微波處理對葡萄糖異構酶性質的影響

胡國洲，張甫生，胡 鵬，陳光靜，武菁菁，闞建全*

（西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

微波處理對葡萄糖異構酶性質的影響

胡國洲，張甫生，胡 鵬，陳光靜，武菁菁，闞建全*

（西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

研究微波處理對葡萄糖異構酶酶活性、穩定性、動力學參數及構象的影響。結果表明：不同微波處理時間和微波處理功率對葡萄糖異構酶的活力都有著不同的影響。在7 0 ℃處理5 min條件下，當微波功率為30 0、400 W時，葡萄糖異構酶的相對酶活力分別增加14.23%、8.42%；而當微波功率為600、800 W時，葡萄糖異構酶的相對酶活力分別降低到95.69%、90.78%；微波處理也對葡萄糖異構酶的最適反應溫度和動力學參數Km和Vmax有影響，但對其最適pH值幾乎沒有影響。紫外和熒光光譜研究表明微波處理將導致葡萄糖異構酶部分去折疊，分子中賴氨酸和色氨酸殘基所處的微環境發生變化，葡萄糖異構酶的三級結構因此可能發生了改變，即微波處理可能通過改變葡萄糖異構酶的構象從而改變酶的性質。

葡萄糖異構酶；微波處理；酶活性；最適反應溫度；最適pH值；構象

葡萄糖異構酶（D-glucose isomerase，GI，EC 5.3.1.5）又稱D-木糖異構酶，能夠催化D-葡萄糖，D-木糖分別轉化成D-果糖和D-木酮糖，已成為食品工業中一種極為重要的酶[1-2]。在高果葡糖漿（high fructose corn syrup，HFCS）的工業化生產中，葡萄糖異構酶催化葡萄糖轉化成果糖，已發展成為一種最成功的商業化酶生產應用實例[3-4]。目前，HFCS作為甜味劑已逐步取代了蔗糖的地位。在同等甜度條件下，HFCS比蔗糖便宜10%～20%，而且人體對果糖的再吸收率低，HF CS產生的熱量也較少[5]。葡萄糖和果 糖的溶解度都比蔗糖高，因此在食品應用中因結晶作用而產生問題較少。HFCS已經廣泛應用于果漿、果凍、冰淇淋、罐裝食品、焙烤食 品、腌制食品、調味醬、粉狀食品等食品中[6]。隨著HFCS在各種飲料中應用與日俱增，許多研究者開始關注以HFCS為甜味劑的飲料消費與肥胖、糖尿病等慢性病的關系[7-8]。葡萄糖異構酶還在以半纖維素工業化生產乙醇應用中引起重視[9]。葡萄糖異構酶在催化葡萄糖轉化成果糖時需要在較高的溫度下進行，這將導致其較快地失活，影響使用壽命和降低經濟效益。因此，葡萄糖異 構酶的酶活力如何方便快捷再生的問題迫切需要解決，但至今還沒有有效的解決方法。

微波輻射是一種清潔、快捷的能量源，已廣泛用于食品工業中。微波輻射可以直接地穿透物質，使物料中的極性分子振動，將電磁場能轉化成熱能[10]，產生熱效應。研究顯示微波的非熱效應可以使S-腺苷高半胱氨酸水解酶[11]、蛋白酶[12]、胰蛋白酶[13]等分子發生生理、生化和功能上的變化，微波處理能夠增強脂肪酶的活性和穩定性[14]。鑒于此，微波處理能否成為葡萄糖異構酶的酶活力方便快捷再生的有效方法，值得期待和探討，但有關微波輻射對葡萄糖異構酶的性質和構象的研究還未見報道。因此，本實驗以葡萄糖異構酶為研究對象，研究微波處理對其活性、穩定性、酶動力學參數及構象的影響，旨在為尋求一種葡萄糖異構酶活力方便快捷再生的方法提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖異構酶（≥10萬U/g） 武漢銀河化工有限公司。

咔唑、半胱氨酸鹽酸鹽、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鎂、高氯酸（均為分析純） 成都科龍試 劑有限公司。

1.2 儀器與設備

M A S-Ⅱ型微波快速制樣系統（工作功率0～1 000 W，工作溫度25～250 ℃） 上海新儀公司；F-2500型熒光分光光度計、V-2450型紫外分光光度計日本島津公司；B-10精密pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FA2004型電子天平 上海精科儀器有限公司；DK-8D型三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖異構酶樣品溶液的制備

稱取500 mg葡萄糖異構酶，將其溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液250 mL容量瓶中，制成2 mg/mL溶液，4 ℃保存。分別量取30 mL葡萄糖異構酶溶液，使用微波制樣系統在200、300、400、600、800 W，控溫70 ℃處理5 min，處理后的酶液置于4 ℃，3 h后檢測其活性，分析不同微波處理功率對葡萄糖異構酶活性的影響。再分別量取30 mL葡萄糖異構酶溶液，使用微波制樣系統在300 W，控溫70 ℃，分別處理0、2、3、5、10、20、30 min，處理后的酶液置于4 ℃，3 h后檢測其活性，分析不同微波處理時間對葡萄糖異構酶活性的影響。

1.3.2 葡萄糖異構酶酶活力測定

采用Dische等[15]半胱氨酸-咔唑法。反應體系為：2 mol/L葡萄糖溶液2.0 mL，0.2 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液2.5 mL，0.02 mol/L MgSO4500 ?L，0.01 mol/L CoCl2200 ?L，500 ?L待測酶液。反應混合液置于70 ℃水浴中，反應30 min后，迅速加入5 mL 0.5 mol/L高氯酸終止反應。取200 ?L反應液適度稀釋后，用半胱氨酸-咔唑法反應，在560 nm波長檢測吸光度，根據果糖標準曲線得到反應混合液中的果糖含量。酶活力單位的定義：在該反應條件下，1 min內轉化生成1 ?mol果糖所需的酶量定義為1個酶活力單位，1 U。

1.3.3 不同微波功率對葡萄糖異構酶活力的影響

固定處理溫度70 ℃和處理時間5 min，檢測微波處理功率為0、200、300、400、600、800 W時的葡萄糖異構酶的活性，以未經過微波處理的酶活力為100%，參照1.3.2節酶活力檢測方法計算各相對酶活力，分析不同功率對葡萄糖異構酶活力的影響。重復實驗3次，求平均值。

1.3.4 微波處理對葡萄糖異構酶的最適溫度與溫度穩定性的影響[16]

經0、300、400、800 W微波處理后的葡萄糖異構酶溶液（10 mL、2 mg/mL）分別置于30～90 ℃的水浴鍋中保溫5 min，再參照1.3.2節檢測酶活力，以最高酶活力為100%，分別計算相對酶活力，分析不同微波處理后葡萄糖異構酶的最適反應溫度。

經0、300、400、800 W微波處理后的葡萄糖異構酶（10 mL、2 mg/mL）分別置于40、75、90 ℃各水浴保溫1 h后，測定其酶活力，以其中最高酶活力為100%計算相對酶活力，分析不同微波處理后葡萄糖異構酶的溫度穩定性。

1.3.5 微波處理對葡萄糖異構酶的最適pH值與pH值穩定性的影響

配制不同pH值（醋酸鹽緩沖液pH 4.0～5.0；檸檬酸鹽緩沖液pH 6.0；磷酸緩沖液pH 7.0～8.0；硼酸緩沖液pH 9.0～10.0）0.2 mol/L的緩沖液，將經過0、300、400、800 W微波處理后的葡萄糖異構酶，在不同pH值的混合液中測定酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力。

用pH值為4.0、7.5、9.0的緩沖液配制質量濃度為2 mg/mL的葡萄糖異構酶酶液，經過0、300、400、800 W的微波處理后，在30 ℃保溫1 h后，參照1.3.2節測定酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力，分析不同微波處理后葡萄糖異構酶的pH值穩定性。

1.3.6 微波處理對葡萄糖異構酶的Km值與Vmax的影響

取2 mg/mL的葡萄糖異構酶經過0、300、400、800 W微波處理后的，檢測一系列葡萄糖濃度（100、300、500、800、1 000、1 500 mmol/L）條件下的酶活力，根據經典的Michaelis-Menten動力學方程，運用Lineweaver-Burk作圖[5]（雙倒數法）得到米氏方程的倒數形式：

式中：V為酶促反應的速率/（mol/（L· min））；S為底物濃度/（mol/L）；Vmax為初始底物濃度最大時得到的最大反應速率/（mol/（L·min））；Km為該反應的米氏常數/（mol/L）。利用上述公式計算不同處理條件下葡萄糖異構酶的Km和Vmax。

1.3.7 微波處理過的葡萄糖異構酶的紫外光譜分析[17]

用0.02 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）配制質量濃度為2 mg/mL葡萄糖異構酶酶液，取30 mL葡萄糖異構酶溶液，使用微波制樣系統在200、300、400、600、800 W，控溫70 ℃處理5 min后，4 ℃冷藏3 h。取3 mL處理后的酶液，采用UV-2450紫外分光光度計在220～340 nm紫外區域掃描，掃描速度為中速，測定時的分辨率為0.2 nm，基線掃描以0.02 mol/L的磷酸緩沖液進行。

1.3.8 微波處理過的葡萄糖異構酶的熒光光譜分析[18]

采用F-2500熒光光度計，取適量1.3.7節處理后的葡萄糖異構酶液，使用激發波長λEx為295 nm，常溫下（2 5±1）℃重復掃描3次，掃描波長λEm范圍為300 ～400 nm，狹縫寬度為5 nm，并以未經過微波處理的葡萄糖異構酶液為對照。

1.4 數據分析

實驗數據運用Excel 2010和OriginPro 8.0進行分析處理和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同微波處理功率對葡萄糖異構酶活力的影響

圖1 不同微波功率下葡萄糖異構酶的相對酶活力Fig.1 Relative residual activities of glucose isomerase treated with different microwave powers

由圖1可知，葡萄糖異構酶在不同功率微波處理后，其酶活力呈先增加后降低的趨勢。在固定溫度為70 ℃和處理時間5 min的條件下，300、400 W的微波處理可使葡萄糖異構酶的相對酶活力分別顯著地增加了14.23%、8.42%（P＜0.05）；而當微波功率為600、800 W時，葡萄糖異構酶的相對酶活力分別降低到95.69%、90.78%。

2.2 不同微波處理時間對葡萄糖異構酶酶活力的影響

圖2 不同微波處理時間下葡萄糖異構酶的相對酶活力Fig.2 Relative residual activities of glucose isomerase treated for different times

由圖2可知，在固定溫度為70 ℃和微波功率為300 W條件下，葡萄糖異構酶的活力隨處理時間的增加而先增加后降低。其中處理時間為3、5 min時，葡萄糖異構酶的相對酶活力分別增加了11.85%、15.45%；當處理時間為10、20、30 min時，葡萄糖異構酶的相對酶活力逐漸降低到97.50%、94.53%、92.27%，但下降趨勢并不顯著（P＞0.05）。

2.3 微波處理對葡萄糖異構酶最適反應溫度和溫度穩定性的影響

溫度是影響葡萄糖異構酶活性的一個重要因素，高溫能夠提高異構化反應速率，還可使葡萄糖-果糖化學平衡向果糖方向移動[19]。在適宜的溫度范圍內，葡萄糖異構酶比較穩定，當偏離最適溫度后，酶就會發生熱變性而導致失活。

圖3 微波處理對葡萄糖異構酶的最適反應溫度影響Fig.3 Temperature-dependent activity profiles of glucose isomerase treated with different microwave powers

由圖3可知，未經微波處理的葡萄糖異構酶的最適反應溫度為70～80 ℃，經過300 W微波處理后的最適反應溫度為70 ℃，經過400、800 W微波處理后的最適反應溫度為75 ℃，這說明微波處理并未明顯改變葡萄糖異構酶的最適反應溫度。但是經過微波處理的葡萄糖異構酶的最適溫度范圍變大，未經微波處理的葡萄糖異構酶在70～90 ℃范圍內其活力保持在85%以上，而經過300 W微波處理后，葡萄糖異構酶活力在65～90 ℃范圍內均在85%以上。

圖4 微波處理對葡萄糖異構酶溫度穩定性的影響Fig.4 Thermal stability of glucose isomerase treated with various microwave powers

由圖4可知，在75 ℃保溫1 h后，與未經微波處理的葡萄糖異構酶相比，300、400、800 W微波處理后的相對酶活力分別為94.76%、99.82%、91.65%，表明在此條件下微波處理并未顯著改變酶的溫度穩定性（P＞0.05）；在35 ℃保溫1 h后，300、400、800 W微波處理后的相對酶活分別為77.08%、73.73%、78.83%，未經微波處理的葡萄糖異構酶相對酶活力為81.13%；經過300、400、800 W微波處理后的葡萄糖異構酶在90 ℃保溫1 h后其相對酶活力均少于40%，明顯低于未微波處理的葡萄糖異構酶的酶活力（P＜0.01）。由此可見，微波處理顯著地降低了葡萄糖異構酶在高溫中的穩定性，但是沒有明顯改變其在最適溫度（75 ℃）的穩定性。微波處理對酶熱穩定性的影響研究不多，僅有Porcelli等[11]使用10.4 GHz微波在90 ℃處理半胱氨酸水解酶40 min后，其相對酶活力只有18%；而用同樣條件對甲硫腺苷磷酸化酶處理后，其酶活力仍有78%。

2.4 微波處理對葡萄糖異構酶最適pH值和pH值穩定性的影響

pH值可影響酶分子活性部位上有關基團的解離及底物的解離狀態，從而影響酶活性中心與底物的結合或催化，而且有關基團解離狀態的改變會影響酶的空間構象，甚至會使酶變性。葡萄糖異構酶的工業化應用中要求弱酸性的環境，以減少褐變反應和相關副產物的形成[3]。

圖5 微波處理對葡萄糖異構酶的最適pH值影響Fig.5 pH-dependent activity profiles of glucose isomerase treated with different microwave powers

由圖5可知，未經微波處理的葡萄糖異構酶的最適pH值為7.0～7.5，經過微波處理并未改變葡萄糖異構酶的最適pH值，仍然為7.0～7.5。

圖6 微波處理對葡萄糖異構酶pH值穩定性影響Fig.6 pH stability of glucose isomerase treated with various microwave powers

由圖6可知，經過300、400、800W的微波處理后的葡萄糖異構酶在pH7.5保溫1h后，其相對酶活分別為97.30%、100%、99.03%，酶活力變化并不顯著（P＞0.05）。在pH 3.0和pH 9.0保溫1 h后，葡萄糖異構酶的相對酶活力變化各不相同，在pH 3.0條件下微波處理后的葡萄糖異構酶的酶活力明顯低于未處理的（P＜0.05），而且葡萄糖異構酶在pH 9.0條件下酶活力明顯比在pH 3.0高（P＜0.01）。

2.5 微波處理對葡萄糖異構酶的Km值和Vmax影響

表1 微波處理對葡萄糖異構酶K和V的影響Table 1 The kinetic parameters of glucose isomerase treated with various microwave powers

表1 微波處理對葡萄糖異構酶K和V的影響Table 1 The kinetic parameters of glucose isomerase treated with various microwave powers

微波功率/W 0 300 400 800 Km/（ mol/L）Vmax/（ mol/（L·min））0.366 1.19×10-30.345 1.75×10-30.337 1.63×10-30.522 1.02×10-3

由表1可知，未經處理的葡萄糖異構酶的Km為0.366 mol/L，最大反應速率Vmax為1.19×10-3mol/（L·min）。經3 0 0 W微波處理后的Km為0.3 4 5，Vmax為1.75×10-3mol/（L· min），經400 W微波處理后的Km為0.337，Vmax為1.63×10-3mol/（L·min），而經800 W微波處理后的葡萄糖異構酶Km為0.522，Vmax為1.02×10-3mol/（L·min）。經過300 W和400 W微波處理后酶的Km變小，說明酶與底物的親和力變大；而經過800 W微波處理后酶的Km增加，說明酶與底物的親和力變小。

2.6 微波處理對葡萄糖異構酶紫外光譜的影響

圖7 微波處理對葡萄糖異構酶的紫外吸收光譜的影響Fig.7 UV absorption spectra of glucose isomerase treated with various microwave powers

由圖7可知，未經微波處理的葡萄糖異構酶的紫外光譜最大吸收峰出現在280 nm波長處，經過300、400 W微波處理后，270～280 nm波長處吸收值迅速增強，最大吸收峰逐漸消失，最大吸收峰位于278 nm波長處。經過400 W微波處理后的葡萄糖異構酶的明顯低于300 W處理后的。而經過800 W微波處理后的，葡萄糖異構酶在280 nm波長處的吸收強度低于未經處理的，最大吸收峰位變化不大。280 nm波長處的紫外吸收變化可以反映氨基酸殘基所處微環境的變化，300、400 W微波處理可能使葡萄糖異構酶的一些生色集團暴露出來，導致紫外吸收增強[20]。而在800 W微波處理后紫外吸收降低的原因可能是微波處理導致酶分子構象的去折疊引起的。張兆琴等[18]報道動態高壓微射流處理后菠蘿蛋白酶構象發生變化，酶分子部分去折疊，其紫外光譜吸收降低。Housaindokht等[21]研究表明十四烷基三甲基溴化銨可使α-乳白蛋白構象伸展導致紫外吸收降低。

2.7 微波處理對葡萄糖異構酶熒光光譜的影響

圖8 微波處理對葡萄糖異構酶的熒光光譜的影響Fig.8 Intrinsic fluorescence spectra of glucose isomerase treated with various microwave powers

由圖8可知，未經微波處理的葡萄糖異構酶的熒光吸收強度峰值位于340 nm波長處。由于300、400 W熒光光譜圖重疊，這里未標出400 W熒光圖譜。300、600、200 W微波處理后的葡萄糖異構酶的熒光強度依次降低，但均高于未經處理的，而經800 W微波處理的葡萄糖異構酶的在340 nm波長處的熒光強度低于未經微波處理的，該結果與紫外吸收光譜是一致的。蛋白質內源性熒光主要是由賴氨酸和色氨酸發射的[22]。Yin等[23]研究發現，強酸或強堿性條件可破壞菜豆蛋白的三級結構，使菜豆蛋白中的疏水集團暴露，熒光強度增加。200、300、600 W微波處理葡萄糖異構酶的熒光光譜變化表明，微波處理使得葡萄糖異構酶中的賴氨酸和色氨酸殘基所處的微環境發生改變，賴氨酸和色氨酸殘基所處位置的三級結構發生改變。800 W微波處理后熒光強度降低，可能也是此原因。

3 結 論

不同功率微波處理對葡萄糖異構酶的相對酶活力、最適反應溫度和動力學參數影響不同，但對最適pH值幾乎沒有影響。紫外和熒光光譜研究表明微波處理導致葡萄糖異構酶部分去折疊，分子中賴氨酸和色氨酸殘基所處的微環境發生變化，葡萄糖異構酶的三級結構可能發生了改變。

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Effect of Microwave Treatment on the Properties of Glucose Isomerase

HU Guo-zhou, ZHANG Fu-sheng, HU Peng, CHEN Guang-jing, WU Jing-jing, KAN Jian-quan*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing Key Laboratory of Product Processing and Storage, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

The effect of microwave treatment on the activity, stability, kinetic parameters and conformation of glucose isomerase (GI) was studied. Results indicated that different periods and power levels of microwave treatment had different effects on GI activity. After microwave treatment at powers of 300 W and 400 W for 5 min at 70 ℃, GI activity was increased by 14.23% and 8.42%, respectively. However, GI retained 95.69% and 90.78% of its original activity at 600 W and 800 W, respectively. The m icrowave treatment also had effects on the optimal reaction temperature and kinetic pa rameters, but had scarce effects on the optimal pH. Moreover, partial unfolding of GI and changes in microenvironment of tryptophan and tyrosine residues were observed from the ultraviolet and fluorescence spectra of microwave-treated GI. Thus we further speculated that the tertiary structure of GI was also disturbed by microwave treatment. As a conclusion, this study demonstrates that microwave treatment can change some properties of GI presumably by changing its conformational structure.

glucose isomerase; microwave treatment; activity; optimal reaction temperature; optimal pH; conformation

Q814.9

A

1002-6630（2014）03-0134-05

10.7506/spkx1002-6630-201403027

2013-02-05

中央高校基本科研業務費專項（XDJK2012B009）；重慶市自然科學基金項目（cstc2012jjA80045）

胡國洲（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：huguozhou.200@163.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養學、食品生物技術。E-mail：ganjq1965@163.com