不同羊肚菌菌株的遺傳差異性與胃黏膜保護作用的比較研究

魏 巍，余夢瑤，許曉燕，江 南，葉利明，羅 霞,*

（1.四川省中醫(yī)藥科學院 中藥細胞與分子生物學實驗室，四川 成都 610041；2.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041）

不同羊肚菌菌株的遺傳差異性與胃黏膜保護作用的比較研究

魏 巍1，余夢瑤1，許曉燕1，江 南1，葉利明2，羅 霞1,*

（1.四川省中醫(yī)藥科學院 中藥細胞與分子生物學實驗室，四川 成都 610041；2.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041）

為研究不同羊肚菌菌株之間的遺傳差異性和比較不同菌株的胃黏膜保護作用。采用簡單重復序列區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）分子標記技術，對羊肚菌進行了遺傳差異性分析；以菌絲體干質量為指標，比較不同菌株液體發(fā)酵的菌絲體生物量；研究不同菌株對酒精引起的小鼠急性胃黏膜損傷的保護作用。結果表明：16株羊肚菌菌株可分為2組，羊肚菌M1～M10生物量較高，羊肚菌M1、M2、M3的胃黏膜保護作用最好。不同羊肚菌菌株在液體發(fā)酵生物量和胃黏膜損傷的保護作用方面存在較大的差異。

羊肚菌；簡單重復序列區(qū)間；生物量；胃黏膜保護

我國羊肚菌資源豐富，分布廣泛，據(jù)記載，在中國發(fā)現(xiàn)的羊肚菌有8個種，在全國20多個省均發(fā)現(xiàn)。羊肚菌不僅味道鮮美而且具有極高營養(yǎng)保健價值。《中華本草》記載：羊肚菌消食和胃，化痰理氣。主治消化不良，痰多咳嗽。還可以增強免疫[1]、抗輻射[2]、抗腫瘤[3]、保肝[4]、促進胃排空與加強小腸推進[5-6]。最近的研究報道，尖頂羊肚菌對多種實驗型動物胃潰瘍具有保護作用[7-8]，但是尚無文獻報道這種胃黏膜保護作用是否在菌株之間存在差異。本實驗利用分子生物學的手段研究了16株野生羊肚菌的遺傳差異性，并比較了這16株野生羊肚菌對酒精引起的胃黏膜損傷的保護作用，研究了胃黏膜保護作用在菌種之間的差異性，為開發(fā)具有功效的羊肚菌新產(chǎn)品在菌株選擇上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

羊肚菌M1～M16于2004—2006年在四川省攀枝花、阿壩州與甘孜州等地采集，通過組織或孢子分離而得，4℃條件下保存于PDA綜合培養(yǎng)基上，每6個月活化傳代一次（表1）。羊肚菌子實體為市場購買尖頂羊肚菌。

表1 菌株信息表Table 1 Information about Morechella strains

1.2 引物

所用引物參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的第9套簡單重復序列區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）引物序列（http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/ primers/Primers.pdf），共100個引物。

1.3 動物

昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學研究院動物室提供（SPF級，合格證號：SCXK（川）2005-19），動物實驗前適應性飼養(yǎng)3 d。

1.4 ISSR聚類分析

1.4.1 DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取DNA[9]。

1.4.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

PCR反應體系[10]：模板DNA（100 ng/μL）1 μL、10×PCR Buffer （Mg2+free）2.0 μL、ISSR引物（10 μmol/L） 0.2 μL、Opti-Taq （2.5 U/μL）0.4 μL、dNTPs Mixture （each 2.5 mmol/L）1.6 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、ddH2O 13.2 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃充分變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應完成后，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，EB染色后利用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4.3 引物的篩選

根據(jù)條帶清晰度、多態(tài)性以及重復性進行PCR反應，以對100個ISSR引物進行篩選，篩選獲得引物見表2。

表2 ISSR所用引物Table 2 Primers used in ISSR

1.4.4 PCR產(chǎn)物的電泳圖譜分析

對各個分子標記的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜進行分別分析。具有條帶記為“1”，沒有條帶記為“0”，對每一菌株和每一引物進行數(shù)據(jù)轉換，進而將電泳圖譜轉化一個僅包含“0”“1”的矩陣。采用NTSY Spc version 2.1軟件，運用非加權組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法進行聚類分析。

1.5 生物量的測定與樣品的提取

1.5.1 菌絲體的制備

使用前將保存菌種轉入新鮮斜面活化，于25 ℃活化1周；將活化的斜面瓊脂塊（1 cm2）接入液體種培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d[10]。液體種子按體積分數(shù)10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.5.2 生物量的測定

發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，收集菌絲體，用蒸餾水洗滌菌絲3次，離心后菌絲體冷凍干燥后，置于干燥器中保存。

1.5.3 樣品提取

菌絲體冷凍干燥后，以20、15、10、10倍蒸餾水在功率800 W，超聲提取4次，每次30 min，超聲時間5 s，間隔5 s。將4次提取液混合，60 ℃減壓濃縮至0.1 g/mL（即每0.1 g羊肚菌菌絲提取后濃縮至1 mL），－20 ℃保存。

1.6 胃黏膜保護作用比較

130只KM種小鼠，雌雄各半，隨機分為13組，給藥組每日灌胃羊肚菌水提液或子實體水提液2 g生藥/kg（即提取液20 mL/kg），空白組和模型組給予等量蒸餾水，小鼠連續(xù)灌胃9 d，實驗前1 d禁食不禁水24 h，第10天各組灌胃樣品30 min后，除空白組外，各組灌胃95%乙醇10 mL/kg，1 h后頸椎脫臼處死取胃，用磷酸鹽緩沖液沖洗胃內(nèi)雜質，每只灌注3 mL福爾馬林固定液后結扎幽門，置入福爾馬林固定液固定2 h。沿胃大彎剪開胃，在解剖鏡下記錄觀察胃黏膜損傷情況。按Guth評分標準，計算胃黏膜損傷指數(shù)，并計算損傷抑制率[12]。 0

為比較各個菌株之間的胃黏膜保護作用的差別，統(tǒng)計采用單因素方差分析，P＜0.05認為有顯著差異，各組之間的比較采用Duncan’s新復極差法比較。

2 結果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析

將表2中15個引物應用于正式實驗。通過15條引物對16個樣本的擴增（圖1），共得到擴增產(chǎn)物324條，無共有條帶，多態(tài)性100%。

圖1 16株羊肚菌擴增ISSR圖譜分析結果Fig.1 ISSR profile of 16 Morchella strains

2.2 聚類分析

采用UPGMA法構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，在相似系數(shù)0.51處截取聚類線，可將16株羊肚菌菌株可分為2組，即M15、M7、M13、M2、M1、M4、M5、M9等8株菌株一組，M16、M14、M12、M10、M8、M6、M3等8株菌株一組。

圖2 16株羊肚菌ISSR聚類樹Fig.2 Dendrogram of 16 Morchella strains based on ISSR bands

2.3 液體發(fā)酵生物量比較

圖3 16株羊肚菌液體發(fā)酵生物量比較Fig.3 Comparison of biomass among 16 Morchella strains

由圖3可知，16株羊肚菌的液體發(fā)酵生物量差異較大，其中羊肚菌M1的生物量最高，達9.4 g/L，其次為羊肚菌M2～M10，生物量在6～8 g/L之間，可以進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，羊肚菌M11～M16生物量較低，最高僅有2.12 g/L，M14～M16幾乎法進行液體培養(yǎng)。因此，在對酒精引起的急性胃黏膜損傷的保護作用比較實驗中，只選用生物量較高的羊肚菌M1～M10。

2.4 胃黏膜保護作用比較

圖4 小鼠胃黏膜損傷指數(shù)（n=10）=10Fig.4 Lesion index of gastric mucosa in mice ( (n=10)=10)

由圖4可知，灌胃羊肚菌M1、M2、M3、M7、M9以及羊肚菌子實體水提液的小鼠胃黏膜損傷指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05），其抑制率分別為82.39%、73.58%、73.58%、40.87%、32.71%和50.49%，羊肚菌M1、M2、M3效果最好，3組之間無顯著差異（P＞0.05）。羊肚菌M4、M5、M6、M8、M10損傷指數(shù)雖然低于模型組，但是與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

羊肚菌的人工栽培雖然已有成功報道[13-14]，但是成本高、工序復雜、重復性差等問題，至今仍無法大面積的推廣和應用。而羊肚菌液體發(fā)酵技術比較成熟[15-17]并且有著：原料來源廣泛，價格低廉；生產(chǎn)周期短；污染率低；無季節(jié)性等諸多優(yōu)勢，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有替代子實體開發(fā)的潛力。結果中也發(fā)現(xiàn)部分液體發(fā)酵菌絲體的胃黏膜保護作用較子實體強，其作用機制與增加胃黏液的分泌和抗氧化作用有關[18]。但是菌種之間的藥理作用是否具有差異尚未有研究報道。

通過對16株羊肚菌采用ISSR分子標記的擴增產(chǎn)物表明，ISSR多態(tài)性豐富，重復性較高。采用UPGMA法對ISSR結果進行分析發(fā)現(xiàn)2組羊肚菌的遺傳差異較大。遺傳背景上存在差異，導致它們代謝產(chǎn)物或活性物質存在差異，引起藥效的差異，有研究[19]表明，靈芝不同菌株間在主要成分和藥效上就存在明顯的差異。提示各組間羊肚菌在功效上也可能存在較大的差異。在其胃黏膜保護作用的比較研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌的這種生物活性在菌株間也存在較大差異，其中保護作用較強的有羊肚菌M1、M2和M3，保護作用較弱的羊肚菌菌株有M4、M5、M8和M10。通過后續(xù)的研究，經(jīng)形態(tài)學和內(nèi)轉錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）的鑒定方法將其中保護作用較強的羊肚菌M1鑒定為尖頂羊肚菌（M. conica）[20]。這種在親緣關系很接近的菌株中存在生物活性的較大差異的現(xiàn)象，可能是由于生長條件、生長方式和生長階段的不同導致的，具體原因尚有待研究。

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Genetic Differences and Gastric Protective Effect of Morchella Strains

WEI Wei1, YU Meng-yao1, XU Xiao-yan1, JIANG Nan1, YE Li-ming2, LUO Xia1,*
(1. Celluar and Molecular Laboratory of Chinese Materia Medica, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China; 2. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

In this study, inter-simple sequence repeats (ISSR) molecular labeling technology was used to explore the genetic diversity of Morchella strains on the basis of mycelium biomass in submerged culture, and their gastric protective effects on ethanol-induced acute gastric mucosal injury model in mice were compared. Results showed that 16 Morchella strains were divided into two groups. The biomass of M1－M10 was higher than that of other strains, and the gastric protective effect of M1, M2 and M3 was better than that of other strains. Mycelium biomasses and gastric protective effects varied in different Morchella strains.

Morchella; inter-simple sequence repeats (ISSR); biomass; gastric protective effects

S567.3

A

1002-6630（2014）07-0160-04

10.7506/spkx1002-6630-201407032

2013-04-29

菌類藥材研究與開發(fā)四川省青年科技創(chuàng)新團隊項目（2011JTD0021）；四川省“十二五”省農(nóng)作物育種攻關項目（2011NZ0098-12-04）；四川省科技廳食藥用菌現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關鍵技術研究集成與產(chǎn)業(yè)化示范項目（2012NZ0003）；四川省精深加工研究崗位建設項目（川農(nóng)業(yè)（2009）75號）

魏巍（1982—），男，助理研究員，博士，主要從事食藥用菌的研究與開發(fā)。E-mail：21822546@qq.com

*通信作者：羅霞（1974—），女，副研究員，博士，主要從事食藥用菌的研究與開發(fā)。E-mail：lx1443_cn@163.com