適于解淀粉芽孢桿菌BGP20菌體生長的培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

趙延存，李鵬霞，黃開紅*，王毓寧，孫 婭，胡花麗

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

適于解淀粉芽孢桿菌BGP20菌體生長的培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

趙延存，李鵬霞，黃開紅*，王毓寧，孫 婭，胡花麗

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

為獲得解淀粉芽孢桿菌BGP20的低成本高效菌體生長培養(yǎng)基配方，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和搖瓶發(fā)酵對(duì)培養(yǎng)基各組分進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果確定了豆粕和玉米淀粉為主要因素。以發(fā)酵培養(yǎng)液菌體密度為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：回歸方程具有很好的擬合性，培養(yǎng)基最優(yōu)配比為豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素 15 mL/L，獲得BGP20發(fā)酵液菌體密度為1.86×109CFU/mL，模型預(yù)測(cè)最高值為1.985×109CFU/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為預(yù)測(cè)值的93.72%，說明該模型對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

解淀粉芽孢桿菌；發(fā)酵培養(yǎng)基；菌體密度；響應(yīng)面設(shè)計(jì)；回歸模型

采收后蔬菜特別容易腐爛變質(zhì)，包括在貯藏、運(yùn)輸、貨架和消費(fèi)者保藏期間[1]。植物病原菌是導(dǎo)致采后蔬菜腐敗變質(zhì)的主要原因，在適宜的條件下迅速引起蔬菜腐爛，并產(chǎn)生各種危害人體健康的有毒物質(zhì)[1-3]。其中，細(xì)菌性軟腐病是引起采后蔬菜腐爛變質(zhì)的主要病害之一，特別是對(duì)采后辣椒和大白菜，病原菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，Ecc）[2,4]。目前，該病害的控制主要依靠化學(xué)殺菌劑和抗生素，例如次氯酸鹽、福爾馬林、氯霉素等[4]。近年來，人們對(duì)食品安全和環(huán)境質(zhì)量的要求日益提高，化學(xué)殺菌劑和抗生素在采后農(nóng)產(chǎn)品上的使用被嚴(yán)格限制或禁止，這就促使研究者開發(fā)更加安全的采后果蔬防腐保鮮技術(shù)?；谖⑸锏纳锓揽丶夹g(shù)被認(rèn)為是未來果蔬采后保鮮技術(shù)發(fā)展方向之一[1,5-6]，例如芽孢桿菌（Bacillus species）[7-9]。

在前期研究中，本課題組從土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum）BGP20，該菌對(duì)采后蔬菜細(xì)菌性軟腐病表現(xiàn)出良好的生防效果[10]。生防菌BGP20主要通過與病原菌Ecc競(jìng)爭(zhēng)蔬菜傷口的營養(yǎng)和空間，從而阻止病原菌侵染和減緩病害的發(fā)展；另外，BGP20產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物也對(duì)Ecc具有較高的拮抗活性[10]。低成本高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選是優(yōu)良生防菌株能夠在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的前提條件，是建立其工業(yè)發(fā)酵體系的基礎(chǔ)[11-13]。本研究利用響應(yīng)面分析方法（response surface methodology，RSM）對(duì)解淀粉芽孢桿菌BGP20的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌BGP20菌株由本研究室分離、鑒定并保存，其16S rRNA和gyrB基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)分別為JQ734535和JQ734538。

1.2 種子菌的準(zhǔn)備

將保存于－80 ℃條件下的甘油BGP20菌種在2YT（蛋白胨17 g/L、NaCl 5 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH 7.0）瓊脂平板上劃線活化，用滅菌牙簽挑取單菌落轉(zhuǎn)接到裝有50 L 2YT液體培養(yǎng)基的250 L三角瓶?jī)?nèi)，在30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 最優(yōu)氮源的篩選

以Landy培養(yǎng)基（L-谷氨酸5 g/L、酵母浸膏 1 g/L、L-苯丙氨酸 2 mg/L、葡萄糖 20 g/L、KH2PO41 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L，pH 7.0）為基礎(chǔ)培養(yǎng)。分別使用以下氮源替換Landy培養(yǎng)基中的氮源（L-谷氨酸和酵母浸膏）：NH4Cl 5 g/L、(NH4)2SO45 g/L、酵母浸膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、L-谷氨酸10 g/L、43%豆粕10 g/L。

1.3.2 最優(yōu)碳源的篩選

以Landy為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別使用以下碳源替換Landy培養(yǎng)基中的葡萄糖：葡萄糖 10 g/L、蔗糖10 g/L、麥芽糖10 g/L、果糖10 g/L、可溶性淀粉10 g/L、玉米淀粉10 g/L。

1.3.3 不同金屬離子對(duì)BGP20搖瓶發(fā)酵的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖 10 g/L，pH 7.0。分別向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加FeSO4·7H2O 100 mg/L、CuSO4·5H2O 100 mg/L、MnSO4100 mg/L、ZnSO4·7H2O 100 mg/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、CaCl21 g/L，痕量元素（包含ZnSO4·7H2O 0.14 mg/L、FeSO4·7H2O 0.15 mg/L、CuSO4·5H2O 0.16 mg/L、MnSO45 mg/L）。

以上培養(yǎng)基的初始pH值均調(diào)整為7.0，分別將種子菌液按照體積分?jǐn)?shù)1%的比例接種于裝有25 L已滅菌培養(yǎng)基的150 L三角瓶?jī)?nèi)。然后，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，梯度稀釋，涂布2YT瓊脂平板，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 h，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)[14]。

BGP20發(fā)酵液對(duì)病原菌Ecc拮抗活性的測(cè)定，按照Zhao等[10]描述的方法進(jìn)行。

1.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法對(duì)單因素試驗(yàn)篩選的6種因素的重要性進(jìn)行評(píng)估[15-16]，篩選影響B(tài)GP20發(fā)酵菌體密度的重要因素，確定培養(yǎng)基的最佳組分。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選培養(yǎng)基的重要組分Table 1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman dessiiggnn

1.5 最陡爬坡試驗(yàn)

依據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)獲得的一次擬合方程，確定各重要因素的爬坡方向和步長變化，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)[16]。

1.6 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析

基于Plackett-Burman和最陡爬坡試驗(yàn)確定的重要因子中心點(diǎn)，利用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）軟件生成響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案[17]。

1.7 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證

按照獲得的二次回歸方程所預(yù)測(cè)的最佳組分配比配制發(fā)酵培養(yǎng)基，通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證模型的有效性。另外，在上述發(fā)酵條件下，比較BGP20在最優(yōu)化培養(yǎng)基與Landy和2YT培養(yǎng)基中的生長動(dòng)態(tài)，分別測(cè)定各培養(yǎng)基發(fā)酵液在24 h和36 h時(shí)對(duì)病原菌Ecc的拮抗活性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理包含3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)，結(jié)果是3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和CCD響應(yīng)面分析[18]。利用SPSS 13.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)和最佳培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey’s測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素篩選結(jié)果

2.1.1 氮源

表2 不同氮源對(duì)解淀粉芽孢桿菌BGP20發(fā)酵液菌體密度和拮抗活性的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on cell growth and antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表2可知，氮源是影響B(tài)GP20發(fā)酵液菌體密度和拮抗活性的重要因素，特別是對(duì)BGP20的發(fā)酵液菌體密度。豆粕發(fā)酵液菌體密度最大，是對(duì)照培養(yǎng)基Landy的5.24倍，順序依次為豆粕＞酵母浸膏＞蛋白胨＞牛肉浸膏＞對(duì)照＞(NH4)2SO4＞L-谷氨酸＞NH4Cl。對(duì)照產(chǎn)生的拮抗圈最大，其次為蛋白胨和豆粕，其中豆粕為對(duì)照的93.7%。各處理BGP20的菌體密度與其拮抗活性不呈正相關(guān)。另外，研究發(fā)現(xiàn)BGP20在速效有機(jī)氮源（酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、L-谷氨酸）培養(yǎng)基中生長24 h時(shí)，培養(yǎng)基變的比較黏稠，表明BGP20在該類培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大量胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，但是以豆粕為氮源的培養(yǎng)基不黏稠。以上結(jié)果表明，胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物的大量合成限制了BGP20的增殖。

2.1.2 碳源

表3 不同碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌BGP20發(fā)酵液菌體密度和拮抗活性的影響TTaabbllee 33 EEffffeecctt ooff ddiiffffeerreenntt ccaarrbboonn ssoouurrcceess oonn cceellll ggrroowwtthh aanndd antagonistic activity of B. amyloliquefaciens BGP20

由表3可知，測(cè)定的6種碳源中，玉米淀粉的發(fā)酵菌體密度最高，但是與對(duì)照、可溶性淀粉、葡萄糖和麥芽糖差異不顯著。對(duì)照的拮抗活性最高，順序依次為對(duì)照＞玉米淀粉、麥芽糖＞葡萄糖、可溶性淀粉＞果糖＞蔗糖，其中，玉米淀粉為對(duì)照的94.8%。

2.1.3 不同金屬離子

由表4可知，金屬離子對(duì)BGP20的生長影響較大，并且各離子之間存在協(xié)同促進(jìn)作用。與對(duì)照相比，MgSO4·7H2O對(duì)BGP20菌體生長速度的促進(jìn)作用最大，其次是NaCl；痕量元素和KH2PO4與對(duì)照相比差異不顯著；但是，其他金屬鹽對(duì)BGP20的生長具有顯著抑制作用。與BGP20的生物量相比，金屬鹽對(duì)發(fā)酵液拮抗活性的影響相對(duì)較小，僅NaCl顯著優(yōu)于對(duì)照，痕量元素、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CuSO4·5H2O、MnSO4和CaCl2與對(duì)照差異不顯著。綜合考慮菌體密度和拮抗活性，MgSO4·7H2O、NaCl、痕量元素和KH2PO4對(duì)BGP20的發(fā)酵都有正向效應(yīng)。

表4 不同金屬離子對(duì)解淀粉芽孢桿菌BGP20發(fā)酵液菌體密度及拮抗活性的影響Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

表4 不同金屬離子對(duì)解淀粉芽孢桿菌BGP20發(fā)酵液菌體密度及拮抗活性的影響Table 4 Effect of different metal ions on cell growth and antagonistic activityy ooff B. amyloliquefaciens

注：對(duì)照培養(yǎng)基為蛋白胨5 g/L、酵母浸膏5 g/L、葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

金屬離子 菌體產(chǎn)量/（107CFU/mL） 拮抗圈直徑/mm對(duì)照 20.2±2.5de 11.0±0.5cdeFeSO4·7H2O 1.4±0.2ab 10.1±0.6abCuSO4·5H2O 1.0±0.1a 10.8±0.6bcdMnSO4 1.6±0.0b 10.7±0.5bcZnSO4·7H2O 1.6±0.1b 9.4±0.4aMgSO4·7H2O 29.2±1.2f 11.7±0.5deKH2PO4 20.1±1.8d 11.2±0.4cdeNaCl 28.2±1.1f 12.0±0.5fCaCl2 5.5±0.8c 10.6±0.6bc痕量元素 23.5±1.4def 11.8±0.3ef

2.2 利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵培養(yǎng)基組分

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 5 Plackett-Burman design and corresponding results

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表5，每一行代表一個(gè)試驗(yàn)，每一列代表一個(gè)變量。利用Design-Expert軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表6），6種組分中，只有豆粕和玉米淀粉的添加量顯著影響了BGP20的發(fā)酵液菌體密度（P＜0.05），P值分別為0.000 4和0.010 2，其他因素的影響都沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定變量范圍內(nèi)，豆粕呈現(xiàn)正效應(yīng)（β1= 1.628×108），玉米淀粉呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)（β2= －7.722×107）。

表6 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)的方差分析Table 6 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman design

利用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析，獲得各因素對(duì)BGP20發(fā)酵菌體密度影響的一次回歸方程：

方程的F和P值分別為15.44和0.004 3，表明回歸方程式（1）是顯著的（P＜0.01）。R2=0.948 8，表明這個(gè)方程能夠解釋變量響應(yīng)值的94.88%。R2Adj高達(dá)0.887 3，表明這個(gè)方程的擬合程度較好。以上結(jié)果表明，回歸方程式（1）為Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)提供了一個(gè)合適的模型。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)回歸方程式（1）中豆粕和玉米淀粉的變量系數(shù)（1.628×108和－7.722×107）可知，兩者的比值接近1∶（－0.5），即豆粕每增加1 g/L，玉米淀粉就降低0.5 g/L。培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O、NaCl、KH2PO4和痕量元素的含量選定為中心水平，依次為0.75 g/L、1.25 g/L、0.75 g/L和15 mL/L。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7，結(jié)果表明，豆粕和玉米淀粉分別為15 g/L和6 g/L時(shí)菌體密度最大，因此，選擇該組配比為下一步中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析

2.4.1 二次多項(xiàng)式回歸模型的建立

根據(jù)爬坡試驗(yàn)獲得的中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表8。利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表9），結(jié)果表明X1、X12和X22項(xiàng)呈極顯著水平（P＜0.01），P值依次為＜0.000 1、＜0.000 1、0.002 2；X2和X1X2項(xiàng)呈顯著水平（P＜0.05），P值分別為0.046 8和0.041 5。利用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析，獲得豆粕和玉米淀粉對(duì)BGP20發(fā)酵菌體密度影響的二次回歸方程：

方程的F = 54.79和P＜0.000 1，表明回歸方程式（2）是顯著的（P＜0.01）。R2=0.975 1，表明這個(gè)方程能夠解釋變量響應(yīng)值的97.51%。R2Adj高達(dá)0.863 2，表明這個(gè)方程的擬合程度較好。失擬項(xiàng)的F和P值分別為3.23和0.143 6，不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，回歸方程（式（2））為這個(gè)中心組合試驗(yàn)提供了一個(gè)合適的模型。

表8 中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Central composition design and corresponding results

表9 中心組合試驗(yàn)的方差分析Table 9 Analysis of variance for the experimental results of central composition dessiiggnn

2.4.2 響應(yīng)面分析

圖1 豆粕和玉米淀粉對(duì)于BGP20菌體發(fā)酵密度的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of defatted soy flour and cornstarch on cell growth of BGP20

基于中心組合試驗(yàn)結(jié)果，獲得響應(yīng)面模型的三維圖和等高線圖。由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的變量范圍內(nèi)有一個(gè)最高點(diǎn)，即BGP20發(fā)酵液菌體密度有最大響應(yīng)值。當(dāng)豆粕的添加量為16.03 g/L，玉米淀粉添加量為6.30 g/L時(shí)，BGP20發(fā)酵液菌體密度達(dá)到最大預(yù)測(cè)響應(yīng)值1.985×109CFU/mL。

2.5 預(yù)測(cè)模型的搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

圖2 BGP20在3種不同培養(yǎng)基中的生長動(dòng)態(tài)（A）及拮抗活性（B）Fig.2 Growth dynamics (A) and antagonistic activity (B) of BGP20 in three different media

為了驗(yàn)證獲得的二次多項(xiàng)式模型（2），選擇模型預(yù)測(cè)最高點(diǎn)的培養(yǎng)基組分（豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，pH 7.0）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。Landy和2YT培養(yǎng)基是培養(yǎng)芽孢桿菌的常用培養(yǎng)[10,19]，將上述最優(yōu)配比培養(yǎng)基與這兩種培養(yǎng)基的發(fā)酵效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。利用最優(yōu)配比培養(yǎng)基發(fā)酵24 h時(shí)的BGP20菌體密度為1.86×109CFU/mL，是模型（2）預(yù)測(cè)值的93.72%，與預(yù)測(cè)值基本吻合。在發(fā)酵12 h以后，最優(yōu)配比培養(yǎng)基的BGP20菌體生長速度明顯高于Landy和2YT培養(yǎng)基，在36 h時(shí)達(dá)到最高值（2.55×109CFU/mL），分別為Landy和2YT培養(yǎng)基的4.73倍和2.82倍（圖2A）。在搖菌發(fā)酵的中后期，Landy和2YT培養(yǎng)基變得比較黏稠，說明BGP20產(chǎn)生了大量胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物可能導(dǎo)致了BGP20增殖緩慢或停止；但是，最優(yōu)配比培養(yǎng)基不利于胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，BGP20可以持續(xù)的增殖，并達(dá)到較高的發(fā)酵菌體密度。另外，3種培養(yǎng)基發(fā)酵液的拮抗活性在11.5～12.7 mm，其間差異不顯著（圖2B）。

3 結(jié) 論

首先，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定了BGP20發(fā)酵培養(yǎng)基的組分，其中豆粕和玉米淀粉是關(guān)鍵因子；其次，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定了關(guān)鍵因子中心點(diǎn)和步長，利用Design-Expert軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，建立了BGP20發(fā)酵培養(yǎng)的模型：= 1.951×109＋2.266×108X1＋ 6.752×107X2－9.875×107X1X2－4.120×108X12－1.413×108X22。分析發(fā)現(xiàn)該回歸方程在實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)有最大值，即得到了BGP20發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比：豆粕16.03 g/L、玉米淀粉6.30 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、NaCl 1.25 g/L、KH2PO40.75 g/L、痕量元素15 mL/L，此培養(yǎng)基組分的BGP20發(fā)酵液菌體密度預(yù)測(cè)值為1.985×109CFU/mL；最后，對(duì)最優(yōu)配比組分進(jìn)行驗(yàn)證，獲得的BGP20發(fā)酵液菌體密度為1.86×109CFU/mL，是預(yù)測(cè)值的93.72%，兩者基本吻合，說明模型是可行的。并且，最優(yōu)配比培養(yǎng)基顯著優(yōu)于Landy和2YT培養(yǎng)基。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)速效有機(jī)氮源有利于BGP20的早期生長，但是在中后期BGP20大量合成胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，增殖速度受到限制。緩釋氮源豆粕培養(yǎng)基產(chǎn)生較少的胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，有利于BGP20的持續(xù)增殖，并最終達(dá)到一個(gè)較高的發(fā)酵菌體密度。各種碳源對(duì)BGP20發(fā)酵液菌體密度影響相對(duì)較少，但是過高的玉米淀粉含量也導(dǎo)致BGP20在發(fā)酵的中后期產(chǎn)生大量胞外多糖等次生代謝產(chǎn)物，不利于其增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)痕量元素的添加能夠顯著提高BGP20發(fā)酵液菌體密度。

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Response Surface Optimization of Medium Components for Cell Growth of Bacillus amyloliquefaciens BGP20

ZHAO Yan-cun, LI Peng-xia, HUANG Kai-hong*, WANG Yu-ning, SUN Ya, HU Hua-li
(Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A cost-effective culture medium for shake flask fermentation of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BGP20 was developed by optimizing the medium components using response surface methodology. First, based on the results of univariate analysis and Plackett-Burman design experiments, defatted soy flour and cornstarch were identified as two key medium components. Then a central composite design was applied to fit the relationship between these two components and optimal levels of BGP20 cell growth. The results showed that the regression model had a high fitting degree. The optimal medium components were 16.03 g/L defatted soy flour, 6.30 g/L cornstarch, 0.75 g/L MgSO4·7H2O, 1.25 g/L NaCl, 0.75 g/L KH2PO4and 15 mL/L trace elements. The maximum predicted value from the regression model was 1.985 × 109CFU/mL, and the actual value observed in validation experiments was 93.72% as compared to the predicted value. These results demonstrate that the regression model is of great guiding significance for commercial fermentation of BGP20.

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum; fermentation medium; cell concentration; response surface methodology; regression model

S476.8；TQ920

A

1002-6630（2014）03-0157-06

10.7506/spkx1002-6630-201403032

2012-12-19

2011年度第二批“江蘇省博士后科研資助計(jì)劃”項(xiàng)目；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金項(xiàng)目（6511106）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（12）3081）

趙延存（1976—），男，助理研究員，博士后，研究方向?yàn)楣哔A藏與保鮮。E-mail：zhaoyc27@126.com

*通信作者：黃開紅（1955—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：jaashuang@hotmail.com