響應面優化超聲波-微波協同提取高粱醇溶蛋白工藝

劉振春，耿存花，孫慧娟，韓 宇

（吉林農業大學食品與科學工程學院，吉林 長春 130118）

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）是世界主要的糧食作物之一，我國的高粱產量世界排名第二[1]。它營養豐富，是我國的傳統食物。據國外研究報道，高粱會給人們帶來新的健康理念，由于生長在干旱氣候條件下，其含有較多的二十烷醇的多酚復合物和高抗氧化水平的高粱蠟，對健康有獨特的益處，尤其對保護心血管的健康至關重要。高粱還含有較多的原花青素[2]，它是一類由黃酮類物質衍生的多酚物質[3]，而谷物里面的多酚物質一直被人們認為是營養的限制性因子[4]。因此高粱這種古老的作物作為21世紀的主要谷物作物引發了人們新的興趣[5]。高粱種子約含有6%～18%的蛋白質[6]，其中醇溶蛋白是高粱蛋白的主要貯存形式[7]，約占高粱總蛋白質的70%～90%[8]。根據分子質量、氨基酸序列及免疫學的不同又把醇溶蛋白分為3種：α-、β-、γ-醇溶蛋白[9]。醇溶蛋白具有獨特的耐熱性、成膜性以及抗氧化性，有防潮、阻氣、保鮮、抑菌等作用[10]，是比較理想的天然保鮮劑[11-12]。迄今為止，在醇溶蛋白膜研究和開發[13-14]上已投入了大量資源。但它在食品行業中的應用仍相當有限，因此具有廣闊的開發前景[15]。

醇溶蛋白的提取主要用乙醇、叔丁醇、異丙醇等有機溶劑提取法[16-17]。也有研究用超臨界CO2萃取技術[18]先去除原料中的脂質、色素等雜質。有研究者[19]用86%的異丙醇作為溶劑提取醇溶蛋白，該方法產率高，但是產品有異味，不利于應用于食品加工中[20]，本實驗利用乙醇溶液作為提取劑。除此以外，使用超聲波或者微波輔助溶劑提取可有效提高醇溶蛋白的得率[21-22]。由于提取醇溶蛋白需要消耗大量的提取劑，生產成本較高，急需優化高粱醇溶蛋白的提取工藝，提高其得率，降低生產成本。本研究采用超聲波-微波協同技術提取高粱醇溶蛋白，旨在減少溶劑用量，提高生產效率，為高粱的綜合利用和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱 長春市售。

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、DTT（均為分析純）北京化工廠。

1.2 儀器與設備

FDV超微粉粹機 日本佑崎有限公司；微型植物試樣粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；微波爐 美的公司；JY99-2D超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KDN-消化爐、KDN-08定氮儀 北京通潤源機電技術有限責任公司；LXJ-ⅡB離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

高粱→粉碎過篩→無水乙醇脫色→離心分離→收集濾餅→75%乙醇→調pH 10.0→超聲波處理→微波處理→離心（4 000 r/min，5 min）→取上清液→冷水稀釋乙醇體積分數至40%→調pH 6.0→靜置24 h→洗滌沉淀→熱風干燥→粉碎→高粱醇溶蛋白

1.3.2 蛋白質測定

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法，蛋白質系數為6.25。

1.3.3 高粱醇溶蛋白的鑒定和得率的計算

用紫外分光光度計測成品與高粱醇溶蛋白標準品的紫外吸收圖譜，最大吸收波長為278 nm，并與標準比較，判斷提取物是否為醇溶蛋白[23]。

1.3.4 單因素試 驗

稱取5.0 g粉碎所得到的高粱粉末進行實驗，分別研究不同的超聲功率、超聲處理時間、液料比、微波功率、微波處理時間對高粱醇溶蛋白得率的影響。提取的基本條件是：pH 10.0二硫蘇糖醇用量1%[24]、75%的乙醇溶液作為提取劑、液料比9∶1（mL/g）、超聲功率480 W、超聲溫度控制在50℃以內、超聲處理時間25 min、微波功率450 W、微波處理次數5次（每次45 s，2次處理間隔時間需樣液冷卻為止）。各因素水平為：超聲功率300、360、420、480、540 W；超聲時間15、20、25、30、35 min；液料比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）；微波功率270、360、450、540、630 W；微波處理時間45、135、225、315、405 s。

1.3.5 響應面優化試驗方案

采用響應面法進行試驗數據處理，選用Box-Behnken模型對影響超聲-微波協同技術提取高粱醇溶蛋白得率的因素進行響應面設計，以高粱醇溶蛋白得率為響應值進行優化。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對高粱醇溶蛋白得率的影響

由圖1可見，超聲功率對高粱醇溶蛋白得率影響較小，醇溶蛋白得率隨超聲功率的增加而增加，但是當功率超過420 W后，醇溶蛋白得率略有下降，所以選擇超聲功率420 W提取高粱醇溶蛋白。根據SAS 8.2數據分析軟件處理知，P＞0.05，說明超聲功率對高粱醇溶蛋白得率影響不顯著。

2.1.2 超聲時間對高粱醇溶蛋白得率的影響。

圖2 超聲時間對高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on kafirin yield

由圖2可知，超聲時間對醇溶蛋白得率產生了比較明顯的影響，隨著時間的延長，高粱醇溶蛋白的得率不斷增加，當超聲時間為25 min時，得率最高，超過25 min后，得率下降，故選用超聲時間為25 min。由SAS 8.2數據分析軟件分析，P＜0.05，說明超聲時間對高粱醇溶蛋白得率影響高度顯著。

2.1.3 液料比對高粱醇溶蛋白得率的影響

由圖3可知，在試驗選取的液料比范圍內，提取液用量少時得率較小，隨著提取液用量的增加，得率呈逐漸上升的趨勢，但當液料比到10∶1（mL/g）后，得率增勢平緩，從節約成本的角度考慮，選擇液料比為10∶1（mL/g），這與Watterson等[25]結果相同。根據SAS 8.2軟件分析，P＜0.05，液料比對高粱醇溶蛋白得率有顯著性的影響。

圖3 液料比對高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.3 Effect of solvent-to-material ratio on kafirin yield

2.1.4 微波功率對高粱醇溶蛋白得率的影響

圖4 微波功率對高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on kafirin yield

由圖4可知，當微波功率為450 W時，得率最大，超過450 W，可能由于強烈的熱效應使有效成分遭到破壞，導致得率降低，因此，選取微波功率為450 W。根據SAS 8.2數據分析軟件處理知，P＞0.05，說明微波功率對高粱醇溶蛋白得率影響不顯著。

2.1.5 微波處理時間對高粱醇溶蛋白得率的影響

圖5 微波處理時間對高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on kafirin yield

由圖5可以看出，在微波處理時間為45～225 s范圍內時，由于細胞壁破裂程度不斷增加，225 s時，細胞破裂程度達到最大，從而使高粱醇溶蛋白得率緩慢上升，在225 s以后，高粱細胞壁基本破壁完全，同時由于持續的加熱破壞了高粱醇溶蛋白成分，而使得率下降，所以選微波時間為225 s（即微波處理5次，每次45 s）。由SAS 8.2數據分析軟件分析，P＜0.01，說明微波時間對高粱醇溶蛋白得率影響高度顯著。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果與分析

綜合單因素試驗結果，選超聲時間、液料比、微波時間3個因素，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平利用Design-Expert 7.0軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，根據試驗設計確定的試驗方案對高粱醇溶蛋白提取進行優化，試驗方案及結果見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計及結果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗

根據表1，利用Design Expert 7.0.0軟件對試驗數據進行回歸分析，由此得到超聲波-微波協同輔助提取高粱醇溶蛋白得率對超聲時間、液料比、微波時間的二次多項回歸方程為：Y=6.72＋0.20A＋0.26B＋0.36C－0.075AB－0.088AC＋0.097BC－0.73A2－1.04B2－0.50C2。

通過方差分析從表2可以看出，該模型P＜0.001，表明回二次歸方程模型極顯著，模型的相關系數R2=0.996 8，校正決定系數R2Adj=0.992 7，表明模型實際值與預測值擬合較好，失擬項P=0.752 6＞0.05，失擬不顯著，試驗誤差較小，因此可用該模型對醇溶蛋白提取試驗進行分析和預測。

表2 回歸模型各項方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial regression mooddeell

由表2可知，各因素對高粱醇溶蛋白得率的影響都極顯著，表明超聲時間、液料比和微波時間對高粱醇溶蛋白得率影響都很大，交互項中除AB之間不顯著，其余均顯著，即超聲時間與微波時間，液料比與微波時間都存在交互作用，因此表明各因素對高粱醇溶蛋白得率的影響不是簡單的線性關系。

2.2.3 雙因素交互作用分析

圖6 各兩因素交互作用對高粱醇溶蛋白得率影響的響應面分析Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of three extraction parameters on kafirin yield

由圖6a可以看出，當微波時間固定在225 s時，超聲時間和液料比的交互作用不顯著，在所選范圍內無極值；從圖6b可以看出當液料比固定在10∶1（mL/g）時，研究超聲時間和微波時間對高粱醇溶蛋白得率的交互影響，由圖6b看出，高粱醇溶蛋白得率隨著超聲時間和微波時間的延長而提高，當超聲時間在26 min左右，微波時間在240 s左右時得率最高，超聲時間與微波時間對高粱醇溶蛋白得率影響顯著，兩者對醇溶蛋白得率的提高起到了一定的作用。圖6c顯示，當超聲時間為25 min時，高粱醇溶蛋白得率受液料比和微波時間交互作用影響較大，微波時間短，液料比低，高粱醇溶蛋白得率小，但微波時間過長、液料比過大則會導致高粱醇溶蛋白得率下降。

2.2.4 優化提取工藝參數的驗證

采用Design Expert軟件，分析得到的最佳工藝條件是：超聲時間25.55 min、液料比10.14∶1（mL/g）、微波時間257.30 s，在此條件下高粱醇溶蛋白得率為6.81%。考慮到實際操作的便利，確定提取高粱醇溶蛋白的工藝條件為超聲時間為26 min、液料比為10∶1（mL/g）、微波時間260 s，經過3次平行實驗，高粱醇溶蛋白的得率為6.79%，與理論值相差不大。

3 結 論

本研究運用響應面法對超聲波-微波協同輔助高粱醇溶蛋白提取工藝進行優化，通過Box-Behnken試驗設計建立數學模型，并進行響應面分析，結果表明超聲時間、液料比、微波時間對高粱醇溶蛋白得率影響均顯著，超聲時間和微波時間、微波時間和液料比之間的交互作用顯著，但超聲時間和液料比的交互作用不顯著。超聲-微波協同輔助高粱醇溶蛋白提取工業條件為超聲時間26 min、液料比10∶1（mL/g）、微波時間260 s，在此工藝條件下驗證實驗，高粱醇溶蛋白得率為6.79%。利用響應面分析方法對超聲波-微波協同輔助提取高粱醇溶蛋白提取工藝條件進行優化，可以獲得最佳的工藝參數，從而為進一步的實驗研究提供依據。

[1]鄒劍秋.高粱籽粒的深加工及其加工產業[J].農產品加工, 2005(9): 28-29.

[2]黃朝暉, 陸平, 孟憲軍, 等.不同產地高粱的原花青素含量測定及其抗氧化活性分析[J].食品工業科技, 2008, 29(9): 140-144.

[3]方勝, 李里特.靜電場對番茄保鮮過程的影響[J].食品科學, 1997,18(1): 5-9.

[4]方勝, 李英杰, 陸守道.高壓電場加速食品解凍的探討[J].食品科學,1999, 20(3): 26-28.

[5]CHUNG O K, BEAN S R, PARK S H, et al.Sorghum.Foods:new health benefits from an ancient grain[C].3rd.Food Science International Symposium, 2004: 18-19.

[6]SHULL J M, WATTERSON J J, KIRLEIS A W.Proposed nomenclature for the alcohol-soluble proteins (Kafirins) ofSorghum bicolor.(L.Moench) based on molecular weight, solubility, and structure[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 39: 83-87.

[7]譚斌.粒用高粱的特性及其在食品工業中開發利用前景[J].糧油深加工及食品, 2007(7): 16-19.

[8]WATTERSON J J, SHULL J M, KIRLEIS A W.Quantitation ofα-,β-, andγ-kafirins in vitreous and opaque endosperm of sorghum bicolor[J].Cereal Chemistry, 1993, 70: 452-457.

[9]郭海峰.高粱種質資源種子醇溶谷蛋白的SDS-PAGE表型多樣性[D].太原: 山西大學, 2009.

[10]李秀明, 陳野, 王君予, 等.PPC對擠壓成型Zein-PPC復合薄膜性質的影響[J].食品科學, 2012, 33(19): 6-10.

[11]張偉敏, 譚小蓉, 鐘耕.高粱蛋白質研究進展[J].糧食與油脂,2005(1): 7-9.

[12]MECITOGLU, YEMENICIOGLU A, ARSLANOGLU A, et al.Incorporation of partially purified hen egg white iysozyme into zein films for antimicrobial food packaging[J].Food Research International,2006, 39(1): 12-21.

[13]陳野, 李鵬, 羅垠.玉米醇溶蛋白/納米二氧化鈦復合膜的制備及性質[J].食品科學, 2011, 32(14): 56-60.

[14]何慧, 王雪剛, 孔林, 等.玉米醇溶蛋白膜在腌肉制品及果蔬中的保鮮作用研究[J].糧食食品科技, 2004(3): 184-187.

[15]姜燕, 唐傳核, 溫其標, 等.蛋白質膜的研究進展[J].食品研究與開發, 2006, 27(1): 185-188.

[16]王偉, 印麗萍, 陳沁.高粱種子醇溶蛋白的提取條件[J].上海大學學報: 自然科學版, 2007, 13(6): 747-749.

[17]楊光, 楊波, 吳景.不同干燥方法對玉米醇溶蛋白性質影響研究[J].食品科學, 2009, 30(23): 57-59.

[18]王大為, 邵信儒, 張艷榮.超臨界CO2萃取對玉米醇溶蛋白提取率及水解度影響的研究[J].食品科學, 2005, 26(8): 166-170.

[19]李遠志, 賴江華.玉米食用蛋白高效回收法和用途[J].華南農業大學學報, 1993, 14(2): 111-113.

[20]段純明, 董海洲.玉米醇溶蛋白的特性及應用研究[J].糧食與食品工業, 2007, 14(1): 29.

[21]李娜, 劉東, 徐懷德, 等.響應面法優化超聲波提取玉米醇溶蛋白工藝[J].食品科技, 2012, 37(2): 183-187.

[22]趙華, 王虹, 任晶, 等.響應面法優化微波輔助提取玉米醇溶蛋白工藝研究[J].糧食與油脂, 2010(12): 23-26.

[23]王步江, 劉金福, 張陳云, 等.中心組合設計優化玉米醇溶蛋白的提取工藝[J].中國食品添加劑, 2010(6): 196-199.

[24]PARK S R, BEAN S R.Investigation and optimization of the factors influencing sorghum protein extraction[J].Agricultrue Food Chemistry, 2003, 51: 7050-7054.

[25]WATTERSON J J, BEAN S R, LOOKHART G L.Factors influencing the characterization of giuten proteins by SEC-Malls[J].Cereal Chemistry, 2001, 78: 608-618.