抗壞血酸、半胱氨酸與氯化鈣復合處理對鮮切芋艿褐變的影響

譚誼談，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

抗壞血酸、半胱氨酸與氯化鈣復合處理對鮮切芋艿褐變的影響

譚誼談1，曾凱芳1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

研究抗壞血酸、半胱氨酸與氯化鈣復合處理對于鮮切芋艿貯藏期間酶促褐變的控制效果及其機理。結果表明：切分后的芋艿片褐變度迅速上升，亮度（L*）值下降，苯丙氨酸解氨酶、脂氧合酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性升高，總酚積累。與對照相比，2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣浸泡處理能夠有效降低鮮切芋艿貯藏期間的褐變度，保持較高的L*值和總酚含量，并抑制了苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和脂氧合酶活性和相對電導率的升高，達到提高鮮切芋艿貯藏品質和延長貯藏周期的目的。

抗壞血酸；半胱氨酸；鮮切芋艿；貯藏；褐變

芋艿（Colocasia Schott）俗稱為芋頭，天南星科單子葉多年生草本植物，在我國云南、四川、貴州、福建和海南等地均有栽培[1-2]，隨著人們生活節奏的加快和對營養均衡搭配的重視，芋艿以其豐富的營養價值[3]，越來越受到關注。但芋艿外表帶毛刺難以清除，接觸后會造成皮膚瘙癢，在加工或烹飪過程造成諸多不便[4]。為了更加方便快捷地食用芋艿, 可對其進行最小加工處理或鮮切加工[4]。然而去皮產生的機械傷破壞了芋艿細胞結構的完整性，使得本來因區域化分部而被分隔開的酚類和酚酶接觸，導致酚類被氧化而聚合形成褐色聚合物，導致褐變的發生[5]，降低貯藏品質，嚴重影響其商品價值。

傳統的控制褐變方法中，氣調保鮮和亞硫酸鹽保鮮具有較好的效果，已在蘋果[6]、梨蓮[7]、藕[8]和甘薯[9]上得到了廣泛的應用。由于氣調保鮮成本相對較高，而亞硫酸鹽的殘留對人體健康和環境污染的影響[10]，在實際應用過程中受到限制。鮮切果蔬由于機械傷加速乙烯的合成，促使果蔬組織代謝加快，導致衰老的發生。同時乙烯可以提高果蔬組織中酚酶的活性，加速貯藏期間褐變的發生[11-12]。抗壞血酸處理能夠作用于多酚氧化酶中心的銅離子，鈍化酶活性，同時還原被酚酶氧化的酚類物質，而半胱氨酸處理還能夠與酚類物質形成復合物，抑制褐變進程[5]。氯化鈣處理能夠在細胞壁外形成鋼性膜，改善細胞透氣性，并且增加細胞壁強度，保持貯藏品質[13]，具有操作方便、高效和無毒無害等優點，被廣泛應用于控制洋薊[14]、土豆[15]和梨[16]等的褐變。目前對于鮮切芋艿褐變控制方法的研究主要集中在抗壞血酸（ascorbic acid，AA）及其鹽類、L-半胱氨酸（cysteine，Cys）以及4-己基間苯二酚等[4]，雖然操作簡單快捷，但單一處理控制褐變效果不佳，因此需要尋求復合處理的方式控制鮮切芋艿褐變的發生。本實驗以2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣浸泡處理鮮切芋艿，研究其對冷藏期間芋艿褐變的控制效果及機理，以期為鮮切芋艿生產中的品質控制提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

芋艿購于重慶市北碚區天生農貿市場，品種為魁芋。挑選大小均一、沒有病蟲害、外觀完整無機械傷的芋艿，經清洗之后用滅菌的工具去皮，切分為厚度為0.5 cm大小均一的切片，將切分后的芋艿用消毒過的聚乙烯托盤分裝，用于不同處理。

1.2 試劑與儀器

丙酮（分析純） 重慶川東化工化學試劑廠；β-巰基乙醇（分析純）、鄰苯二酚（化學純） 中國醫藥集團上海化學試劑公司；愈創木酚（化學純） 中國佘山化工廠；甲醇（分析純） 成都科龍化工試劑廠；亞油酸鈉（色譜純） 美國Sigma公司。

S22PC可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 處理

實驗處理包括：1）對照：無菌水浸泡處理2 min；2）用無菌水配制2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣溶液，浸泡處理2 min。處理后裝有鮮切芋艿片的托盤用0.05 mm厚聚乙烯保鮮膜覆蓋包裝，貯藏于（4±1）℃，85%～95%濕度條件下，分別于貯藏2、4、6、8、10 d隨機取樣進行觀察測定。每處理用樣500 g，每個實驗處理重復3次。

1.3.2 褐變度和色差值的測定

褐變度測定參考陳功等[17]方法，稱取新鮮樣品2 g，切碎，研磨后加入質量比1∶10的預冷蒸餾水，在20 ℃條件下、以3 500 r/min離心，用蒸餾水作為空白對照，測定波長410 nm波長處的吸光度，以A410nm×10表示褐變度。色差L*值用測色色差計測試。

1.3.3 總酚的測定

總酚的提取與測定參考Dewanto[18]、Chu Yifang[19]等方法并修改：將2 g樣品與50 mL冷凍的80%丙酮混合、均質再抽濾，濾液經80%丙酮沖洗后用旋轉蒸發儀在45 ℃條件下旋轉蒸發，并用蒸餾水定容到10 mL。總酚測定參照Chu Yifang等[19]方法。

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）的測定[20]

稱取2.5 g樣品組織，冰浴條件下與5.0 mL提取緩沖液（50 mmol pH 8.8硼酸緩沖液＋5 mmol/L β-巰基乙醇＋40 g/L PVP＋2 mmol/L EDTA）混合勻漿，在12 000×g，4 ℃低溫離心30 min，取上清液為酶提取液。加入3.4 mL 50 mmol、pH 8.8硼酸緩沖液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液和0.1 mL酶提取液（對照組酶提取液先煮沸8 min），搖勻。在37℃條件下保溫30 min。保溫結束立即向試管加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應。測定波長設為290 nm，以蒸餾水為空白調零，分別測定活性管、對照管吸光度（A1和A0）。單位以0.01ΔA290nm/（h?g）表示，即每小時每克鮮質量皮組織酶反應體系吸光度增加0.01為一個PAL活性單位（U）。

1.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）的測定[21]

準確稱取1.0 g新鮮樣品于研磨中，立即加6 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）和0.2 g PVP，冰浴條件下迅速研磨，勻漿液以12 000×g、4 ℃條件下離心30 min，收集上清液，4℃放置備用（當天測定）。

PPO活性測定參照Zauberman等[22]的方法并改進。3 mL反應體系：2 mL 0.1 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液＋0.9 mL 50 mmol/L鄰苯二酚＋0.1 mL酶提取液。測定室溫條件下470 nm波長處，反應液10 min內吸光度的變化。實驗重復3次。以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U）。POD活性測定參照Srivastava等[23]的方法并改進。3 mL反應體系：2.7 mL 0.1 mol/L pH 6.8的磷酸緩沖液＋0.1 mL 4%的愈創木酚＋0.1 mL 0.5% H2O2＋0.1 mL酶提取液。測定室溫條件下470 nm，反應液10 min內吸光度的變化。以每分鐘吸光度變化0.001為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 脂氧合酶（lipoxidase，LOX）的測定

參照陳松昆等[24-25]測定方法，并有所改進：稱取1.0 g柑橘果皮于預冷的研缽中，加入5.0 mL經預冷的提取液，在冰浴條件下研磨勻漿，然后轉移至離心管中于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液備用。再取2.775 mL 0.1 mol/L、pH 6.0 檸檬酸緩沖液于反應休系中，加入25 μL亞油酸鈉母液，再加入200 μL粗酶液。以蒸餾水為參比調零，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長234 nm處吸光度為初始值，然后每隔15 s測定1次，測到反應90 s為止。以每克鮮樣每分鐘吸光度增加0.01為1個LOX活性單位（U）。

1.3.7 電導率的測定

參照曹建康[21]、王國澤[26]等測定方法并作一定修改。取厚薄均勻大小一致的組織園片，精確稱取0.5 g（大約15片組織圓片），放入盛有20 mL去離子水的燒杯振蕩10 min，將水傾去，再用去離子水清洗3次并用濾紙片吸干圓片上的水分。把組織圓片放入大試管中，準確加入20 mL去離子水，再放入振蕩器中振動1 h，在20～25 ℃恒溫條件下，用電導率測定儀測定溶液電導率（L1）。再將試管煮沸10 min，加熱殺死組織園片，冷卻后再次測定提取液的電導率（L0）。細胞膜滲透率即相對電導率按下式計算：

相對電導率/%=L1/L0×100

1.4 數據統計及圖形分析

用Excel 2003統計分析所有數據，計算標準誤、制圖；并利用SPSS對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣處理對鮮切芋艿褐變情況的影響

圖1 抗壞血酸、半胱氨酸復合氯化鈣處理對不同貯藏期鮮切芋艿褐變情況的影響Fig.1 Effect of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2on browning of fresh-cut taro during storage

如圖1所示，酚類物質被酚酶所氧化，導致鮮切芋艿表面顏色從白色轉變成深黃色（圖中顯示為褐色），隨著褐變的加劇逐漸變成褐色。對照組在貯藏第4天時褐變已經比較嚴重，而抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理顯著延緩了鮮切芋艿的褐變進程，將貯藏周期延長了4～6 d。

圖2 抗壞血酸、半胱氨酸復合氯化鈣處理對鮮切芋艿褐變度（AA）和L*值（B）的影響Fig.2 Effects of combined treatment with ascorbic acid cysteine and CaCl2on browning rate (A) and L* value (B) of fresh-cut taro

褐變度反映了鮮切芋艿在貯藏過程中褐變的程度，圖2A結果與圖1結果一致，表明抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理能夠抑制鮮切芋艿貯藏期間褐變度的上升，起到控制褐變的目的。

L*值表示亮度，其數值在1～100之間變化，數值越大，間接反映褐變程度較低，反之則褐變嚴重[27]。鮮切芋艿貯藏期間L*值變化趨勢如圖2B所示，L*值整體呈現不斷下降的趨勢，對照組從貯藏第4天開始，其L*值下降速度加快，而抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理能有效延緩L*值的下降，控制鮮切芋艿褐變的發生。

2.2 抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣處理對鮮切芋艿PAL活性和總酚含量的影響

PAL是苯丙氨酸代謝途徑中的第一個酶，能夠分解苯丙氨酸[5]，其產物包括酚類和類黃酮等，而酚類和類黃酮作為褐變的底物可以被酚酶所氧化形成褐色聚合物導致褐變的發生[28]。如圖3A所示，貯藏期間對照組PAL活性一直高于抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理組。在貯藏第8天時，抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理對PAL活性抑制效果最佳，僅為同期對照組PAL活性的51.1%，與Zhu Liqin[29]、Vincenzo[30]等的研究結果一致。抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理組的總酚含量顯著高于同期對照組（P＜0.05）。抗壞血酸可競爭性被氧化同時還原被氧化的酚類物質，以此提高貯藏期間總酚的含量。在貯藏末期，復合處理組總酚含量為對照組的2.27倍，延緩褐變效果明顯。

圖3 抗壞血酸、半胱氨酸復合氯化鈣處理對鮮切芋艿PAL活性（A）和總酚含量（B）的影響Fig.3 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2on PAL activity (A) and total phenol content (B) of fresh-cut taro

2.3 抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣處理對鮮切芋艿POD和PPO活性的影響

圖4 抗壞血酸、半胱氨酸復合氯化鈣處理對鮮切芋艿POD（A）和PPO活性（B）的影響Fig.4 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2on POD (A) and PPO activities (B) of fresh-cut taro

在果蔬褐變過程中，PPO和POD是最重要的兩個酶，PPO能夠催化氧化酚類物質形成褐色聚合物，而POD能夠在有H2O2存在的情況下，氧化酚類物質形成褐變。控制鮮切果蔬褐變主要通過抑制褐變相關酶活性實現[5]。鮮切芋艿貯藏期間PPO和POD活性總體呈現上升后下降的趨勢。抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理均對PPO和POD具有一定的抑制效果，分別在Zhu Liqin[29]、Degl'Innocenti[31]、Cabezas-Serrano[14]等的實驗中已得到證明。而圖4表明，抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理組能夠降低鮮切芋艿貯藏期間PPO和POD的活性。芋艿的PPO和POD活性高峰均出現在貯藏第8天，此時抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理組的PPO和POD活性分別只有對照組PPO和POD活性的68.43%和76.55%，控制效果顯著（P＜0.05）。表明了抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理能夠較好地抑制鮮切芋艿貯藏期間PPO和POD活性，延緩貯藏期間褐變的進程。

2.4 抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣處理對鮮切芋艿LOX活性和相對電導率的影響

圖5 抗壞血酸、半胱氨酸復合氯化鈣處理對鮮切芋艿LOX活性（A）和相對電導率（B）的影響Fig.5 Effects of combined treatment with ascorbic acid, cysteine and CaCl2on LOX activity (A) and relative conductivity (B) of fresh-cut taro

由圖5A可知，果蔬經切分后，LOX活性上升，并加速細胞質膜的破壞，使得細胞結構受損破壞了酚類與酚酶的區域化分布[32]，加速了褐變的發生。鮮切芋艿在貯藏期間其LOX活性逐漸升高，而抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理能夠抑制其LOX活性的上升，通過鈍化LOX活性，降低細胞膜脂破壞程度，保護細胞結構的完整性。在貯藏第6天和第8天，處理組LOX活性僅為對照組同期的60.3%和65.3%，抑制效果顯著（P＜0.05）。相對電導率的結果如圖5B所示，和LOX活性變化較為一致，從貯藏第6天開始，抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理較好地控制了相對電導率的上升，表明抗壞血酸、半胱氨酸和氯化鈣復合處理能有效保護鮮切芋艿的細胞結構，從而延緩酚類與酚酶接觸，阻止褐變的發生。

3 結 論

3.1 2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣復合處理抑制了鮮切芋艿貯藏期間的PAL活性，同時降低了LOX活性，延緩了膜脂過氧化進程，保持細胞膜脂結構的完整性。

3.2 2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣復合處理顯著抑制了貯藏期間PPO和POD的活性，降低酚類物質被氧化的速度。

3.3 2.5%抗壞血酸＋0.05%半胱氨酸＋0.4%氯化鈣復合處理能夠保護酚類物質，延緩膜脂過氧化進程，阻礙酚類與酚酶的接觸，同時鈍化了褐變相關酶的活性，降低了鮮切芋艿貯藏期間褐變度，從而達到控制鮮切芋艿貯藏期間褐變、提高貯藏品質和延長貯藏周期的目的。

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Effects of Combined Treatment with Ascorbic Acid, Cysteine and CaCl2on Browning of Fresh-Cut Taro

TAN Yi-tan1, ZENG Kai-fang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

In this study, we evaluated the effects and mechanism of combined treatment with ascorbic acid (AA) and cysteine (Cys) and calcium chloride (CaCl2) on enzymatic browning of freshly-cut taro during storage. The results showed that the degree of browning in fresh-cut taro rapidly increased, whereas L* value decreased. Moreover, the activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), phenylalanin ammonia-lyase (PAL) and lipoxidase (LOX) rose and the content of total phenol was accumulated during storage. Soaking treatment with 2.5% AA, 0.05% Cys and 0.4% CaCl2could effectively retard browning, maintain high levels of L* value and total phenol content, inhibit the increases in the activities PPO, POD, PAL and LOX and conductivity, thus improving the storage quality and prolonging the storage life of fresh-cut taro.

ascorbic acid; cysteine; fresh-cut taro; storage; browning

S609.3；S667.7

A

1002-6630（2014）04-0231-05

10.7506/spk x1002-6630-201404047

2013-06-16

重慶市自然科學基金項目（CSTC2011BB1014）

譚誼談（1987—），男，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：tytkevin@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com