適于解淀粉芽孢桿菌BGP20菌體生長的培養基響應面優化

趙延存，李鵬霞，黃開紅*，王毓寧，孫 婭，胡花麗

（江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

適于解淀粉芽孢桿菌BGP20菌體生長的培養基響應面優化

趙延存，李鵬霞，黃開紅*，王毓寧，孫 婭，胡花麗

（江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

為獲得解淀粉芽孢桿菌BGP20的低成本高效菌體生長培養基配方，利用響應面試驗設計和搖瓶發酵對培養基各組分進行優化。根據單因素試驗和Plackett-Burman設計試驗結果確定了豆粕和玉米淀粉為主要因素。以發酵培養液菌體密度為響應值，利用Design-Expert軟件的中心組合試驗設計進行優化，并對預測值進行驗證。結果表明：回歸方程具有很好的擬合性，培養基最優配比為豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素 15 mL/L，獲得BGP20發酵液菌體密度為1.86×109CFU/mL，模型預測最高值為1.985×109CFU/mL，驗證實驗結果為預測值的93.72%，說明該模型對實際生產具有指導意義。

解淀粉芽孢桿菌；發酵培養基；菌體密度；響應面設計；回歸模型

采收后蔬菜特別容易腐爛變質，包括在貯藏、運輸、貨架和消費者保藏期間[1]。植物病原菌是導致采后蔬菜腐敗變質的主要原因，在適宜的條件下迅速引起蔬菜腐爛，并產生各種危害人體健康的有毒物質[1-3]。其中，細菌性軟腐病是引起采后蔬菜腐爛變質的主要病害之一，特別是對采后辣椒和大白菜，病原菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，Ecc）[2,4]。目前，該病害的控制主要依靠化學殺菌劑和抗生素，例如次氯酸鹽、福爾馬林、氯霉素等[4]。近年來，人們對食品安全和環境質量的要求日益提高，化學殺菌劑和抗生素在采后農產品上的使用被嚴格限制或禁止，這就促使研究者開發更加安全的采后果蔬防腐保鮮技術?；谖⑸锏纳锓揽丶夹g被認為是未來果蔬采后保鮮技術發展方向之一[1,5-6]，例如芽孢桿菌（Bacillus species）[7-9]。

在前期研究中，本課題組從土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum）BGP20，該菌對采后蔬菜細菌性軟腐病表現出良好的生防效果[10]。生防菌BGP20主要通過與病原菌Ecc競爭蔬菜傷口的營養和空間，從而阻止病原菌侵染和減緩病害的發展；另外，BGP20產生的次生代謝產物也對Ecc具有較高的拮抗活性[10]。低成本高產發酵培養基的篩選是優良生防菌株能夠在農業生產上大規模應用的前提條件，是建立其工業發酵體系的基礎[11-13]。本研究利用響應面分析方法（response surface methodology，RSM）對解淀粉芽孢桿菌BGP20的發酵培養基組分進行了篩選和優化。

1 材料與方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌BGP20菌株由本研究室分離、鑒定并保存，其16S rRNA和gyrB基因序列已提交GenBank數據庫，序列號分別為JQ734535和JQ734538。

1.2 種子菌的準備

將保存于－80 ℃條件下的甘油BGP20菌種在2YT（蛋白胨17 g/L、NaCl 5 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH 7.0）瓊脂平板上劃線活化，用滅菌牙簽挑取單菌落轉接到裝有50 L 2YT液體培養基的250 L三角瓶內，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養18 h。

1.3 單因素試驗

1.3.1 最優氮源的篩選

以Landy培養基（L-谷氨酸5 g/L、酵母浸膏 1 g/L、L-苯丙氨酸 2 mg/L、葡萄糖 20 g/L、KH2PO41 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L，pH 7.0）為基礎培養。分別使用以下氮源替換Landy培養基中的氮源（L-谷氨酸和酵母浸膏）：NH4Cl 5 g/L、(NH4)2SO45 g/L、酵母浸膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、L-谷氨酸10 g/L、43%豆粕10 g/L。

1.3.2 最優碳源的篩選

以Landy為基礎培養基，分別使用以下碳源替換Landy培養基中的葡萄糖：葡萄糖 10 g/L、蔗糖10 g/L、麥芽糖10 g/L、果糖10 g/L、可溶性淀粉10 g/L、玉米淀粉10 g/L。

1.3.3 不同金屬離子對BGP20搖瓶發酵的影響

基礎培養基：蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖 10 g/L，pH 7.0。分別向基礎培養基中添加FeSO4·7H2O 100 mg/L、CuSO4·5H2O 100 mg/L、MnSO4100 mg/L、ZnSO4·7H2O 100 mg/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、CaCl21 g/L，痕量元素（包含ZnSO4·7H2O 0.14 mg/L、FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L）。

以上培養基的初始pH值均調整為7.0，分別將種子菌液按照體積分數1%的比例接種于裝有25 L已滅菌培養基的150 L三角瓶內。然后，30 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，梯度稀釋，涂布2YT瓊脂平板，30 ℃條件下靜置培養16 h，統計單菌落個數[14]。

BGP20發酵液對病原菌Ecc拮抗活性的測定，按照Zhao等[10]描述的方法進行。

1.4 Plackett-Burman試驗設計

利用Plackett-Burman設計方法對單因素試驗篩選的6種因素的重要性進行評估[15-16]，篩選影響BGP20發酵菌體密度的重要因素，確定培養基的最佳組分。Plackett-Burman試驗設計方案見表1。

表1 利用Plackett-Burman 設計篩選培養基的重要組分Table 1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman dessiiggnn

1.5 最陡爬坡試驗

依據Plackett-Burman試驗獲得的一次擬合方程，確定各重要因素的爬坡方向和步長變化，設計最陡爬坡試驗[16]。

1.6 中心組合設計和響應面分析

基于Plackett-Burman和最陡爬坡試驗確定的重要因子中心點，利用中心組合設計（central composite design，CCD）軟件生成響應面分析試驗方案[17]。

1.7 響應面模型的驗證

按照獲得的二次回歸方程所預測的最佳組分配比配制發酵培養基，通過搖瓶發酵實驗，驗證模型的有效性。另外，在上述發酵條件下，比較BGP20在最優化培養基與Landy和2YT培養基中的生長動態，分別測定各培養基發酵液在24 h和36 h時對病原菌Ecc的拮抗活性。

1.8 數據分析

每個處理包含3個獨立的重復，結果是3個重復實驗的平均值。利用Design-Expert 7.0軟件進行Plackett-Burman試驗和CCD響應面分析[18]。利用SPSS 13.0軟件對單因素試驗和最佳培養基驗證實驗的結果進行統計分析，采用Tukey’s測驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素篩選結果

2.1.1 氮源

表2 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌BGP20發酵液菌體密度和拮抗活性的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on cell growth and antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表2可知，氮源是影響BGP20發酵液菌體密度和拮抗活性的重要因素，特別是對BGP20的發酵液菌體密度。豆粕發酵液菌體密度最大，是對照培養基Landy的5.24倍，順序依次為豆粕＞酵母浸膏＞蛋白胨＞牛肉浸膏＞對照＞(NH4)2SO4＞L-谷氨酸＞NH4Cl。對照產生的拮抗圈最大，其次為蛋白胨和豆粕，其中豆粕為對照的93.7%。各處理BGP20的菌體密度與其拮抗活性不呈正相關。另外，研究發現BGP20在速效有機氮源（酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、L-谷氨酸）培養基中生長24 h時，培養基變的比較黏稠，表明BGP20在該類培養基中產生了大量胞外多糖等次生代謝產物，但是以豆粕為氮源的培養基不黏稠。以上結果表明，胞外多糖等次生代謝產物的大量合成限制了BGP20的增殖。

2.1.2 碳源

表3 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌BGP20發酵液菌體密度和拮抗活性的影響TTaabbllee 33 EEffffeecctt ooff ddiiffffeerreenntt ccaarrbboonn ssoouurrcceess oonn cceellll ggrroowwtthh aanndd antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表3可知，測定的6種碳源中，玉米淀粉的發酵菌體密度最高，但是與對照、可溶性淀粉、葡萄糖和麥芽糖差異不顯著。對照的拮抗活性最高，順序依次為對照＞玉米淀粉、麥芽糖＞葡萄糖、可溶性淀粉＞果糖＞蔗糖，其中，玉米淀粉為對照的94.8%。

2.1.3 不同金屬離子

由表4可知，金屬離子對BGP20的生長影響較大，并且各離子之間存在協同促進作用。與對照相比，MgSO4·7H2O對BGP20菌體生長速度的促進作用最大，其次是NaCl；痕量元素和KH2PO4與對照相比差異不顯著；但是，其他金屬鹽對BGP20的生長具有顯著抑制作用。與BGP20的生物量相比，金屬鹽對發酵液拮抗活性的影響相對較小，僅NaCl顯著優于對照，痕量元素、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CuSO4·5H2O、MnSO4和CaCl2與對照差異不顯著。綜合考慮菌體密度和拮抗活性，MgSO4·7H2O、NaCl、痕量元素和KH2PO4對BGP20的發酵都有正向效應。

表4 不同金屬離子對解淀粉芽孢桿菌BGP20發酵液菌體密度及拮抗活性的影響Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

表4 不同金屬離子對解淀粉芽孢桿菌BGP20發酵液菌體密度及拮抗活性的影響Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

注：對照培養基為蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

金屬離子 菌體產量/（107CFU/mL） 拮抗圈直徑/mm對照 20.2±2.5de 11.0±0.5cdeFeSO4·7H2O 1.4±0.2ab 10.1±0.6abCuSO4·5H2O 1.0±0.1a 10.8±0.6bcdMnSO4 1.6±0.0b 10.7±0.5bcZnSO4·7H2O 1.6±0.1b 9.4±0.4aMgSO4·7H2O 29.2±1.2f 11.7±0.5deKH2PO4 20.1±1.8d 11.2±0.4cdeNaCl 28.2±1.1f 12.0±0.5fCaCl2 5.5±0.8c 10.6±0.6bc痕量元素 23.5±1.4def 11.8±0.3ef

2.2 利用Plackett-Burman設計篩選關鍵培養基組分

表5 Plackett-Burman試驗設計及其結果Table 5 Plackett-Burman design and corresponding results

Plackett-Burman試驗結果見表5，每一行代表一個試驗，每一列代表一個變量。利用Design-Expert軟件對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析（表6），6種組分中，只有豆粕和玉米淀粉的添加量顯著影響了BGP20的發酵液菌體密度（P＜0.05），P值分別為0.000 4和0.010 2，其他因素的影響都沒有達到顯著水平（P＞0.05）。在實驗設定變量范圍內，豆粕呈現正效應（β1= 1.628×108），玉米淀粉呈現負效應（β2= －7.722×107）。

表6 Plackett-Burman篩選試驗的方差分析Table 6 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

利用Design-Expert軟件進行回歸分析，獲得各因素對BGP20發酵菌體密度影響的一次回歸方程：

方程的F和P值分別為15.44和0.004 3，表明回歸方程式（1）是顯著的（P＜0.01）。R2=0.948 8，表明這個方程能夠解釋變量響應值的94.88%。R2Adj高達0.887 3，表明這個方程的擬合程度較好。以上結果表明，回歸方程式（1）為Plackett-Burman設計試驗提供了一個合適的模型。

2.3 最陡爬坡試驗結果

根據回歸方程式（1）中豆粕和玉米淀粉的變量系數（1.628×108和－7.722×107）可知，兩者的比值接近1∶（－0.5），即豆粕每增加1 g/L，玉米淀粉就降低0.5 g/L。培養基中MgSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4和痕量元素的含量選定為中心水平，依次為0.75 g/L、1.25 g/L、0.75 g/L和15 mL/L。最陡爬坡試驗設計及結果見表7，結果表明，豆粕和玉米淀粉分別為15 g/L和6 g/L時菌體密度最大，因此，選擇該組配比為下一步中心組合試驗的中心點。

表7 最陡爬坡試驗設計及結果Table 7 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 中心組合試驗和響應面分析

2.4.1 二次多項式回歸模型的建立

根據爬坡試驗獲得的中心點進行中心組合試驗設計，結果見表8。利用Design-Expert軟件對試驗結果進行方差分析（表9），結果表明X1、X12和X22項呈極顯著水平（P＜0.01），P值依次為＜0.000 1、＜0.000 1、0.002 2；X2和X1X2項呈顯著水平（P＜0.05），P值分別為0.046 8和0.041 5。利用Design-Expert軟件進行回歸分析，獲得豆粕和玉米淀粉對BGP20發酵菌體密度影響的二次回歸方程：

方程的F = 54.79和P＜0.000 1，表明回歸方程式（2）是顯著的（P＜0.01）。R2=0.975 1，表明這個方程能夠解釋變量響應值的97.51%。R2Adj高達0.863 2，表明這個方程的擬合程度較好。失擬項的F和P值分別為3.23和0.143 6，不顯著（P＞0.05）。以上結果表明，回歸方程（式（2））為這個中心組合試驗提供了一個合適的模型。

表8 中心組合設計及試驗結果Table 8 Central composition design and corresponding results

表9 中心組合試驗的方差分析Table 9 Analysis of variance for the experimental results of central composition dessiiggnn

2.4.2 響應面分析

圖1 豆粕和玉米淀粉對于BGP20菌體發酵密度的響應面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of defatted soy flour and cornstarch on cell growth of BGP20

基于中心組合試驗結果，獲得響應面模型的三維圖和等高線圖。由圖1可知，在實驗設置的變量范圍內有一個最高點，即BGP20發酵液菌體密度有最大響應值。當豆粕的添加量為16.03 g/L，玉米淀粉添加量為6.30 g/L時，BGP20發酵液菌體密度達到最大預測響應值1.985×109CFU/mL。

2.5 預測模型的搖瓶發酵驗證

圖2 BGP20在3種不同培養基中的生長動態（A）及拮抗活性（B）Fig.2 Growth dynamics (A) and antagonistic activity (B) of BGP20 in three different media

為了驗證獲得的二次多項式模型（2），選擇模型預測最高點的培養基組分（豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，pH 7.0）進行搖瓶發酵驗證。Landy和2YT培養基是培養芽孢桿菌的常用培養[10,19]，將上述最優配比培養基與這兩種培養基的發酵效果進行比較，結果見圖2。利用最優配比培養基發酵24 h時的BGP20菌體密度為1.86×109CFU/mL，是模型（2）預測值的93.72%，與預測值基本吻合。在發酵12 h以后，最優配比培養基的BGP20菌體生長速度明顯高于Landy和2YT培養基，在36 h時達到最高值（2.55×109CFU/mL），分別為Landy和2YT培養基的4.73倍和2.82倍（圖2A）。在搖菌發酵的中后期，Landy和2YT培養基變得比較黏稠，說明BGP20產生了大量胞外多糖等次生代謝產物，這些次生代謝產物可能導致了BGP20增殖緩慢或停止；但是，最優配比培養基不利于胞外多糖等次生代謝產物的產生，BGP20可以持續的增殖，并達到較高的發酵菌體密度。另外，3種培養基發酵液的拮抗活性在11.5～12.7 mm，其間差異不顯著（圖2B）。

3 結 論

首先，在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman設計試驗確定了BGP20發酵培養基的組分，其中豆粕和玉米淀粉是關鍵因子；其次，根據最陡爬坡試驗確定了關鍵因子中心點和步長，利用Design-Expert軟件對中心組合試驗的結果進行分析，建立了BGP20發酵培養的模型：= 1.951×109＋2.266×108X1＋ 6.752×107X2－9.875×107X1X2－4.120×108X12－1.413×108X22。分析發現該回歸方程在實驗測定范圍內有最大值，即得到了BGP20發酵培養基的最優配比：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，此培養基組分的BGP20發酵液菌體密度預測值為1.985×109CFU/mL；最后，對最優配比組分進行驗證，獲得的BGP20發酵液菌體密度為1.86×109CFU/mL，是預測值的93.72%，兩者基本吻合，說明模型是可行的。并且，最優配比培養基顯著優于Landy和2YT培養基。

另外，本研究發現速效有機氮源有利于BGP20的早期生長，但是在中后期BGP20大量合成胞外多糖等次生代謝產物，增殖速度受到限制。緩釋氮源豆粕培養基產生較少的胞外多糖等次生代謝產物，有利于BGP20的持續增殖，并最終達到一個較高的發酵菌體密度。各種碳源對BGP20發酵液菌體密度影響相對較少，但是過高的玉米淀粉含量也導致BGP20在發酵的中后期產生大量胞外多糖等次生代謝產物，不利于其增殖。本研究還發現痕量元素的添加能夠顯著提高BGP20發酵液菌體密度。

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Response Surface Optimization of Medium Components for Cell Growth of Bacillus amyloliquefaciens BGP20

ZHAO Yan-cun, LI Peng-xia, HUANG Kai-hong*, WANG Yu-ning, SUN Ya, HU Hua-li
(Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A cost-effective culture medium for shake flask fermentation of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BGP20 was developed by optimizing the medium components using response surface methodology. First, based on the results of univariate analysis and Plackett-Burman design experiments, defatted soy flour and cornstarch were identified as two key medium components. Then a central composite design was applied to fit the relationship between these two components and optimal levels of BGP20 cell growth. The results showed that the regression model had a high fitting degree. The optimal medium components were 16.03 g/L defatted soy flour, 6.30 g/L cornstarch, 0.75 g/L MgSO4·7H2O, 1.25 g/L NaCl, 0.75 g/L KH2PO4and 15 mL/L trace elements. The maximum predicted value from the regression model was 1.985 × 109CFU/mL, and the actual value observed in validation experiments was 93.72% as compared to the predicted value. These results demonstrate that the regression model is of great guiding significance for commercial fermentation of BGP20.

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum; fermentation medium; cell concentration; response surface methodology; regression model

S476.8；TQ920

A

1002-6630（2014）03-0157-06

10.7506/spkx1002-6630-201403032

2012-12-19

2011年度第二批“江蘇省博士后科研資助計劃”項目；江蘇省農業科學院博士后基金項目（6511106）；江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（12）3081）

趙延存（1976—），男，助理研究員，博士后，研究方向為果蔬貯藏與保鮮。E-mail：zhaoyc27@126.com

*通信作者：黃開紅（1955—），男，研究員，碩士，研究方向為農產品貯藏與加工。E-mail：jaashuang@hotmail.com