釀酒條件對(duì)兩株商業(yè)釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響

張方方，江 璐，劉延琳,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

釀酒條件對(duì)兩株商業(yè)釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響

張方方1，江 璐1，劉延琳1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

研究釀酒條件（氧氣、pH值、溫度、糖和乙醇等）對(duì)兩株商業(yè)釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的影響。結(jié)果顯示：氧氣促進(jìn)酵母β-葡萄糖苷酶的合成，兩株商業(yè)釀酒酵母完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶最適pH值為5.0，最適溫度為60℃，果糖、葡萄糖和蔗糖對(duì)兩株釀酒酵母完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶活性具有輕微抑制作用，乙醇（體積分?jǐn)?shù)2%～20%）促進(jìn)β-葡萄糖苷酶的酶活力。在葡萄酒發(fā)酵過程中，β-葡萄糖苷酶主要存在于完整細(xì)胞和透性化細(xì)胞中，上清液中酶較少。

釀酒酵母；β-葡萄糖苷酶；葡萄汁發(fā)酵

香氣是葡萄酒重要特征之一，葡萄汁、葡萄酒中許多香氣成分（如里那醇、里那醇氧化物、香葉醇、橙花醇、香茅醇、α-萜品醇等）是以糖苷形式存在的。β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是糖苷水解的關(guān)鍵酶[1]，在微生物（如細(xì)菌、酵母和霉菌）中廣泛存在，也存在于植物中，主要用于增強(qiáng)葡萄酒、啤酒和果汁的感官特性，特別是香氣[2-3]。β-葡萄糖苷酶水解糖苷，釋放揮發(fā)性糖苷配基，如萜烯醇，增加葡萄酒香氣。葡萄中含有單糖苷和二糖苷，二糖苷的水解，首先在α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶或β-D-洋芹糖苷酶作用下切斷相應(yīng)二糖苷的糖苷鍵，形成β-D-葡萄糖單糖苷，然后在β-葡萄糖苷酶的作用下釋放揮發(fā)性物質(zhì)[4]。β-葡萄糖苷酶是糖苷水解的關(guān)鍵酶[5]，因此大部分研究主要集中于β-葡萄糖苷酶[2,6-7]。

在葡萄酒釀造過程中，β-葡萄糖苷酶主要來自于葡萄[8]和參與葡萄酒發(fā)酵的微生物（如酵母[9]和乳酸菌[10]），但在釀酒條件下葡萄自身合成的酶幾乎沒有活性。釀酒酵母能合成β-葡萄糖苷酶[11]，但葡萄酒的發(fā)酵是一個(gè)厭氧的過程，因此氧氣影響酵母合成β-葡萄糖苷酶。在葡萄酒發(fā)酵的過程中，pH值、溫度、糖、乙醇等因素同樣影響釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶的活性，研究發(fā)現(xiàn)在這些條件下β-葡萄糖苷酶的酶活低，甚至沒有酶活[12]。目前，對(duì)釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的研究較少[13-15]，尤其在發(fā)酵過程中酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶[16-17]方面。本實(shí)驗(yàn)主要研究不同的釀酒條件對(duì)兩株商業(yè)釀酒酵母RC212和VL1的β-葡萄糖苷酶的影響，以及釀酒過程中酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)釀酒酵母RC212和VL1。

寧夏御馬酒廠霞多麗葡萄汁，含糖量200 g/L、總酸6.88 g/L（酒石酸計(jì)），pH 3.89。

pNPG（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，≥98%（TLC））、咪唑（≥98.5%） 美國Sigma公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、葡萄糖、蔗糖 天津博迪化工股份有限公司；還原態(tài)谷胱甘肽（≥98%）、Triton X-100（試劑級(jí)） 美國Amresco公司；甲苯、乙醇（分析純） 西安三浦化學(xué)試劑有限公司；果糖（分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，pH 5.0；WL固體培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鐵0.002 5 g/L、硫酸錳0.002 5 g/L、溴甲酚綠22 mg/L、瓊脂20 g/L，pH 6.5。培養(yǎng)基滅菌條件：121℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MJPS-250型霉菌培養(yǎng)箱、DHG-9071A鼓風(fēng)干燥箱、DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FRESC017型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；UV1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

取100 μL、－20 ℃保存的菌種接種至5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min活化24 h。活化的菌株接種至含有1/5體積的YPD （pH 5.0）液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為體積分?jǐn)?shù)1%，28 ℃、180 r/min，培養(yǎng)24 h后取樣，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

1.3.2 樣品處理

上清液：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，取0.2 mL上清液，測(cè)定上清液中的酶活力。

完整細(xì)胞：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加入0.2 mL pH 5.0、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖溶液，所得菌液用于測(cè)定完整細(xì)胞的酶活力。

透性化細(xì)胞：取1 mL菌液，10 000×g、4 ℃離心10 min，菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加1 mL 0.075 mol/L pH 7.5咪唑緩沖溶液，迅速加0.05 mL 0.3 mol/L谷胱甘肽，0.01 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% triton X-100，0.05 mL甲苯-乙醇（體積比1∶4），劇烈振蕩5 min，10 000×g、4 ℃離心10 min，得到的菌體用1 mL冷卻無菌水洗2次，加入0.2 mL pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖溶液，用于透性化細(xì)胞酶活力（酵母的胞內(nèi)酶）分析[12]。

細(xì)胞干重：取4 mL菌液，10 000×g離心10 min，用冷卻的無菌水洗2次，105 ℃烘至恒質(zhì)量，分析天平稱質(zhì)量。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶酶活力測(cè)定

分別取0.2 mL上清液、完整細(xì)胞液和透性化細(xì)胞液，加入0.2 mL pNPG（5 mmol/L溶于pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液中），30 ℃水浴反應(yīng)1 h后，加入pH 10.2、0.2 mol/L碳酸鈉緩沖溶液終止反應(yīng)，400 nm波長測(cè)定吸光度[12]。β-葡萄糖苷酶的酶活力單位為在1 h內(nèi)1 mL上清液中反應(yīng)生成對(duì)硝基苯酚量（?mol）或每小時(shí)每毫克干細(xì)胞質(zhì)量中生成的對(duì)硝基苯酚量（?mol），即μmol/(mL·h)和μmol/(mg·h)。

1.3.4 釀酒條件對(duì)完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶的影響

1.3.4.1 氧氣

有氧培養(yǎng)：按1%接種量，將活化的菌株培養(yǎng)液接種至含有1/5體積YPD液體培養(yǎng)基（pH 5.0）的三角瓶，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h；厭氧培養(yǎng)：按相同接種量接種至含有80%體積YPD液體培養(yǎng)基（pH 5.0）的離心管中厭氧靜止培養(yǎng)3 d，分別取樣測(cè)定完整細(xì)胞的酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。

1.3.4.2 pH值

在30 ℃條件下，pH值分別為3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中測(cè)定完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶的酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。

1.3.4.3 溫度

在pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液中，分別在15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 ℃溫度下測(cè)定兩株商業(yè)釀酒酵母完整細(xì)胞的酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。

1.3.4.4 糖

在pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，果糖、葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度分別為0、20、40、80、120、160、200 g/L，30 ℃測(cè)定完整細(xì)胞的酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。

1.3.4.5 乙醇

在pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中，分別加入體積分?jǐn)?shù)0%、2%、4%、8%、12%、16%、20%的乙醇，30 ℃測(cè)定完整細(xì)胞的酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。

1.3.5 葡萄酒微型發(fā)酵

將活化的商業(yè)釀酒酵母RC212、VL1接種至400 mL經(jīng)巴氏殺菌（70 ℃保持20 mim，然后降至室溫，每天一次，連續(xù)3 d）的葡萄汁中，接種量為106cells/mL（血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)），18 ℃靜止發(fā)酵，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中CO2失重、酵母細(xì)胞數(shù)量的變化、酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶（上清液、完整細(xì)胞和透性化細(xì)胞）。CO2失重連續(xù)3 d不變說明發(fā)酵結(jié)束，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次。不同部位酵母的β-葡萄糖苷酶的量表示為每小時(shí)1 mL菌液中反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯酚的?mol數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧氣對(duì)酵母產(chǎn)酶的影響

表1 氧氣對(duì)酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Table 1 Effect of oxygen onβ-glucosidase activity from Saccharomyces cereviissiiaaee

由表1可知，氧氣對(duì)酵母不同部位的β-葡萄糖苷酶的影響不同，氧氣對(duì)上清和透性化細(xì)胞中酶活力有顯著影響。厭氧條件下，RC212與VL1的上清液中酶活分別降低了22.20%和27.89%，透性化細(xì)胞中的酶活分別降低了33.00%和49.07%。而氧氣對(duì)完整細(xì)胞酶活的影響不同，厭氧條件下RC212完整細(xì)胞中酶活增加了32.04%，而對(duì)VL1完整細(xì)胞中酶活的影響不顯著，整體而言，氧氣促進(jìn)酵母產(chǎn)酶。

2.2 pH值對(duì)完整細(xì)胞酶活力的影響

pH值對(duì)完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖1所示，以最高值為100.00%，兩株商業(yè)釀酒酵母的變化趨勢(shì)基本上一致，pH5.0時(shí)酶活力最高，因此最適pH值為5.0。pH值為3.4～4.0時(shí)，RC212完整細(xì)胞的相對(duì)酶活力為31.80%～60.73%，VL1完整細(xì)胞的相對(duì)酶活力為40.08%～69.92%。其他一些研究也證明了低pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力具有抑制作用[18]。

圖1 pH值對(duì)酵母完整細(xì)胞β--葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.1 Effect of pH on β-glucosidase activity in whole cells

2.3 溫度對(duì)完整細(xì)胞酶活力的影響

pH 5.0條件下，不同反應(yīng)溫度（15～70 ℃）對(duì)酶活力的影響結(jié)果如圖2所示，以30 ℃的酶活為100.00%。60 ℃時(shí)，兩株商業(yè)釀酒酵母完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶酶活力最高，RC212與VL1的相對(duì)酶活力分別為275.00%和248.00%；20 ℃時(shí)，RC212與VL1的相對(duì)酶活力分別為43.64%和43.74%。隨著溫度的升高酶活力逐漸升高，溫度超過60 ℃后急劇下降，這種現(xiàn)象可能是由于溫度的升高增加酶的反應(yīng)速度，但溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性從而酶活力迅速降低。

圖2 溫度對(duì)酵母完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on β-glucosidase activity in whole cells

2.4 糖對(duì)完整細(xì)胞酶活力的影響

葡萄汁中的糖（果糖、葡萄糖和蔗糖）對(duì)β-葡萄糖苷酶的酶活抑制現(xiàn)象十分普遍，不僅抑制釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶活力，對(duì)非釀酒酵母、黑曲霉的β-葡萄糖苷酶也有抑制作用[18-20]。果糖、葡萄糖和蔗糖對(duì)酵母完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖3所示，以不添加糖時(shí)酵母的相對(duì)酶活力為100.00%。糖對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強(qiáng)弱稍有不同，葡萄糖抑制作用最強(qiáng)，特別是對(duì)RC212。葡萄汁中葡萄糖和果糖大約各占50%，果糖、葡萄糖和蔗糖含量為120 g/L時(shí)，RC212完整細(xì)胞的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力分別為66.01%、63.25%和66.12%，VL1完整細(xì)胞的相對(duì)酶活力為75.11%、71.02%和74.36%。

圖3 果糖（A）、葡萄糖（B）、蔗糖（C）對(duì)完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3 Effects of fructose (A), glucose (B) and sucrose (C) concentrations on β-glucosidase activity in whole cells

2.5 乙醇對(duì)完整細(xì)胞酶活力的影響

乙醇既能抑制酵母的β-葡萄糖苷酶活性[19]，也能促進(jìn)其活性。乙醇對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響如圖4所示，以不添加乙醇時(shí)β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力為100.00%。乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，RC212和VL1完整細(xì)胞的酶活力分別增加19.39%和25.86%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，RC212和VL1完整細(xì)胞的酶活力分別增加30.33%和23.84%，乙醇對(duì)酶的這種影響對(duì)葡萄酒的釀造有重要意義。乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍在2%～20%時(shí)，VL1完整細(xì)胞的酶活力逐漸升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)在16%時(shí)，酶活力達(dá)到最高，隨后稍有下降，可能是由于乙醇導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的變化，引起酶活性部位的變化，從而降低其活力[20]。乙醇促進(jìn)β-葡萄糖苷酶的活性可能是由于酶固定在酵母的細(xì)胞膜上，酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和酶活部位或酶自身的保護(hù)機(jī)制減少蛋白質(zhì)的解折疊率[21]；β-葡萄糖苷酶具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，乙醇具有親核性，可以作為糖基轉(zhuǎn)移時(shí)的中間受體，導(dǎo)致酶活力的增加[22-23]；較高的乙醇含量可能改變膜透性，使底物與胞內(nèi)酶作用[24]。

2.6 葡萄酒微型發(fā)酵

RC212、VL1分別是紅、白葡萄酒發(fā)酵常用的商業(yè)釀酒酵母，利用二氧化碳的失重監(jiān)測(cè)酵母的發(fā)酵情況，結(jié)果如圖5A所示。這兩株釀酒酵母的發(fā)酵力相似，RC212、VL1分別在17、15 d發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化如圖5B所示，酵母細(xì)胞數(shù)量在3 d后達(dá)到穩(wěn)定期，發(fā)酵末期酵母數(shù)量仍然能保持較高水平。

圖5 葡萄汁發(fā)酵過程中發(fā)酵速率（A）及酵母細(xì)胞數(shù)（B）的變化Fig.5 Fermentation kinetics (A) and yeast population (B) during grape juice fermentation

圖6 葡萄汁發(fā)酵過程中上清液（A）、完整細(xì)胞（B）及透性化細(xì)胞（CC）中β-葡萄糖苷酶酶量的變 化Fig.6 Changes in β-glucosidase activity in supernatant (A), whole cells (B) and permeabilized cells (C) during grape juice fermentation

發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶酶量的變化如圖6所示，兩株酵母β-葡萄糖苷酶的變化趨勢(shì)基本相似，上清液中的酶在發(fā)酵48h時(shí)，達(dá)到產(chǎn)酶高峰（圖6A），RC212與VL1上清中的最大值分別為0.30、0.32 ?mol/（mL·h），隨后明顯下降，完整細(xì)胞（圖6B）和透性化細(xì)胞（圖6C）的產(chǎn)酶高峰分別在發(fā)酵的3 d和5 d，RC212與VLI完整細(xì)胞β-葡萄糖苷酶酶量最高值分別為1.04、1.07 ?mol/（mL·h），透性化細(xì)胞中酶量最高值分別為1.34、1.46 ?mol/（mL·h）。

酶的生物合成與轉(zhuǎn)移和酵母生長期的代謝有密切關(guān)系[25]，代謝旺盛、產(chǎn)酶高、酶轉(zhuǎn)移較快。在酵母的指數(shù)生長期，上清液的β-葡萄糖苷酶酶量達(dá)到最高，這一時(shí)期酵母活動(dòng)旺盛，因此酶的運(yùn)轉(zhuǎn)也較快，發(fā)酵后期，酵母逐漸衰老、產(chǎn)酶降低。發(fā)酵過程中上清液、完整細(xì)胞和透性化細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶到達(dá)峰值的時(shí)期不同，上清液、完整細(xì)胞和透性化細(xì)胞的產(chǎn)酶最高峰逐漸延后。

3 結(jié) 論

在有氧條件下，酵母生長旺盛，氧氣促進(jìn)酵母β-葡萄糖苷酶的合成，在其他研究中，也得到相同的結(jié)論[6,12]。兩株釀酒酵母RC212和VL1的β-葡萄糖苷酶最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃，15～20 ℃時(shí)酵母的酶活較低。較低的pH值抑制酵母的β-葡萄糖苷酶活性，pH值為3.4～4.0時(shí)，RC212的相對(duì)酶活力為31.80%～60.73%，VL1的相對(duì)酶活力為40.08%～69.92%。糖對(duì)β-葡萄糖苷酶的酶活抑制較弱，乙醇促進(jìn)β-葡萄糖苷酶的酶活力。溫度和pH值是限制β-葡萄糖苷酶活性的主要因素。

在葡萄汁發(fā)酵過程中，兩株釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶主要分布在完整細(xì)胞和透性化細(xì)胞中，上清液的酶比較少，透性化細(xì)胞中的酶是胞內(nèi)酶，對(duì)于糖苷的水解不起作用，只有轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面或細(xì)胞外才能起作用。在葡萄汁發(fā)酵的過程中釀酒酵母雖然能合成β-葡萄糖苷酶，但是葡萄酒發(fā)酵過程中氧氣、溫度、pH值、糖和乙醇都影響β-葡萄糖苷酶酶活。本實(shí)驗(yàn)研究了氧氣、溫度、pH值、糖和乙醇對(duì)酵母的β-葡萄糖苷酶活性的影響及發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶的動(dòng)態(tài)變化，但β-葡萄苷酶對(duì)葡萄酒香氣的影響還需要進(jìn)一步研究。

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Effect of Winemaking Conditions on β-Glucosidase Activity from Two Commercial Saccharomyces cerevisiae Strains

ZHANG Fang-fang1, JIANG Lu1, LIU Yan-lin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;
2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-viniculture, Yangling 712100, China)

The present study aimed to investigate the effect of vinification environments such as oxygen, pH, temperature, sugar and ethanol on β-glucosidase activity from two commercial Saccharomyces cerevisiae strains. The results showed that aerobic condition stimulated β-glucosidases biosynthesis. The optimal pH and temperature for β-glucosidase activity from the whole cells of both strains were 5.0 and 60 ℃, respectively. β-Glucosidase activity was slightly inhibited by fructose, glucose and sucrose. An ethanol concentration between 2% and 20% could activate β-glucosidase from the two S. cerevisiae strains. During grape juice fermentation, the enzyme was mostly in both whole cells and permeabilized cells, while the activity in the culture supernatant was low.

Saccharomyces cerevisiae; β-glucosidase; grape juice fermentation

TS261.1

A

1002-6630（2014）03-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201403030

2013-03-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271917）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（22050205）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-30-jg-3）

張方方（1984—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸丫莆⑸铩-mail：zhangfangfang8875@163.com

*通信作者：劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)獒劸莆⑸锛捌咸?葡萄酒學(xué)。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn