培養基成分對仁用杏花粉離體萌發的影響

金亞征，忻龍祚，王建民，俞鳳芳

(河北北方學院 園藝系，河北 張家口 075000)

仁用杏是以杏仁為主要產品的杏屬果樹的總稱。杏仁包括甜杏仁和苦杏仁2種，蛋白質、粗脂肪、礦物質、不飽和脂肪酸等含量高，此外，杏仁中還含有胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸等藥用成分，具有較高的食用價值和藥用價值[1]。主要分布在河北、遼寧、甘肅、內蒙、山西、山西、新疆等地，是我國的優勢經濟樹種。我國是唯一生產和出口杏仁的國家，全球對仁用杏的需求量越來越多，市場前景十分廣闊[2]。但目前仁用杏生產存在產量低、產量不穩、出仁率低、品質差等問題，供需矛盾突出[3]。造成仁用杏坐果率低的主要原因是凍花凍果[4-6]、花器官敗育[6-9]、開花特性[10]、管理粗放[11]等。文中以仁用杏‘優一’為材料，探尋仁用杏花粉萌發適宜培養基的成分及濃度，以期為提高仁用杏坐果率、降低花粉敗育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為仁用杏‘優一’品種。于大蕾期選擇10株長勢均勻的樹體，在樹體不同部位隨機采集含苞待放的花朵數朵，組成混合樣，帶回室內。用鑷子撥開花瓣，取下花藥，放到硫酸紙上，在室內自然陰干，待花藥炸裂時收集花粉，將花粉過篩去除雜質，收集到指形離心管中，裝入黑色塑料袋中保存到溫度為-25℃的冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗方案

(1)單因素試驗 單因素試驗均采用固體瓊脂培養基(瓊脂0.1g·L-1)，分別為蔗糖、硼酸(各處理添加1g·L-1蔗糖)、二水合氯化鈣(各處理添加1g·L-1蔗糖)、赤霉素素(純度≥98％，各處理添加1g·L-1蔗糖)處理，最后用1 mol/L的NaOH、HCl將所有處理的培養基pH值調至5.2。單因素試驗各處理的濃度梯度如表1所示。

表1 單因素試驗各處理的濃度梯度Table 1 Concentration gradient of each treatment under single factor experiment

(2)正交試驗 在單因素試驗的基礎上采用L25(56)正交試驗設計。

1.2.2 培養方法

將熬制好的花粉培養基用玻璃棒均勻滴到凹形載玻片上，用消毒后的頭發絲蘸取花粉均勻涂抹到培養基上，播好的玻片放到有濕潤濾紙的培養皿中，置于人工氣候箱中培養，氣候箱的溫度設為25℃，濕度30％，光照調為0，在暗環境里開始培養，單因素試驗6h后統計花粉萌發率，正交試驗分別培養2、4、6h，其間進行觀察，每個處理重復3次。

1.2.3 數據統計與分析

在10×10顯微鏡下觀察統計。花粉管長度等于或超過花粉粒直徑視為已萌發，每處理統計5個視野，每個視野花粉不少于50粒，至少3個重復。花粉培養6h后，每個視野隨機選擇10條已萌發的花粉管用目鏡測微尺測量長度，3次重復，同時用奧林巴斯CX21相機照相。

花粉萌發勢＝(規定時間內花粉萌發數/花粉萌發總數)×100％。

方差分析采用SPSS軟件，多重比較用duncan法(新復極差法)。

2 結果與分析

2.1 單因素處理對‘優一’花粉萌發的影響

2.1.1 蔗糖對‘優一’花粉萌發的影響

‘優一’在不同體積分數蔗糖培養基上花粉萌發率隨著蔗糖體積分數的增加呈現先增后減的趨勢(見圖1)。適宜的蔗糖體積分數可以明顯提高‘優一’花粉的萌發率，15％的蔗糖是‘優一’花粉萌發的較適宜體積分數，花粉萌發率達27.1％，較其它處理在0.05水平上差異顯著。當蔗糖體積分數超過15％，花粉萌發率開始下降，高體積分數蔗糖則抑制了花粉的萌發，但仍高于低體積分數5％、10％的萌發率，在0.05水平上差異顯著。

圖1 不同蔗糖濃度下‘優一’花粉的萌發率Fig.1 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different volume fractions of sucrose

2.1.2 硼酸對‘優一’花粉萌發的影響

在10％蔗糖瓊脂培養基中添加不同質量濃度的硼酸，隨著硼酸質量濃度的增加，‘優一’花粉萌發率有顯著增加，當硼酸質量濃度達0.003g·L-1時，花粉萌發率達到最高值38.8％，較其它質量濃度處理在0.05水平上差異顯著。當硼酸質量濃度超過0.003g·L-1時，花粉的萌發率開始下降，高質量濃度的硼酸抑制了花粉的萌發(見圖2)。

圖2 不同硼酸質量濃度下‘優一’花粉的萌發率Fig.2 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different mass concentrations of boric acid

2.1.3 二水合氯化鈣對‘優一’花粉萌發的影響

在10％蔗糖瓊脂培養基中添加不同質量濃度的Ca2+，‘優一’花粉的萌發率如圖3所示。由圖3可知，低質量濃度的Ca2+可增加‘優一’花粉萌發率，較高質量濃度的Ca2+則明顯抑制了花粉的萌發。當二水合氯化鈣質量濃度從0.000 1g·L-1增加到0.000 2g·L-1，‘優一’花粉萌發率從14.5％增加到19.3％，隨著二水合氯化鈣質量濃度的增加花粉的萌發率開始呈現下降趨勢，花粉萌發率明顯低于0.000 2、0.000 1g·L-12個處理的萌發率，差異均達到顯著水平。

圖3 不同鈣離子質量濃度下‘優一’花粉的萌發率Fig.3 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different Ca2+ mass concentrations

2.1.4 赤霉素對‘優一’花粉萌發的影響

在10％蔗糖瓊脂培養基中添加不同質量濃度的GA3，‘優一’花粉的萌發率如圖4所示。隨著赤霉素質量濃度的增加，花粉萌發率的增加趨勢明顯，當GA3質量濃度為0.000 8g·L-1時花粉萌發率最高34.9％，與其它處理的萌發率在0.05水平上均有顯著差異。當GA3質量濃度超過0.000 8g·L-1時，花粉萌發率開始下降，高濃度的赤霉素濃度抑制了‘優一’花粉的萌發。

圖4 不同GA3質量濃度下‘優一’花粉的萌發率Fig.4 ‘Youyi’pollen germination rates under the conditions of different mass concentrations of GA3

2.2 單因素處理對‘優一’花粉管生長的影響

2.2.1 花粉管長度

蔗糖、10％蔗糖+硼酸、10％蔗糖+二水合氯化鈣、10％蔗糖+赤霉素不同質量濃度對‘優一’花粉管生長有不同影響，結果如圖5所示。蔗糖、10％蔗糖+硼酸、10％蔗糖+氯化鈣3種單因素處理對‘優一’花粉管生長的影響表現一致，即均隨著蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣質量濃度的升高表現為“先增后減”的趨勢，即低質量濃度促進生長，高質量濃度抑制生長。當蔗糖質量濃度為15％時，花粉管最長為796.7 μm，當硼酸質量濃度為0.002g·L-1時花粉管最長為905.0 μm，當二水合氯化鈣濃度為0.000 4g·L-1時花粉管最長為971.7 μm。10％蔗糖＋赤霉素處理的表現與前三者不同，表現為隨著赤霉素質量濃度增加，花粉管的生長始終呈現增長趨勢，赤霉素質量濃度從0.000 5g·L-1增加到0.000 9g·L-1時，花粉管長從1 282.3 μm增長至1 669.0 μm(見圖5)。

2.2.2 花粉管生長

‘優一’在蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣、赤霉素不同培養基上，10％蔗糖＋赤霉素培養基上花粉管生長量、長度、節間生長量明顯要高于其它3個處理。花粉管在低質量濃度蔗糖培養基上，花粉壁破裂現象明顯，花粉管頂端破裂，釋放出大量內含物，隨著蔗糖質量濃度的增加，花粉管破裂現象逐漸消失。在10％蔗糖里添加了硼酸、鈣離子和赤霉素的培養基上，無花粉管壁破裂現象。經4種處理培養后比較，在10％蔗糖＋赤霉素培養基上花粉管生長量、長度和節間生長量明顯高于其它3個處理(見圖6)。

圖5 單因素處理下‘優一’花粉管的長度Fig.5 ‘Youyi’pollen tube lengths under the conditions of single factor treatments

2.3 正交試驗各處理對‘優一’花粉萌發的影響

‘優一’花粉萌發L25(56)正交試驗結果如表2所示，4因素5水平25個水平組合的正交處理對‘優一’花粉萌發率的影響不同。培養2h的情況下，以處理14即0.1g·L-1瓊脂＋10％蔗糖＋0.003g·L-1硼酸＋0.000 0g·L-1二水合氯化鈣＋0.000 6g·L-1赤霉素組合的萌發率最高，達到了38.8％，較其它24個處理組合在0.05水平上差異顯著，其次表現較好的組合是處理19、22、20、13、12。培養4h的情況下，以處理14的萌發率最高(42.4％)，與其它24個處理組合在0.05水平上差異顯著，其次表現較好的是處理19和24，萌發率分別達到了39.9％和38.4％。培養6h的情況下，處理14、24、22、20的萌發率分別為47.4％、47.3％、45.2％、43.7％，4個處理在0.05水平上無顯著差異，高于其它21個處理組合且差異顯著。花粉萌發勢結果表明，‘優一’花粉在所觀察的3個時間段中，25個處理組合在培養2h時，花粉萌發率均超過了50％，其中有5個處理達到90％以上，最高的達到96.9％，10個處理達到80％以上，其余的10個處理達到58％～70％；培養4h時，14個處理到了90％以上，最高達99.7％，9個處理達80 ％以上，僅1個處理為74.3％。同時，極差R分析結果表明，培養2、4、6h時，各因素的表現一致，均為蔗糖＞硼酸＞二水合氯化鈣＞赤霉素(見表3)。

圖6 單因素處理下培養6h‘優一’花粉管生長情況Fig.6 Growth status of ‘Youyi’pollen tube cultivated for six hours under the conditions of single factor treatments

表2 ‘優一’花粉萌發L25(56)正交試驗結果?Table 2 Result of L25(56)orthogonal test of ‘Youyi’pollen germination

表3 ‘優一’花粉萌發L25(56)正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of ‘Youyi’pollen germination in the L25(56)orthogonal test

3 結論與討論

花粉離體萌發大多采用蔗糖作為基本培養基，蔗糖除了能為花粉萌發提供營養外,還可以調節花粉的滲透壓[12]。當培養基中蔗糖體積分數高于花粉內部的滲透壓時，花粉會發生質壁分離現象，使花粉萌發受到抑制；而蔗糖體積分數過低時又會造成花粉壁破裂，表現為花粉管頂端破裂，花粉內含物溢出[13]。本研究結果表明，‘優一’花粉隨著蔗糖體積分數的增加，花粉萌發率、花粉管伸長長度均表現“先增后減”的趨勢；且在低體積分數蔗糖培養基中，有部分萌發的花粉管頂端爆裂，有明顯內含物明顯溢出的現象，隨著蔗糖體積分數增加，花粉壁破裂現象消失。適宜的蔗糖體積分數花粉管生長健壯，花粉的內外滲透壓才能保持平衡，維持正常的生活力，有利于萌發。

硼的主要作用是參與花粉管頂端細胞壁的形成，增加糖的吸收、運轉和代謝，形成糖硼酸復合體，增加氧的吸收，對迅速伸長的花粉管膜中果膠物質的合成起作用。一般在自然條件下，花粉本身含有一定量的硼，但是含量遠不夠滿足自身萌發的需要，花粉中自身硼的含量是不足的，往往需要由柱頭和花柱內的硼來補償[14]。文中‘優一’花粉在10％蔗糖的離體培養上加入微量元素硼，隨著硼質量濃度的增加，對花粉萌發及花粉管的伸長具有明顯促進作用，花粉的萌發率最高達到38.8％，比適宜的單一蔗糖體積分數下的萌發率27.1％要高，說明在蔗糖培養基中補充一定質量濃度的硼元素是必要的。

Ca2+主要影響花粉萌發的速度和花粉管生長速度，且能誘導花粉管產生一定的趨向性，從而保持頂端的極性生長。一般認為，由于花粉內存在較多的Ca2+，而缺乏硼素，因此花粉萌發時，胞外Ca2+對花粉萌發率的影響不及硼素顯著[15]。文中試驗結果與此觀點一致。鈣離子質量濃度對‘優一’花粉萌發率和花粉管生長長度的影響與硼酸質量濃度的變化趨勢一致，但所需的鈣離子質量濃度遠小于硼離子質量濃度，且10％蔗糖培養基中加入鈣離子的萌發率比加入硼元素后的萌發率低，但就花粉管生長速度及花粉管生長長度的促進作用來說，鈣離子優于硼元素。

赤霉素能抑制植物體內生長素分解系統的活動，以保證體內生長素含量水平，因此，一定質量濃度的外源赤霉素處理，能促進花粉萌發和花粉管生長[16]。本試驗在10％蔗糖培養基中添加少量赤霉素，赤霉素在一定質量濃度范圍內對花粉離體萌發起促進作用，超過一定質量濃度后萌發率則降低。而在赤霉素質量濃度0.000 5～0.000 9g·L-1設定范圍內，隨著赤霉素質量濃度增加，花粉管伸長始終呈現增長趨勢，增長幅度遠大于其它3個處理。超高質量濃度的赤霉素是否會抑制‘優一’花粉管伸長還有待進一步研究。

蔗糖、硼酸、二水合氯化鈣、赤霉素L25(56)正交試驗結果表明，0.1g·L-1瓊脂＋1g·L-1蔗糖＋0.003g·L-1硼酸＋0.000 0g·L-1二水合氯化鈣＋0.000 6g·L-1赤霉素組合培養2～6h時‘優一’花粉萌發率均表現最高，是花粉萌發的最佳組合。‘優一’花粉在20種組合離體條件下培養2h時，花粉萌發率均超過50％，培養4h時，有14個處理的花粉萌發勢達90％以上。此結果表明，‘優一’花粉在適宜萌發條件下，培養2～4h是花粉萌發的高峰期，且蔗糖、硼酸是影響花粉萌發的最關鍵因素。

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