生草覆蓋蘋果園不同衰老時期葉片光合生理特性的比較

李芳東，呂德國，秦嗣軍，杜國棟，馬懷宇，劉國成

(1.沈陽農業大學 園藝學院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽市北方果樹栽培與生理生態重點實驗室，遼寧 沈陽110866；3.山東省煙臺市農業科學研究院，山東 煙臺 265500)

衰老是植物生長發育過程中由遺傳基因控制的高度有序的生理和生化變化，是植物完成其生命周期的一種防御或適應機制[1]，是一種可以調控的退化過程[2]。葉片是植物利用光能合成有機化合物的重要場所，也是植物衰老最敏感的器官之一；衰老是葉片生長發育的最終階段，主要特征為葉綠素和蛋白質、膜脂和RNA等大分子分解[3]以及營養物質再利用[4]等。研究表明，自然條件下葉片的衰老受生長發育時期、激素、營養物質水平等內在因素以及溫度、光照、水分及創傷和病原傷感染等外在因素的相互作用影響[5-6]。此外，葉片衰老與植物種植方式[7]、地面管理方式[8]等密切相關。目前相關研究大多主要集中在烤煙[7]、小麥[8]等1年生經濟作物上，關于蘋果葉片衰老方面的研究報道較少見。

‘寒富’(‘東光’ב富士’)是由沈陽農業大學1994年育成的抗寒、優質的大蘋果品種，將中國大蘋果栽植區域的北緣從N40°17′推進到了N42°75′，栽植面積達 7.5×104hm-2，大多栽植區秋季氣溫下降較快、冬季氣溫低。因此，增加秋季樹體貯藏營養水平對于果樹安全越冬及早春開花、坐果、展葉等發育過程至關重要。衰老過程中的光合能力及葉片養分降解向枝條等部位的回流狀態，直接影響果樹秋季節樹體貯藏水平。生草覆蓋是改善果園土壤環境和維持土壤肥力的有效方法之一，具有良好的生態效益和經濟效益，對于推動我國果樹產業可持續發展具有重要的意義[9]。因各產區氣候、立地條件差別較大，在草種選擇與利用上缺乏規范化技術，推廣應用步伐緩慢，仍處于試驗和研究階段；目前的研究主要集中在果園小氣候[10]、土壤理化性質[11]、果實品質[12]等對生草覆蓋的響應特性以及優勢草種的篩選[13]方面，進一步研究生草覆蓋條件下不同衰老時期葉片光合生理特性的差異可以為秋季葉片管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2011年在沈陽農業大學果樹試驗基地(41°83′ N，123°56′ E；海拔76.2m)進行。試驗蘋果園于2006年5月定植，品種為‘寒富/GM256/山定子’(Malus domesticaM./GM256/Malus baccata Borkh.)，南北行向，株行距為2.0m×4.0m，按照細長紡錘形整形。果園地面管理采用生草覆蓋，生草覆蓋采用自然生草種，主要包括馬唐、稗草、狗牙草、薺菜等；自然生草種在行間3.0m寬的范圍內自然繁殖；6月上旬至9月中旬，當草長至40～50cm高時留茬20cm刈割，每年刈割3～5次，并將刈割下的殘草覆蓋于行內(100cm寬)。

1.2 試驗方法

在2011年9月30日～11月9日晴天的08:30～11:00進行葉綠素含量、可溶性蛋白質含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、超氧陰離子(O2-·)含量、丙二醛(MDA)含量、凈光合速率(Pn)和葉綠素熒光參數的測定，每10d測定1次。每個處理選取樹勢中庸、生長一致的植株作為試驗用樹。

1.2.1 葉綠素含量的測定

每個處理選取5株樹，每株樹選取樹冠外圍同一高度5個新梢，每個新梢選取1片功能葉片(第6～8片)用于測量，共測定25個葉片，每次測定相同的葉片。采用LC-01型葉綠素儀(Hansatech Instruments公司，英國)測定葉綠素含量(相對值)。

1.2.2 凈光合速率的測定

每個處理3株樹，每株樹選取樹冠外圍南側同一高度3個新梢，每個新梢選取1片功能葉片用于測量，共測定9個葉片，每次測定相同的葉片。采用CIRAS-2便攜式光合測定系統(PP Systems公司，美國)測定凈光合速率。

1.2.3 葉綠素熒光參數的測定

每個處理選取5株樹，每株樹選取樹冠外圍南側同一高度的3個新梢，每個新梢選取1片功能葉片用于測量，共測定15個葉片，每次測定相同的葉片。葉片經葉夾暗適應30min后進行測量。采用多功能植物效率分析儀M-PEA(Hansatech Instruments公司，英國)測定葉片的葉綠素熒光參數，參照Strasser等[17]的方法命名和計算參數(見表1)；參照邱念偉等[18]的方法對Sm、N、Mo、ψo、φEo和Fv/Fm進行標準化處理。

1.2.4 其它參數的測定

每個處理選取5株樹，每株樹選取樹冠外圍同一高度3個新梢，每個新梢采取1片功能葉片放入冰盒中，迅速帶回實驗室，液氮速凍后放入-70℃保存；葉片分別從相同的植株上采取。采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白質含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量[14]；采用氮藍四唑(NBT)顯色法測定SOD活性[15]；采用羥胺氧化法測定O2-·含量[16]。

表1 葉綠素熒光誘導動力學曲線參數公式與中文名稱Table 1 Formulae and Chinese name of the parameters of chlorophyll fluorescence induction kinetic curve

1.3 數據分析

采 用 SPSS 12.0(SPSS Company，Chicago，IL)對數據進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan新復極差法檢驗差異顯著性；采用Excel 2003進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 葉綠素和可溶性蛋白質含量的比較

葉綠素和蛋白質的降解是葉片衰老的主要標志[19-20]。不同衰老時期蘋果葉片葉綠素和蛋白質含量的比較見表2。由表2可知，葉片葉綠素含量隨衰老程度的加劇呈顯著降低趨勢，可溶性蛋白質含量在衰老中期、中后期和后期顯著降低。衰老中后期葉片葉綠素和可溶性蛋白質含量分別為初期的55.0％和51.8％，后期兩者的含量分別為初期的5.5％和35.5％，說明后期葉綠素的降解速率高于可溶性蛋白質。

2.2 SOD活性、O2-·和MDA含量的比較

不同衰老時期蘋果葉片SOD活性、O2-·和MDA含量的比較見表3。由表3可知，葉片SOD活性隨葉片衰老程度的加劇呈先升高后下降的趨勢，O2

-·含量隨葉片衰老程度的加劇呈顯著遞增趨勢，MDA含量于衰老中期顯著遞增。說明衰老初期至中期，SOD活性的升高是對秋季氣溫降低和葉片衰老的適應性調節；衰老中后期和后期，由于O2

-·等活性氧的積累顯著升高并達到較高水平，開始攻擊SOD，使其活性顯著降低，并導致膜脂過氧化作用不斷增強。

表2 不同衰老時期蘋果葉片葉綠素和可溶性蛋白質含量的比較Table 2 Comparison of chlorophyll content and soluble protein content in apple leaves at different aging stages

表3 不同衰老時期蘋果葉片SOD活性、O2-·和MDA含量的比較Table 3 Comparison of SOD activity,and contents of O2-·and MDA in apple leaves at different aging stages

2.3 凈光合速率和熒光強度的比較

凈光合速率反映了葉片作為物質流的源制造和輸出同化物的潛在能力。不同衰老時期蘋果葉片凈光合速率和熒光強度的比較見表4。由表4可知，葉片凈光合速率(Pn)隨葉片衰老程度加劇呈先升高后降低變化。中前期葉片Pn的顯著升高可能是對秋季低溫和衰老的應激性調節，隨后顯著降低，說明葉片制造和輸出同化物的能力隨衰老程度的加劇明顯下降，衰老中期、中后期和后期葉片Pn分別為初期的94.8％、57.7％和2.8％，推測中后期可能是葉片制造和輸出同化物的能力衰減的半衰期，后期葉片制造和輸出同化物的能力基本喪失。

衰老初期至中期，初始熒光(Fo)和可變熒光Fk占Fj-Fo振幅的比例(Wk)無明顯變化、J相相對可變熒光(Vj)顯著升高、最大熒光(Fm)逐漸降低，表明PSⅡ受體側電子傳遞明顯受阻、接受電子的能力逐漸降低。在中后期，Fo和Wk仍無明顯變化、Vj變化平穩、Fm較初期顯著降低，表明PSⅡ受體側接受電子的能力明顯降低，說明PSⅡ的基本結構和功能受到嚴重破壞。后期，Fo較初期顯著降低、Wk較初期顯著升高、Vj較中后期急劇升高(為P相相對可變熒光的81.6％)、Fm較中后期急劇降低(為初期的26.8％)，表明PSⅡ受體側放氧復合體和受體側受到嚴重損傷、受體側接收電子的能力基本喪失，說明PSⅡ基本結構受到嚴重破壞、功能基本喪失。熒光強度(Fo、Wk、Vj和Fm)的變化進一步證實了中后期為葉片制造和輸出同化物的能力衰減的半衰期。

表4 不同衰老時期蘋果葉片凈光合速率和熒光強度的比較Table 4 Comparison of Pn and fluorescence intensity of apple leaves at different aging stages

2.4 PSⅡ受體側功能的比較

Sm、N、Mo、ψo、φEo、φPo等參數主要反映了PSⅡ受體側的變化，PSⅡ受體側主要包括QA、QB、PQ庫等[21]，數值標準化處理后可以更直觀地比較PSⅡ受體側參數的變化[18]。不同衰老時期蘋果葉片PSⅡ受體側功能的比較如圖1所示。由圖1可知，衰老初期至中期，葉片Sm、N和Mo逐漸升高，說明葉片衰老程度逐漸增強；隨后Sm顯著降低，表明葉片衰老程度越重，QA被還原所需要的能量越少，Mo和N的下降表明葉片衰老程度越重，QA被還原的速率和次數均迅速減少。衰老初期至中后期，Fv/Fm變化平穩，φEo于中前期顯著降低并保持較高水平，ψo于中前期和中期顯著降低并保持較高水平，表明QA下游的電子傳遞接受的能量和占總能量的比值隨衰老程度的加劇均下降，說明光合機構通過調控Fv/Fm來維持較高水平的ψo和φEo，該階段細胞仍然維持PSⅡ的功能活性。衰老后期，ψo、φEo和φPo急劇下降，分別為初期的29.7％、11.3％和38.0％，說明PSⅡ的功能基本喪失。

圖1 不同衰老時期蘋果葉片PSⅡ受體側功能的比較Fig.1 Comparison of PSⅡ acceptor side function of apple leaves at different aging stages

3 討 論

活性氧的產生是植物細胞對非生物脅迫和衰老最早的響應之一[20]；葉片衰老與活性氧積累呈正相關，而植物體內的抗氧化酶活性反映了植物對活性氧的清除能力[22]。文中結果表明，生草覆蓋條件下蘋果葉片O2-·和MDA含量隨葉片衰老程度的加劇不斷升高，SOD活性呈先升高后降低變化，于衰老中期達到最大值(見表3)。衰老初期至中期，SOD活性的升高是對秋季氣溫降低和葉片衰老的適應性調節，MDA含量逐漸升高，表明仍有過剩的活性氧啟動了膜脂過氧化；中后期和后期，由于O2-·等活性氧的積累顯著升高并達到較高水平，開始攻擊SOD，使其活性顯著降低，MDA含量為前期的3.3倍和3.9倍，表明此時活性氧的酶促清除系統嚴重受損，使膜脂過氧化嚴重，造成膜系統功能和結構的損傷[22]。

蛋白質降解是植物衰老的第一步，活性氧是啟動蛋白質降解的主要因素之一；降解的蛋白質主要是以酶的形式存在的可溶性蛋白質，其中RuBP羧化酶約占可溶性蛋白的50％，在脅迫和衰老過程中RuBP羧化酶會快速、選擇性地降解；因此，可溶性蛋白質的降解標志著以RuBP羧化酶為主的各類酶含量不斷降低[20,24]。葉綠體是蛋白質降解的主要場所，也是活性氧破壞的主要目標[20]。因此葉綠素降解是衰老的原發過程及衰老的真正標志，葉綠素含量迅速降低是葉片老化最重要的特征[19,25]。Pn則反映了葉片作為物質流的源制造和輸出同化物的潛在能力。本試驗中，衰老中后期葉片葉綠素、可溶性蛋白質含量和Pn分別為初期的55.0％、51.8％和57.7％，推測衰老中后期可能是葉片光合能力衰減的半衰期。

脅迫對光合電子傳遞的干擾誘發了活性氧的升高，通過PSⅡ熒光誘導動力學可以更深入分析葉片衰老過程中PSⅡ功能和結構的變化[26]。衰老初期至中期，Vj顯著升高、Fm逐漸降低，表明PSⅡ受體側電子傳遞明顯受阻、接受電子的能力逐漸降低；中后期，Vj變化平穩、Fm較初期顯著降低，說明PSⅡ的基本結構和功能受到嚴重破壞；后期，Fo較初期顯著降低、Wk較初期顯著升高、Vj較中后期急劇升高、Fm較中后期急劇降低，表明PSⅡ受體側放氧復合體和受體側受到嚴重損傷、受體側接收電子的能力基本喪失，說明PSⅡ基本結構受到嚴重破壞、功能基本喪失(見表4)。Fo、Wk、Vj和Fm的變化進一步證實了中后期為葉片制造和輸出同化物的能力衰減的半衰期。ψo、φEo和Fv/Fm的變化表明，衰老初期至中后期光合機構通過調控Fv/Fm來維持較高水平的ψo和φEo，該階段細胞仍然維持可以PSⅡ的功能活性；后期ψo、φEo和Fv/Fm分別為初期的29.7％、11.3％和38.0％，說明PSⅡ的功能基本喪失(圖1)。ψo、φEo和φPo的變化表明，中后期為PSⅡ的功能喪失的臨界期。因此，秋季采取蘋果葉片管理措施應于衰老中期進行。

4 結 論

蘋果葉片合成光合產物的能力隨葉片的衰老而逐漸降低。在衰老中后期，盡管光合機構通過調控Fv/Fm來維持較高水平的ψo和φEo，PSⅡ的基本結構和功能仍受到嚴重破壞；后期葉片PSⅡ的基本結構受到嚴重破壞、功能基本喪失。

[1] Procházková D,Wilhelmová N.Leaf senescence and activities of the antioxidant enzymes [J].Biologia Plantarum,2007,51(3):401-406.

[2] 蘇冬梅,楊定海,馮兆云,等.銀杏葉片衰老與調節的生理生化變化[J].經濟林研究,2001,19(1): 4-6.

[3] Thomas H,Ougham H J,Wagstaff C.Defining senescence and death [J].Journal of Experimental Botany,2003,54(385):1127-1132.

[4] Himelblau E,Amasino R M.Nutrients mobilized from leaves of Arabidopsis thaliana during leaf senescence [J].Journal of Plant Physiology,2001,158(10): 1317-1323.

[5] Hensel L L,Grbic V,Baumgarten D A,et al.Developmental and age-related processes that in fl uence the longevity and senescence of photosynthetic tissues in Arabidopsis [J].The Plant Cell,1993,5(5): 553-564.

[6] LEE R H,WANG C H,HUANG L T,et al.Leaf senescence in rice plants: cloning and characterization of senescence upregulated genes[J].Journal of Experimental Botany,2001,52(358): 1117-1121.

[7] 楊鐵釗,楊志曉,柯油松,等.不同種植模式對烤煙根系和葉片衰老特性的影響[J].應用生態學報,2009,20(12):2977-2982.

[8] 魚 歡,馮佰利,張 英,等.不同栽培模式下冬小麥葉片衰老與活性氧代謝研究[J].作物學報,2007,33(10):1729-1732.

[9] 呂德國,秦嗣軍,杜國棟,等.果園生草的生理生態效應研究與應用[J].沈陽農業大學學報,2012,43(2):131-136.

[10] 孟 林,俞立恒,毛培春,等.蘋果園間種鴨茅和白三葉對園區小環境的影響[J].草業科學,2009,26(8):132-136.

[11] 李會科,張廣軍,趙政陽,等.渭北黃土高原旱地果園生草對土壤物理性質的影響[J].中國農業科學,2008,41(7):2070-2076.

[12] 李國懷,伊華林.生草栽培對柑橘園土壤水分與有效養分及果實產量、品質的影響[J].中國生態農業學報,2005,13(2):161-163.

[13] 邱昌朋,王 憶,張新忠,等.北京郊區蘋果園生草栽培適宜草種的篩選與評價[J].中國果樹,2012,(2):18-22.

[14] 李合生.現代植物生理學[M].北京:高等教育出版社,2002:85-111.

[15] Parida A K,Jha P B.Antioxidative defense potential to salinity in the euhalophyte Salicornia brachiata[J].Journal of Plant Growth Regulation,2010,29(2): 137-148.

[16] 孔祥生,易現峰.植物生理實驗技術[M].北京:中國農業出版社,2008,126-260.

[17] Strasser R J,Tsimilli-Michael M,Srivastava A.Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient [C]// Papageorgiou G,Govindjee.Chlorophyll Fluorescence: A Signature of Photosynthesis.Netherlands: Kluwer Academic Publishers,2004:321-362.

[18] 邱念偉,周搖峰,顧祝軍,等.5種松屬樹種光合功能及葉綠素快相熒光動力學特征比較[J].應用生態學報,2012,23(5):1181-1187.

[19] Buchanan-Wollaston V.The molecular biology of leaf senescence[J].Journal Experiment Botany,1997,48(307):181-199.

[20] Khanna-Chopra R.Leaf senescence and abiotic stresses share reactive oxygen species-mediated chloroplast degradation[J].Protoplasma,2012,249(3): 469-481.

[21] 李鵬民,高輝遠,Strasser R J.快速葉綠素熒光誘導動力學分析在光合作用研究中的應用[J].植物生理學與分子生物學,2005,31(6): 559-566.

[22] 劉群龍,王 朵,吳國良,等.硒對酥梨葉片衰老及抗氧化酶系統的影響[J].園藝學報,2011,38(11): 2059-2066.

[23] 尚慶茂,陳淑芳,張志剛.硒對高溫脅迫下辣椒葉片抗氧化酶活性的調節作用[J].園藝學報,2005,32 (1): 35-38.

[24] Wang Hong,Gu Min,Cui Jin-xia,et al.Effects of light quality on CO2assimilation,chlorophyll-fl uoescence quenching,expression of Calvin cycle genes and carbohydrate accumulation inCucumis sativus[J],Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2009,96(1): 30-37.

[25] Zheng Shao-qing,Ceng Guang-wen.Senescence of plant leaf and the molecular approach for its delaying[J].Acta Phytophysiologica Sinica,1999,35(2): 152-157.

[26] Diaz-Vivancos P,Clemente-Moreno M J,Rubio M,et al.Alteration in the chloroplastic metabolism leads to ROS accumulation in pea plants in response to plum pox virus[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(8): 2147-2160.