L上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠質(zhì)量濃度為12.5 g/100 mL。

模擬腸液（10 mg/mL胰蛋白酶，50 mmol/L KH2PO4，0.2 mol/L NaOH調(diào)pH值為7.5±0.1）參照文獻(xiàn)[19]配制。取8個(gè)1.5 mL離心管，每管加入100 ?L模擬腸液，37 ℃保溫10 min，然后各管中依次加入37 ℃預(yù)熱的目的蛋白100 ?L（蛋白質(zhì)量濃度為0.763 mg/mL），準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為5、10、15 s和1、2、4、8 min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立刻放入沸水中煮5 min終止反應(yīng)。0 s中的樣品是將100 ?L模擬腸液先在沸水中煮5 min使酶失活，再加入100 ?L的目的蛋白。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，每管取20 ?L于干凈的1.5 mL離心管中，分別加5 ?L 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮5～10 min，12 000 r/min離心2 min，取20 ?L上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠質(zhì)量濃度為12.5 g/100 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎10 kD過敏原的序列分析

圖1 苦蕎10 kD過敏原和與其同源的16 kD過敏原的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Alignment of amino acid sequences between TBAP10 and BALP16

從cDNA文庫(kù)中獲得苦蕎10 kD過敏原ORF為402 bp，編碼133個(gè)氨基酸，在線軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽為N端的19個(gè)氨基酸殘基，成熟蛋白包含114個(gè)氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為14.87 kD，等電點(diǎn)為5.75，其一級(jí)結(jié)構(gòu)與甜蕎8 kD過敏原（Fujino[20]認(rèn)為其是10 kD）的相似度為96%，與苦蕎16 kD過敏原的相似度為53%。應(yīng)用ClustalX2軟件對(duì)苦蕎10 kD過敏原和16 kD過敏原（Fag t2）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖1），結(jié)果顯示二者在一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在部分相同的肽段。

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖 22 TBBAAPP1100基因的PPCCRR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of TBAP10 gene

由圖2可知，瓊脂糖凝膠電泳顯示TBAP10的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約340 bp處為單一條帶，與目的片段大小相符。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET47b-TBAP10經(jīng)SacⅡ和SmaⅠ雙酶切后，產(chǎn)生約340 bp的酶切片段（圖3），與擴(kuò)增的TBAP10基因片段大小相符。測(cè)序顯示其與cDNA文庫(kù)中獲得的序列一致。

圖3 重組質(zhì)粒pET47b-TBAP10的雙酶切鑒定Fig.3 Double digestion of pET47b-TBAP10 with SacⅡ and SmaⅠ

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

圖4 TBAP10誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis for the expression of TBAP10

由圖4的SDS-PAGE結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pET47b-TBAP10的BL21 Star（DE3）菌體樣品在18 kD處多一條蛋白帶。超聲裂解后該蛋白帶僅存在于菌體沉淀中（圖5），說明目的蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性Fig.5 Solublity of target TBAP10 protein

2.4 重組蛋白的分離純化及分子質(zhì)量鑒定

2.4.1 重組蛋白的分離純化

圖6 包涵體蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified protein from inclusion body

由圖6可知，菌體經(jīng)過多次超聲波破碎和洗滌，可除去大量雜蛋白而獲得較高純度的包涵體。純化的包涵體用含有8 mol/L尿素的溶解液溶解，梯度透析除去尿素，離心后的上清經(jīng)鈷離子螯合層析柱純化獲得了SDS-PAGE顯示單一條帶的高度可溶TBAP10（圖7）。

圖7 SDS-PAGE電泳分析鈷柱純化的TBAP10Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant TBAP10 purified by Talon resin

2.4.2 TBAP10蛋白的分子質(zhì)量鑒定

經(jīng)質(zhì)譜鑒定，重組蛋白TBAP10的分子質(zhì)量為14.87 kD，與預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量大小一致。

2.5 重組蛋白免疫活性的鑒定

2.5.1 TBAP10的Western blotting鑒定

用苦蕎16 kD重組過敏原所制備的多克隆抗體對(duì)TBAP10進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示有一條特異性條帶（圖8），說明重組表達(dá)的TBAP10與苦蕎16 kD過敏原的抗體之間存在交叉反應(yīng)，二者具有共同的表位。

圖8 重組蛋白的Western blotting分析Fig.8 Western blotting assays of recombinant protein TBAP10

2.5.2 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)重組蛋白TBAP10的IgE結(jié)合活性

表1 競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)重組蛋白的IgE活性Table 1 Competitive ELISA detection of the IgE binding activity of recombinant TBAP10 protein

表1的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA結(jié)果顯示，重組蛋白與蕎麥過敏患者血清的IgE具有特異結(jié)合的活性，TBAP10的競(jìng)爭(zhēng)性抑制率約為苦蕎蛋白粗提液的49.1%。

2.6 重組蛋白的熱穩(wěn)定性分析

沸水條件下重組TBAP10在15 min內(nèi)保持可溶狀態(tài)，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)上清中目標(biāo)蛋白含量逐漸減少，沸水浴60 min后，由圖9可知，上清中仍可見目的蛋白的存在，表明重組TBAP10具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

圖9 TBAP10沸水浴不同時(shí)間時(shí)上清的SDS-PAGE電泳分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of heat treated TBAP10 protein at different intervals

2.7 重組蛋白在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性

TBAP10在模擬胃液和模擬腸液中處理不同時(shí)間的電泳結(jié)果（圖10）顯示，TBAP10在模擬胃液中較為穩(wěn)定，處理90 min后主帶依然清晰可見，而在模擬腸液中極不穩(wěn)定，處理15 s之后幾乎看不到目標(biāo)蛋白條帶（圖11）。

圖10 SDS-PAGE分析TBAP10在模擬胃液中的穩(wěn)定性Fig.10 SDS-PAGE analysis for TBAP10 stability in simulated gastric fluid

圖11 SDS-PAGE分析TBAP10在模擬腸液中的穩(wěn)定性Fig.11 SDS-PAGE analysis for TBAP10 stability in simulated intestinal fluid

3 討 論

蕎麥過敏是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，2S清蛋白在誘導(dǎo)IgE免疫應(yīng)答過程中起著一定的作用。研究報(bào)道，甜蕎10 kD過敏原屬于2S清蛋白家族，能與IgE特異性的結(jié)合[20]。Jeon等[13]根據(jù)甜蕎10 kD過敏蛋白的基因序列利用PCR技術(shù)克隆了疑似苦蕎10 kD過敏原的基因，證實(shí)其屬于2S清蛋白家族，但缺乏蛋白水平的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究以苦蕎籽粒發(fā)育期cDNA文庫(kù)篩選的苦蕎10 kD過敏蛋白基因?yàn)榛A(chǔ)，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白TBAP10，并對(duì)苦蕎10 kD重組過敏原的過敏活性進(jìn)行了鑒定。Western blotting結(jié)果顯示，重組10 kD過敏蛋白能與苦蕎16 kD過敏原的多克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，原因是苦蕎10 kD過敏原與16 kD過敏原在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有53%的相似度，具有相同的表位；競(jìng)爭(zhēng)性ELISA結(jié)果顯示，重組10 kD過敏原能與IgE結(jié)合，其競(jìng)爭(zhēng)抑制活性約為天然過敏原蛋白混合物的49.1%，原因可能是酶標(biāo)板包被的蛋白為天然過敏原蛋白混合物，這些過敏蛋白均可與重組TBAP10競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過敏患者血清中的IgE，苦蕎10 kD過敏原可能為苦蕎種子中主要的過敏蛋白之一。

大多數(shù)植物過敏蛋白具有高度的穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性和抗蛋白酶水解穩(wěn)定性。Tanaka等[21]證實(shí)甜蕎16 kD過敏原具有抗胃蛋白酶消化的特性，Park等[22]證明了甜蕎9 kD過敏原具有胰蛋白酶抑制劑活性，郭彥飛[16]證明天然苦蕎16 kD過敏原和重組苦蕎16 kD過敏原均具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性及抗胃蛋白酶消化的特性。苦蕎重組10 kD過敏原的熱穩(wěn)定性及在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，重組10 kD過敏原具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性及抗胃蛋白酶水解特性。

本研究中，重組TBAP10用SDS-PAGE法檢測(cè)的分子質(zhì)量為18.4 kD，與理論分子質(zhì)量14.87 kD（含N端的His-tag）存在差異，這與其N端融合的His標(biāo)簽有關(guān)。唐威華等[23]發(fā)現(xiàn)一些融合His-tag蛋白在SDS-PAGE中遷移速度變慢，從而造成分子質(zhì)量測(cè)定值偏大的現(xiàn)象，融合His-tag造成局部高密度的正電荷是蛋白遷移速度變慢的主要原因之一。本研究利用質(zhì)譜對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行了分子質(zhì)量分析，證實(shí)其分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量相同，也進(jìn)一步證實(shí)了上述解釋。

本研究成功實(shí)現(xiàn)了苦蕎10 kD過敏原基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)及包涵體的復(fù)性和純化，為研究該過敏原的結(jié)構(gòu)與功能、脫敏治療疫苗以及培育低敏苦蕎品種提供研究思路。

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Overexpression and Characterization of 10 kD Allergenic Protein in Tartary Buckwheat

CHEN Peng, FENG Xue, WANG Lei, DENG Dan-dan, LI Xue-jun
(College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The 10 kD allergen gene (TBAP10) of tartary buckwheat was obtained from the full-length cDNA library during the seed-filling period, and a prokaryotic recombinant expression vector pET47b inserted with TBAP10 gene (pET47b-TBAP10) was constructed. The target protein TBAP10 was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) as an inclusion body form. After re-folding and purification by cobalt ion chelating affinity chromatography of the isolated inclusion body, allergenic activity, thermal stability and stability in simulated gastrointestinal environment of the purified TBAP10 protein were analyzed. Western blotting revealed the immunogenic cross-reactivity between 16 kD buckwheat allergic protein and Fag t2. Competitive ELISA demonstrated that the recombinant protein had a binding capability to IgE from buckwheat-allergic patients. TBAP10 had strong thermal stability and could withstand boiling water bath for 15 min. Simulated gastrointestinal digestion experiments indicated that the recombinant protein had strong tolerance to pepsin, while it could be totally degraded after trypsin digestion.

overexpression; allergenic protein; immunological properties; simulated gastrointestinal digestion

Q786

A

1002-6630（2014）03-0128-06

10.7506/spkx1002-6630-201403026

2012-12-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30400282；31171606）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（QN2009064）

陳鵬（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶學(xué)。E-mail：pengchen@nwsuaf.edu.cn