亞甲基藍對單增李斯特菌菌膜的光動力殺傷作用

李紅愛，唐姝姝，劉永強，鄧 曦，唐書澤,*，吳希陽，陳振強

（1.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；2.廣州皇上皇集團有限公司，廣東 廣州 510240）

亞甲基藍對單增李斯特菌菌膜的光動力殺傷作用

李紅愛1，唐姝姝1，劉永強2，鄧 曦1，唐書澤1,*，吳希陽1，陳振強1

（1.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；2.廣州皇上皇集團有限公司，廣東 廣州 510240）

探討單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）生物菌膜的生長特性及亞甲基藍對LM生物菌膜光動力殺傷作用。通過結晶紫染色法判斷與觀察LM生物菌膜的形成并用酶標儀在595 nm波長處對其不同生長階段的生物量進行測定，同時通過細菌平板菌落計數法研究亞甲基藍對LM生物菌膜的光動力殺傷作用。結果表明：結晶紫染色法可用于定性判斷與觀察LM生物菌膜，且隨著培養時間的延長，LM生物菌膜生物量不斷增加，形成的網狀結構越來越致密。當光敏劑質量濃度為10 μg/mL的亞甲基藍在光功密度為200 mW/cm2的可見光照射30 min時，即可使LM生物菌膜的失活率達到99.99%以上，其菌落數降低了4.08（lg（CFU/mL））。亞甲基藍對LM生物菌膜的光動力滅活作用非常顯著，其殺傷效果主要取決于光敏劑質量濃度和光照時間。

生物菌膜；單增李斯特菌；亞甲基藍；光動力滅菌技術

自然界中各種微生物并非僅以單個的浮游菌（planktonic）存在，主要是以生物菌膜（biofilm，BF）形式生存[1-2]。BF是指細菌在適宜條件下附著于介質表面并不斷增殖形成復雜膜狀結構，主要由吸附的細菌及其分泌的胞外多糖、蛋白質等物質構成的細菌群落[3-4]。相比于浮游狀態的細菌，BF具有更復雜的結構及較強的群體感應（quorum sensing，QS）[5-6]，其對常用滅菌方法（如熱殺菌、生物殺菌劑、輻射殺菌等）有更強的抵抗能力[7-8]且難以被徹底清除[9]。因此，病原微生物一旦在食品加工設備表面吸附、形成BF后，受到加工污染的食品，滅菌將變得更加困難，從而影響食品安全[10]。研究認為，在食品加工環境中形成BF的主要食品致病菌是單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）[10-11]。LM是最重要的食源性致病菌之一，已引發多起食源性疾病[12]，臨床死亡率高達20%～30%[13]。即食肉制品、家禽制品及冷藏冷凍食品極易受LM的污染[14]，導致潛在食物中毒。

光動力滅菌技術（anti-microbial photodynamic technology，APDT）是利用光敏劑對活性細菌的優先聚集特性，在特定波長的光照射激發下，光敏劑吸收能量產生單線態氧、自由基等活性氧物質，再通過氧化作用滅活細菌，而不傷害周圍組織和細胞的殺菌技術[15]。本課題組前期研究已經證實APDT對曲霉孢子[16]、蠟樣芽孢桿菌[17]、金黃色葡萄球菌[18]、沙門氏菌[19]、LM[20]及大腸桿菌O157[21]等浮游菌具有顯著的殺菌效果。

亞甲基藍是一種溶于水中具有陽性電荷的堿性染料，基于其高濃度時仍對人類的低毒性而被廣泛應用于新鮮冷凍血漿中病毒的光滅活研究[22]。本實驗選用LM菌標準菌株ATCC19111作為實驗菌株，對LM生物菌膜的形成過程進行觀察并以亞甲基藍（methylene blue，MB）作為光敏劑，探討MB-APDT對LM生物菌膜的殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

LM標準株ATCC19111 廣州市微生物研究所。

細菌計數培養基、LB肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

亞甲基藍 上海紅綠光敏劑研究所有限公司；結晶紫 天津市科密歐化學試劑開發中心；75 W溴鎢燈（光功密度200 mW/cm2） 北京卓立漢光儀器有 限公司；MK3酶標儀 美國賽默飛世爾；雙目型XSP-2CA顯微鏡 上海團結儀器制造有限公司。

1.3 菌種培養及前處理

將活化的 LM 接種于5 mL胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養基中，37 ℃振蕩培養至對數生長期后期（約12～14 h）；以4 500 r/min離心10 min，棄上清液，重新懸浮菌體于0.1 mol/L、pH 7.4的無菌磷酸緩沖溶液（phosphat buffered saline，PBS）中，調整其 OD600nm值為0.4左右 （約為108CFU/mL）。

1.4 LM生物菌膜形成的判定與檢測

1.4.1 結晶紫染色法觀察LM生物菌膜

在96孔平底板中加入200 μL LB肉湯培養基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）[23]，再加入10 μL已制備的菌懸液，在37 ℃培養48 h，吸出菌懸液，用無菌水洗數次以去除浮游菌；加200 μL 0.5%的結晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出，自然干燥，拍照。同時，做空白對照組（不加菌懸液培養）。

在6孔平底板（放置了18 mm×18 mm的載玻片）中加入5 mL LB肉湯培養基（含0.45 g/100 mL的葡萄糖），再加入50 μL菌懸液，在37 ℃分別培養0、24、48、72 h，小心取出載玻片，用無菌水洗數次以去除浮游菌；用10%甲醇固定10 min，再加0.5%結晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出，自然干燥，置顯微鏡下觀察。同時，做空白對照組（不加菌懸液培養）。

1.4.2 96孔酶標板制備LM生物菌膜及其生物量的測定

取10 μL處理好的菌懸液接種到已加有200 μL LB肉湯培養基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）的96孔平底酶標板中，分別在37 ℃培養0、4、8、12、24、48、72、96、120 h，按如下操作[24]：吸出菌懸液，用無菌水洗數次以去除浮游菌；加 200 μL 0.5%的結晶紫染色5 min，用無菌水洗至無紫色脫出；再用95%乙醇溶解5 min，酶標儀于595 nm波長處測其光密度值。同時，做空白對照組。實驗重復3次，取平均值。用OD595nm值反映生物量的大小。

1.5 APDT對LM生物菌膜的滅活實驗

1.5.1 MB質量濃度對LM生物菌膜失活率和菌落數的影響

取10 μL制備的菌懸液接種到有200 μL LB肉湯培養基（含0.45 g/100 mL葡萄糖）的96孔板中，在37 ℃培養24 h，吸出菌懸液，用無菌水洗數次以去除浮游菌；加入不同質量濃度的MB（0、0.01、0.1、1、10、50 μg/mL），37 ℃避光孵育30 min，將96孔板放置于溴鎢燈光前20 cm處，照射30 min。光照組用L＋表示，同時設置對照組（不光照組：L－）。

1.5.2 光照時間對LM生物菌膜失活率和菌落數的影響

LM生物菌膜處理同1.4.1節，加入1 μg/mL MB，37 ℃避光孵育30 min，將96孔板放置于溴鎢燈光源前20 cm處，分別照射0、5、10、20、30 min。光敏劑組用S＋表示，同時設置對照組（不加光敏劑組：S－）。

1.5.3 細菌平板菌落計數

按照1.4.1、1.4.2節不同方式處理后，將96孔杯放入超聲振蕩儀中，振蕩（2.5×104Hz）30 s，間隔30 s，重復3次，使得生物菌膜完全從96孔杯壁及底部脫落下來，分散于菌懸液中。將所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋，各取100 μL梯度稀釋液涂板于細菌計數培養基平板中，于37 ℃生化培養箱中恒溫培養，48 h后取出進行菌落計數。實驗重復3次，取平均值。

式中：N對照組菌落數/（CFU/mL）；n為實驗組菌落數/（CFU/mL）。

1.6 統計學分析

2 結果與分析

2.1 結晶紫染色法判定LM生物菌膜的形成

圖1A表示在96孔酶標板中培養LM生物菌膜，用結晶紫染色后能清楚地看到被染上紫色的環，即為生物菌膜，無紫色環的孔杯為空白對照組。圖1B～E表示在載玻片上培養且經過結晶紫染色后用顯微鏡觀察的LM生物菌膜照片，其中，圖1B為培養0 h，即空白載玻片觀察到的圖片，無紫色的菌體；圖1C一部分菌株相連且呈較稀疏的網狀結構；圖1D相比培養24 h 的生物菌膜，相連菌株數量明顯增多且網狀結構更密集；圖1D可見大量菌株相連且網狀結構致密。LM生物菌膜結晶紫染色法觀察結果分析發現，從浮游菌到生物菌膜是一個菌體數量由少到多，菌膜結構由簡單到復雜的形成過程，這與已有研究報道結果基本一致，Lizcano等[25]對肺炎鏈球菌BF的形成研究表明，BF形成初期只有薄薄的一層；培養中期菌體數大量增加形成“地毯”；后期BF形成厚厚的融合層，部分菌體聚集成團。

圖1 結晶紫染色法觀察LLMM的生物菌膜Fig.1 Formation of L.monocytogenes biofilms visualized by crystal violet staining

2.2 LM生物菌膜生物量變化

圖 2 LM生物菌膜培養120 h的光密度變化Fig.2 Optical density of L.monocytogenes biofilms during 120 h incubation

由圖2可知，隨著培養時間的增加，光密度不斷上升，即生物菌膜的生物量不斷增加。在最初的8 h，生物量增長速度最快；隨著生物菌膜不斷生成并趨向成熟，生物量增長平穩。這也說明在生物菌膜形成過程中，菌體數量由少到多聚集，與2.1節的分析結果相吻合。

2.3 MB質量濃度對LM生物菌膜光動力滅活作用的影響

由圖3可知，當MB的質量濃度低至0.01 μg/mL時，光照30 min，能夠使LM殺傷效果約為60%；當MB質量濃度為50 μg/mL時，幾乎全部LM生物菌膜都被滅活，菌落數降低約7（lg（CFU/mL））。因此，在相同光照條件下，隨著MB質量濃度的增加，光動力殺菌技術對LM生物菌膜的殺傷作用逐漸增強。而光敏劑對照組和光照對照組均沒有明顯的滅活作用。

圖3 不同質量濃度MB對 LM生物菌膜失活率（A）和菌落數（B）的影響Fig. 3 Effect of MB concentration on inactivation rate (A) and colony counts (B) of L. monocytogenes biofilms

2.4 光照時間對LM生物菌膜APDT滅活作用的影響

圖4 不同光照時間對LM生物菌膜失活率（A）和菌落數（B）的影響Fig.4 Effect of illumination time on inactivation rate (A) and colony counts (B) of L. monocytogenes biofilms

由圖4可知，當MB質量濃度為1 μg/mL時，光照5 min即可使約80%的LM生物菌膜失活；當光照時間為30 min時，可以使LM生物菌膜的失活率達到99.99%。表明當MB質量濃度一定時，APDT對LM生物菌膜的殺傷作用隨著光照時間的延長而增強。

本課題組前期研究[16-21]已經證實APDT對浮游菌具有顯著的殺菌效果。本實驗進一步證實APDT對于結構更復雜、對常用殺菌方法抵抗力更強的生物菌膜也有非常強的滅活作用。但相較于浮游的LM[20]，要達到相同的滅活效果，僅需要MB的質量濃度為0.2 μg/mL，同樣光源下光照10 min。即相對于浮游菌，使LM生物菌膜滅活需要更高濃度的光敏劑和更長的光照時間，也說明生物菌膜更難被消滅與控制。這與Buchovec等[26]的研究結果基本相似，以5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）為光敏劑對LM浮游菌及LM生物菌膜進行光動力滅菌，生物菌膜所需的光敏劑質量濃度比浮游LM使用的質量濃度更高，光照時間更長。

3 結 論

結晶紫染色法可用于定性判斷與檢測單增李斯特菌生物菌膜的形成且能用于觀察其菌膜形成的狀況，此法簡單易行。在一定培養時間內，單增李斯特菌生物菌膜隨著培養時間延長，其生物量不斷增加且菌膜的網狀結構變得更為致密，此結果可用于解釋為什么生物菌膜比浮游菌更難消滅與控制，也為選擇滅活生物菌膜的更佳條件提供依據。光敏劑亞甲基藍質量濃度為10 μg/mL在光功密度為200 mW/cm2的溴鎢燈下光照30 min，可使單增李斯特菌生物菌膜的失活率達到99.99%以上，其菌落數降低了4.08（lg（CFU/mL））。因此，亞甲基藍對單增李斯特菌生物菌膜有非常顯著的光動力滅活作用，其效果主要受光敏劑質量濃度和光照時間的影響。光動力殺菌技術可作為一種有效的非熱生物菌膜滅活技術應用于食品加工設備及食品加工環境中的消毒滅菌。

[1] POULSEN L V. Microbial biofilms in food processing[J]. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 1999, 32: 321-326.

[2] PRAKASH B, VEEREGOWDA B M, KRISHNAPPA G. Biofilms: a survival strategy of bacteria[J]. Current Science, 2003, 85(9): 1299-1307.

[3] MOLOBELA I P, ILUNGA F M. Impact of bacterial biofilms: the importance of quantitative biofi lm studies[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(2): 461-467.

[4] RAMAGE G, VANDE WALLE K, WICKES B L, et al. Characteristics of biofi lm formation by Candida albicans[J]. Revista Iberoamericana de Micologia, 2001, 18(4): 163-170.

[5] RICE S A, KOH K S, QUECK S Y, et al. Biofilm formation and sloughing in Serratia marcescens are controlled by quorum sensing and nutrient[J]. Journal of Bacteriology, 2005, 187(10): 3477-3485.

[6] WILLIAMS P. Quorum sensing, communication and cross-kingdom signaling in the bacterial world[J]. Microbiology-SGM, 2007, 153: 3923-3938.

[7] ANDERSON G G, O’TOOLE G A. Innate and induced resistance mechanisms of bacterial biofi lms[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2008, 322: 85-105.

[8] RAY V A, MORRIS A R, VISICK K L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development[J]. Journal of Visualized Experiments, 2012, 64:e4035. doi: 10.3791/4035.

[9] FUX C A, COSTERTON J W, STEWART P S, et al. Survival strategies of infectious biofi lms[J]. Trends in Microbiology, 2005, 13(1): 34-40.

[10] CHMIELEWSKI R A N, FRANK J F. Biofi lm formation and control in food processing facilities[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2003, 2: 22-32.

[11] REIJ M W, den AANTREKER E D. Recontamination as a source of pathogens in processed foods[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 91(1): 1-11.

[12] GILMOUR M W, GRAHAM M, DOMSELAAR G V, et al. Highthroughput genome sequencing of two Listeria monocytogenes clinical isolates during a large foodborne outbreak[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 120-135.

[13] GOMBAS D E, CHEN Y H, CLAVERO R S, et al. Survey of Listeria monocytogenes in ready-to-eat Foods[J]. Journal of Food Protection, 2003, 66(4): 570-577.

[14] ZHU Meijun, DU Min, CORDRAY J, et al. Control of Listeria monocytogenes contamination in ready-to-eat meat and products[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2005, 4(2): 34-42.

[15] MAISCH T. Anti-microbial photodynamic therapy: useful in the future[J]. Lasers in Medical Science, 2007, 22(2): 83-91.

[16] 李穎, 唐書澤, 任雅清, 等. 光敏化作用對曲霉孢子失活的影響[J].食品與發酵工業, 2008, 34(8): 22-24.

[17] 任雅清, 唐書澤, 吳希陽, 等. 光動力對細菌的殺傷作用研究[J]. 中國調味品, 2008(6): 37-40.

[18] 任雅清, 唐書澤, 吳希陽, 等. 光動力對金黃色葡萄球菌的殺傷作用及其AFM觀察[J]. 食品與發酵工業, 2008, 34(8): 56-59.

[19] 嚴瓊瓊. 血啉甲醚對沙門氏菌的光動力作用及其失活機制研究[D].廣州: 暨南大學, 2010.

[20] LIN Shaoling, HU Jiamiao, TANG Shushu, et al. Photodynamic inactivation of methylene blue and tungsten-halogen lamp light against food pathogen Listeria monocytogenes[J]. Photochemistry and Photobiology, 2012, 88(4): 985-991.

[21] 唐姝姝, 唐書澤, 李紅愛, 等. 亞甲基藍對大腸桿菌O157的光動力殺傷作用及機理[J]. 食品與發酵工業, 2012, 38(7): 25-29.

[22] DETTY M R,GIBSON S L,WAGNER S J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47(16): 3897-3915.

[23] SHEIKN J, HICKS S, DALL’AGNOL M, et al. Roles for fis and yafk in biofilms formation by enteroaggregative Escherichia coli[J]. Molecular Microbiology, 2001, 41(5): 983-997.

[24] DI BONAVENTURA G, PICCOLOMINI R, PALUDI D, et al. Influence of temperature on biofilm formation by Listeria monocytogenes on various food-contact surfaces:relationship with motility and cell surface hydrophobicity[J]. Journal of Applied Microbiology, 2008, 104(6): 1552-1561.

[25] LIZCANO A, CHIN T, SAUER K, et al. Early biofilm formation on microtiter plates is not correlated with the invasive disease potential of Streptococcus pneumonia[J]. Microbial Pathogenesis, 2010, 48: 124-130.

[26] BUCHOVEC I, PASKEVICIUTE E, LUKSIENE Z. Photodynamic inactivation of food pathogen Listeria monocytogenes[J]. Food Technology and Biotechnology, 2010, 48(2): 207-213.

Antimicrobial Photodynamic Activity of Methylene Blue against Listeria monocytogenes Biofilms

LI Hong-ai1, TANG Shu-shu1, LIU Yong-qiang2, DENG Xi1, TANG Shu-ze1,*, WU Xi-yang1, CHEN Zhen-qiang1
(1. College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Guangzhou Huangshanghuang Group Co. Ltd., Guangzhou 510240, China)

The formation of Listeria monocytogenes (LM) biofi lms (BF) and its photodynamic inactivation by methylene blue (MB) were investigated. The LM BF formation process was identifi ed by crystal violet staining, and the amount of biomass was tested with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate reader at 595 nm. The inactivation effect of MB on LM BF was verifi ed by counting colony-forming units (CFU). Res ults indicated that crystal violet staining could be used to visualize and quan tify LM BF. The amount of biomass increased and the formed network structure became more complicated as the incubation time was extended. Over 99.99% of LM BF was inactivated and colony-forming units were reduced by 4.08 (lg(CFU/mL)) after illumination with visible light (power density 200 mW/cm2) for 30 min. LM BF were effectively inactivated by MB, and the effi cacy mainly de pended on the concentration of photosesitizer and illumination time.

biofi lm (BF); Listeria monocytogenes (LM); methylene blue (MB); anti-microbial photodynamic technology (APDT)

TS207.3

A

1002-6630（2014）03-0144-04

10.7506/spkx1002-6630-201403029

2013-01-12

廣東省自然科學基金資助項目（S2012010008479）；廣東省突發公共事件應急技術研究中心專項（[2011]733）

李紅愛（1987—）， 女，碩士研究生，研究方向為食品安全。 E-mail：lha_sunny@hotmail.com

*通信作者：唐書澤（1957—），男， 教授，博士后，研究方向為食品安全。E-mail：tangsz@jnu.edu.cn