非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯反應(yīng)研究進展

林 凱，辛嘉英,2,*，王 艷，陳林林

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000）

非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯反應(yīng)研究進展

林 凱1，辛嘉英1,2,*，王 艷1，陳林林1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室， 甘肅 蘭州 730000）

長鏈脂肪酸淀粉酯作為改性淀粉的一種重要類型具有廣泛的應(yīng)用前景。酶作為生物催化劑在非水相中可對淀粉和長鏈脂肪酸進行酯化，該反應(yīng)具有底物選擇性高、產(chǎn)物專一性強、條件溫和、產(chǎn)物可生物降解等優(yōu)點。本文從酶催化合成反應(yīng)的機理、酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯的制備方法、取代度的測定方面進行綜述。

長鏈脂肪酸淀粉酯；酶催化反應(yīng)；非水相；取代度

淀粉是一種大量存在的、廉價的、可再生的并且能夠被生物完全降解的天然多聚糖[1]。由于天然淀粉的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其反應(yīng)活力和反應(yīng)效率偏低，所以需要通過物理或者化學(xué)等方法對天然淀粉進行改性，以滿足特定的需求[2]。長鏈脂肪酸淀粉酯作為改性淀粉的一種重要類型已廣泛用于塑料工業(yè)、食品工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域 。由于淀粉中引入了長鏈脂肪酸，使其具有不同于天然淀粉的特殊的熱塑性、乳化性、疏水性和抗拉伸等特性。但是通過物理或化學(xué)方法制備長鏈脂肪酸淀粉酯的過程中，通常伴有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且反應(yīng)條件苛刻。因此越來越多的研究者對非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯的合成進行了研究。相比物理化學(xué)方法，非水相酶法催化對底物的選擇性強[3]、反應(yīng)條件溫和[4]，并且抑制了依賴于水的副反應(yīng)的發(fā)生[5]。鑒于研究的不斷深入，本文就非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯的合成機理、方法以及取代度的測定進行系統(tǒng)的分析和綜述。

1 非水相酶法催化合成的反應(yīng)機理及其影響因素

用于脂肪酸淀粉酯合成的酶主要為脂肪酶，來自于南極假絲酵母（Candida antarctica）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）等[6]。在非水相中進行的酶促反應(yīng)，酯水解反應(yīng)向著酯合成反應(yīng)方向進行，從而使酶法催化合成長鏈脂肪酸淀粉酯成為可能[7]。脂肪酶多用于長鏈脂肪酸淀粉酯的合成，其反應(yīng)機理為：酶的活性中心含有親核基團（如絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基），這些基團都有共用的電子對作為電子的供體，與脂肪酸中羧基的碳原子即親電子基團以共價鍵的方式結(jié)合，形成?；钢虚g產(chǎn)物，接著?；鶑闹虚g產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一?；荏w淀粉分子中，形成脂肪酸淀粉酯。反應(yīng)歷程如下：

式中：X為RCOO、OR、Cl、OH。

在非水相中，酶的催化活性受到很多因素的影響，包括有機溶劑、反應(yīng)體系中水含量、利用酶的方式等[8]。在水相體系中，酶表面極性帶電荷的氨基酸側(cè)鏈能與水分子相互作用，使酶分子有較大的催化表面積，而在疏水性有機溶液中，這些氨基酸側(cè)鏈會轉(zhuǎn)向酶分子內(nèi)部，在酶分子表面高度包裹，減少酶分子的可溶表面積，降低酶催化的柔韌性，從而抑制了酶的催化活性[9]。在非水相酶催化反應(yīng)中水含量也是影響酶催化活性的重要因素，正是由于在微觀上酶分子表面這層微觀水的存在，才使得宏觀上非水相體系中酶具有催化活性。水分子的存在可以通過氫鍵、疏水鍵等作用力維持酶分子的催化構(gòu)象[10]。對于親水性的有機溶劑，會吸附酶分子表面的必須水，使得酶分子變?yōu)閯傂誀顟B(tài)，失去酶催化構(gòu)象的柔韌性[11]。因此反應(yīng)體系中適當?shù)乃渴潜仨毜摹Ｍ瑫r，酶的利用形式也會影響其催化活性及耐受性。酶在非水相中的利用方式主要有3種方式：酶的化學(xué)修飾、酶的固定化以及酶的定點突變。酶的化學(xué)修飾是 利用戊二醛或聚乙二醇與酶進行化學(xué)交聯(lián)，得到交聯(lián)酶晶體，提高酶分子在有機相中的溶解性和穩(wěn)定性，同時能提高反應(yīng)活性[12]；酶的固定化是用載體將酶固定在特定的區(qū)域，使得酶仍具有催化活性，并且可以重復(fù)利用。研究發(fā)現(xiàn)，除了具有普通酶的性質(zhì)外，酶的固定化使其在有機溶劑中的穩(wěn)定性提高[13]；酶的定點突變是用分子生物學(xué)的方法定向改造酶分子的結(jié)構(gòu)，并通過高通量篩選出有機溶劑耐受性酶，提高酶在非水溶劑中活性和催化能力[14]。

2 非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯的合成方法

脂肪酶催化長鏈脂肪酸與淀粉發(fā)生酯化是一個復(fù)雜的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系應(yīng)考慮長鏈脂肪酸的疏水性、淀粉的親水性、酶在反應(yīng)體系中的催化活性這三方面因素。長鏈脂肪酸、淀粉和脂肪酶在反應(yīng)體系中的狀態(tài)決定了酯化反應(yīng)能否發(fā)生。下面將以不同體系下非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯的合成分別加以論述。

2.1 無溶劑體系

若脂肪酸在室溫或在低溫加熱狀態(tài)下為液體，以脂肪酸為溶劑體系，脂肪酶可直接催化酯化反應(yīng)的發(fā)生。由于底物濃度高，該方法提高了反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。Horchania等[15]以CaCO3為載體對Staphylococcus aureus脂肪酶（SAL3）進行固定化，以微波加熱的方式，通過液態(tài)酯化的方式合成油酸淀粉酯，并通過響應(yīng)面法對實驗結(jié)果進行優(yōu)化。在淀粉/油酸質(zhì)量比為0.18，固定化脂肪酶單位為386 U條件下，44℃反應(yīng)4 h，制得取代度為2.86的油酸淀粉酯。經(jīng)α-淀粉水解酶實驗發(fā)現(xiàn)，通過疏水化修飾后，油酸淀粉酯降解性降低。因為淀粉顆粒由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)組成，結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)致密，限制酶分子向淀粉內(nèi)部的滲透，導(dǎo)致其取代度和反應(yīng)效率降低。因此可以使用物理、化學(xué)和生物降解的方法對淀粉進行預(yù)處理，破壞淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，從而提高反應(yīng)效率[2]。Xin Jiaying等[16]用NaOH/尿素對玉米淀粉進行預(yù)處理，通過電鏡分析，與原淀粉相比，處理后的淀粉顆粒體積更小，表面粗糙并且疏松多孔。通過紅外光譜進一步分析，原淀粉經(jīng)預(yù)處理后，在1 661～1 623 cm-1之間出現(xiàn)C＝O的特征吸收峰，這是由于淀粉分子鏈的斷 裂從而導(dǎo)致羰基增多。同時在992 cm-1附近，D-吡喃葡萄糖環(huán)中C－O－C基團上的C－O伸縮振動峰發(fā)生紅移，這將會減輕淀粉分子間氫鍵的相互作用，使得淀粉鏈節(jié)發(fā)生斷裂[17]。淀粉分子結(jié)構(gòu)的變化使得酶分子與酯化劑更容易接近淀粉分子，從而提高催化效率。實驗證明，在無溶劑體系下，以固定化脂肪酶Novozym 435為催化劑，以棕櫚酸和預(yù)處理淀粉為原料，合成了棕櫚酸玉米淀粉酯，通過氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定其取代度為1.04。王艷等[18]也用NaOH/尿素對玉米淀粉進行預(yù)處理，在無溶劑體系下制得了取代度為0.201的油酸淀粉酯。但采用無溶劑體系催化反應(yīng)合成時應(yīng)該考慮各反應(yīng)底物的含水量，防止該反應(yīng)體系向水解反應(yīng)方向進行。同時淀粉不易溶于非極性溶劑，所以淀粉在該反應(yīng)體系中的擴散及溶解程度也是影響催化效率的重要因素。由于無溶劑體系法沒有添加任何有機溶劑，反應(yīng)制得的產(chǎn)品可直接用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

2.2 反膠束體系

反膠束體系是表面活性劑溶解于非極性溶液中，形成非極性環(huán)境圍繞極性核的反應(yīng)體系，即油包水型（W/O）微乳液[5]。該方法是在脂肪酶表面吸附少量的表面活性劑，表面活性劑的用量不應(yīng)將酶的表面全部覆蓋，形成脂肪酶-表面活性劑離子對，增加了脂肪酶在以 有機溶劑為反應(yīng)體系中的溶解性，形成反膠束，催化酯化反應(yīng)的發(fā)生。Bruno等[19]在以異戊烷為有機溶劑的反應(yīng)體系中，加入通過相轉(zhuǎn)移法制成的枯草蛋白酶-2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉（bis（2-ethylhexyl）sulfosuccinate sodium salt，AOT）離子對，催化葵酸乙酯與淀粉的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。通過熱重量分析法測定，制得的葵酸淀粉酯的取代度為0.15～0.32。通過光電子能譜發(fā)現(xiàn)，酯化反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生在淀粉顆粒的表面。研究進一步發(fā)現(xiàn)，使用未經(jīng)預(yù)處理的酶直接加入到該反應(yīng)體系時，并沒有發(fā)生酯化反應(yīng)。Alissandrato等[20]利用脂肪酶-表面活性劑離子對在異戊烷有機相中，催化合成了末端帶有三鍵的己炔酸淀粉酯，并且通過末端的三鍵與帶有熒光的疊氮化物進行環(huán)加成反應(yīng)，生成具有熒光性的淀粉酯。通過熒光顯微鏡觀察到該熒光物質(zhì)，進一步證明了己炔酸淀粉酯的生成。Chakraborty等[21]將淀粉制成平均粒徑在40 μm的納米淀粉顆粒，并與?；w形成AOT-微乳液，以固定化脂肪酶Novozym 435為催化劑，在40℃條件下反應(yīng)48 h，制得取代度為0.8的硬脂酸淀粉酯。通過同位素比質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)，盡管固定化脂肪酶存在于大孔樹脂的內(nèi)部，但是納米淀粉顆粒還是與脂肪酶發(fā)生接觸，并成功催化了反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 有機溶劑體系

淀粉不溶于絕大多數(shù)的液體，但是可溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、N,N-二甲基乙酰胺（N,N-dimethylacetamide，DMAc）和吡啶等強極性有機溶劑中。與淀粉的糊化作用不同，淀粉顆粒在DMSO中并未發(fā)生膨脹。淀粉鏈節(jié)的斷裂主要是由于DMSO是一種極強的氫鍵受體，能使淀粉分子內(nèi)部的氫鍵發(fā)生斷裂。但DMSO也會對酶分子的天然構(gòu)象產(chǎn)生不利影響，使得酶分子內(nèi)部的氫鍵發(fā)生斷裂，破壞其二級結(jié)構(gòu)，使酶分子失去催化活性。同時，DMSO也有較強的吸濕性，在反應(yīng)過程中應(yīng)控制體系中適當?shù)乃疃?，維持酶分子具有催化活性所必需的構(gòu)象。在極性溶劑中可對酶進行修飾，提高酶催化的穩(wěn)定性[22]。Ge Jun等[23]認為在催化反應(yīng)的過程中酶分子應(yīng)受到保護。他們將脂肪酶包裹在聚丙烯酰胺納米凝膠中。通過分子仿真技術(shù)和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：在DMSO溶劑中，聚丙烯酰胺納米凝膠有效地防止了酶分子中必需水的滲出，保持了酶分子的天然構(gòu)象。實驗進一步通過電子熒光顯微鏡證實，脂肪酶-納米凝膠在DMSO中也具有良好的分散性。Rajan等[24]在DMSO/DMF有機溶劑的反應(yīng)體系中，70℃反應(yīng)4 h，以脂肪酶為催化劑催化了木薯淀粉 和棕櫚酸的合成反應(yīng)，通過皂化法測得取代度為1.05，并根據(jù)紅外光譜的測定證實了酯化反應(yīng)的發(fā)生。通過熱接重量實驗分析和黏度的測定，隨著長鏈棕櫚酸的引入，熱穩(wěn)定性和黏度與原淀粉相比增大。同時棕櫚酸的引入使得棕櫚酸淀粉酯具有熱塑性，可以廣泛地應(yīng)用于塑料工業(yè)。

2.4 離子液體系

與DMSO相似，離子液作為一種有機溶劑的替代品應(yīng)用廣泛。離子液在室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的熔鹽，蒸汽壓低，不易揮發(fā)。在催化多糖類物質(zhì)如淀粉的酯化方面表現(xiàn)較高的活性[25]。Liu Qingbin等[26]研究發(fā)現(xiàn)：脂肪酶在離子液中可保持催化活力，可以催化酯化反應(yīng)的發(fā)生，但是淀粉僅微溶于離子液，在實驗中并沒有發(fā)生預(yù)想的反應(yīng)。同時由于離子液在室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的熔融鹽，揮發(fā)性低，不利于產(chǎn)物的分離。為了克服離子液的這些缺點，Lee等[27]研究了含有氯離子的離子混合液，由于這種離子混合液有極強的親水性，淀粉的溶解性增強，卻抑制了酶的催化活性。因此使用新型離子液時應(yīng)考慮到淀粉的溶解性和酶的催化活力兩方面因素。離子液作為溶劑體系還有待于進一步研究。

3 取代度的測定

長鏈脂肪酸淀粉酯的理化性質(zhì)取決于取代度、脂肪鏈飽和度與碳鏈長度及直鏈/支鏈淀粉酯的含量等。其中取代度的大小是長鏈脂肪酸淀粉酯的理化性質(zhì)的主要因素。傳統(tǒng)測定取代度的方法是皂化-反滴定法，這種方法首先是由Genung等[28]提出的，滴定法的基本原理是：當酯化改性淀粉在一定量的熱氫氧化鈉溶液中發(fā)生皂化反應(yīng)時，酯鍵發(fā)生斷裂生成游離的酰基，游離的酰基與鈉離子形成酰基鈉。當用標準鹽酸溶液對皂化反應(yīng)物進行反滴定時，通過計算皂化反應(yīng)消耗的氫氧化鈉的量推導(dǎo)出發(fā)生酯化反應(yīng)的?；牧俊，F(xiàn)在這種方法仍被廣泛的應(yīng)用[29-33]。

隨著現(xiàn)代儀器分析的發(fā)展，測定取代度準確度也進一步提升。目前，測定取代度的方法有氣相色譜法、核磁共振法和元素分析法。Alissandratos等[34]先將制得的脂肪酸淀粉酯溶于DMSO，然后加入甲醇鈉-甲醇溶液，冷凝回流，通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，然后加入內(nèi)標物，進行GC分析。研究發(fā)現(xiàn)，通過重復(fù)實驗，這種方法實驗偏差低于3%，其中測定的一種脂肪酸淀粉酯的取代度可達到0.004 2±0.000 1。相比于傳統(tǒng)方法，GC法提供了一種重現(xiàn)性更好、準確度更高、分析速度更快的方法。同時研究者還發(fā)現(xiàn)，這種方法更適合測定中長鏈的脂肪酸淀粉酯。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法是通過測定脂肪鏈中－CH3上H和葡萄糖上質(zhì)子H在1H NMR圖譜上峰面積的特定比值從而確定脂肪酸淀粉酯的取代度。Elomaa等[35]在用NMR法測定時發(fā)現(xiàn)，這種方法適用于取代度大于2的脂肪酸淀粉酯的測定。Forrest等[36]利用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）測定了羥丙基淀粉的取代度，研究發(fā)現(xiàn)采用紅外光譜法測定取代度，樣品可以直接測定，提高準確度，同時該方法對其他多糖類物質(zhì)的測定也適用。

4 展 望

近年來，長鏈脂肪酸淀粉酯作為脂肪替代品、緩釋藥物載體和具有良好熱塑性的生物降解材料在各領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。隨著研究的不斷深入，權(quán)衡淀粉、酶和長鏈脂肪酸這三者的關(guān)系，找到一個適合的反應(yīng)條件，以及提高酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯取代度問題都將成為未來的研究熱點，并且隨著可利用的酶的種類增多，會使酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯有更廣闊的發(fā)展空間。

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Recent Progress in Lipase-Catalyzed Synthesis of Long-Chain Fatty Acid Starch Esters in Non-Aqueous Phase

LIN Kai1, XIN Jia-ying1,2,*, WANG Yan1, CHEN Lin-lin1
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. State Key Laboratory of Oxo Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

Long-chain fatty acid starch esters, an important kind of modified starch products, have attractive application prospects. It is well known that the application of non-aqueous enzymatic catalysis in esterification of starch with long-chain fatty acids has the advantages of higher substrate selectivity, suppression of unwanted water-dependent side reactions, mild reaction conditions and biodegradability. In this review, the reaction mechanism and the currently available methods for lipase-catalyzed synthesis of starch esters with long-chain fatty acids in non-aqueous phase and the recent progress in the determination of degree of substitution are discussed.

long-chain fatty acid starch esters; enzymatic catalysis; non-aqueous phase; degree of substitution

TS231

A

1002-6630（2014）03-0276-04

10.7506/spkx1002-6630-201403054

2013-02-27

黑龍江省杰出青年基金項目（jc201106）；黑龍江省教育廳科技創(chuàng)新團隊計劃項目（2010td04）

林凱（1989—），男，碩士研究生，研究方向為生物催化。E-mail：glklkk@126.com

*通信作者：辛嘉英（1966—），男，教授，博士，研究方向為生物催化。E-mail：xinjiayingvip@163.com