動物基因是如何轉移的？

冬雪

通過基因工程技術把外源性目標基因導入某種受體動物的生殖細胞、胚胎干細胞和早期胚胎，并在其染色體上穩(wěn)定整合，之后經(jīng)過各種發(fā)育途徑把外源性基因傳遞到子代，這就是動物的轉基因，或稱轉基因動物。

外源性基因導入受體動物有不同的方法，同時，由于有不同的受體動物，因此要根據(jù)實際情況采用不同的方法對動物進行轉基因。大致而言，動物轉基因的方法有：逆轉錄病毒法、顯微注射法、胚胎干細胞介導法、精子載體法和體細胞核移植法（體細胞克隆介導法）等。

通過逆轉錄病毒轉移基因

研究人員早就發(fā)現(xiàn)，逆轉錄病毒常常能侵入宿主細胞并整合于細胞中的DNA，因此逆轉錄病毒被用來當成載體以進行外源性基因的轉移。一般做法是，把外源性基因插入到逆轉錄病毒，再由逆轉錄病毒感染受體動物的胚胎。此后將感染的桑椹期胚胎導入動物子宮，就可發(fā)育成攜帶外源性基因的子代動物。

具體的原理是，逆轉錄病毒的核酸在逆轉錄酶作用下會反轉錄為雙鏈DNA，然后整合到受體細胞核基因組中。由于逆轉錄病毒DNA的長末端重復序列（LTR）區(qū)域具有轉錄啟動子活性，如果把外源基因連接到LTR下部進行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，加入到動物早期胚胎的培養(yǎng)液中，或與胚胎共同培養(yǎng)，或注入囊胚腔中，攜帶外源性基因的逆轉錄病毒DNA就可以整合到宿主染色體上，達到外源性基因轉移到受體動物胚胎的目的。

2001年，美國哥倫比亞大學的帕克等人利用逆轉錄病毒將綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉入豬的成纖維細胞和耳上皮細胞，然后用這些細胞的細胞核進行核移植，獲得了能發(fā)出綠色熒光的轉基因豬。與此同時，其他研究人員利用這種方法培育出轉基因猴。

但是，逆轉錄病毒作為載體具有潛在的致癌性，而且載體的構建較為復雜，容納外源性基因的大小也有限，因此這項技術的應用受到一定限制。

顯微注射法轉移基因

動物轉基因的顯微注射法又稱受精卵原核顯微注射法，是用直徑約0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受體動物的受精卵的細胞內，將外源性基因注入細胞中，然后通過受體動物基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復制或易位等，使外源性基因嵌入受體動物的染色體內，最后這樣的胚胎移植到代孕母體子宮內并發(fā)育成子代個體。

1980年美國的戈登等人首先用顯微注射法創(chuàng)造了轉基因小鼠。他們把小鼠的受精卵取出來，在顯微鏡下將胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的細胞中，然后將受精卵輸入代孕母鼠的子宮內，最終發(fā)育成轉基因小鼠。此后研究人員相繼把人的珠蛋白基因和胰島素基因轉入小鼠體內。

顯微注射法的優(yōu)點是，動物的任何外源性基因都可轉入受體動物體內，而且用這種方法已經(jīng)獲得轉基因小鼠、魚、大鼠、兔子以及轉基因牛、羊、豬等。但是，這種方法轉移外源性基因到受體動物的染色體時是隨機整合的，因而難以控制其整合率。另外對外源性基因能否穩(wěn)定整合于受體基因組的檢測必須等到子代個體出生后才能進行和確認，不利于在生育期長、產(chǎn)仔少的大家畜中應用。

胚胎干細胞介導法

胚胎干細胞（ES）是從哺乳動物囊胚期內的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織。20世紀80年代中期研究人員就開始利用胚胎干細胞進行動物轉基因。方法是，將外源性基因直接導入胚胎干細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體胚胎，與其中的胚胎細胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。

此后，這種胚胎可發(fā)育成嵌合體的轉基因動物，這種動物體內有一部分組織來源于整合有外源性基因的供體胚胎干細胞。在嵌合過程中，從胚胎干細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將轉入的外源性基因傳遞到子代。

研究證明，胚胎干細胞介導法可使受體動物細胞中外源性基因整合率達50%，其中生殖細胞中外源性基因整合率可達30%。但是，建立胚胎干細胞系比較困難，現(xiàn)在只建立了小動物的胚胎干細胞系，豬、羊、牛等大型動物的胚胎干細胞系尚未建立。

精子載體法

早在1971年，研究人員就發(fā)現(xiàn)，外源性基因可以進入動物精子。后來，研究人員將精子反復冷凍或經(jīng)化學物質處理后與外源性基因共同孵育，使外源性基因與精子結合，通過人工授精獲得轉基因個體。

1989年，意大利研究人員拉維特拉諾將小鼠附睪精子與線粒體或環(huán)狀pSV2CAT質粒一起在37℃下孵育30分鐘，再用這種精子對成熟卵子進行體外授精，這樣得到胚胎移植入受體鼠的子宮孕育，通過受體鼠孕育產(chǎn)出250只小鼠，以CAT基因為標記進行檢測，發(fā)現(xiàn)有30%的小鼠成為轉基因鼠。

目前研究人員通過精子載體法已獲得了12種轉基因動物，如轉基因牛、豬、家兔和小鼠等。但是，這種方法進行動物轉基因的成功率不高，效果也不穩(wěn)定，還有待進一步研究和發(fā)展。其中，必須弄清楚精子和外源性基因結合的分子機制，外源性基因在精子和受精卵內的復制機理，以及促進精子結合外源性基因的方法和途徑。

體細胞核移植法

體細胞核移植法又稱體細胞克隆介導法，原理是，將外源性基因導入動物體細胞染色體中，然后通過顯微操作技術將轉入了外源性基因的細胞核移植到去核的卵母細胞中構成一個重建卵子，然后用人工方法讓這個卵子發(fā)育，形成胚胎，再把胚胎移植到受體動物中，經(jīng)妊娠、分娩后獲得轉基因克隆動物。

利用體細胞核移植法是目前動物轉基因中的高級技術，1997年世界上第一個轉基因綿羊（克隆羊）多利就是用這種方法產(chǎn)生的，是英國PPL公司與羅斯林研究所率先應用體細胞核移植法獲得的成果。

多利誕生的過程和原理可以詳細解釋體細胞核移植法進行的動物轉基因。

研究人員先從一只6歲的芬蘭多塞特雌性白面綿羊（簡稱A）的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細胞逐漸停止分裂，這個細胞稱為供體細胞。此后，研究人員從一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱B）的卵巢中取出未受精的卵子，并將細胞核去除，使這個卵子成為一個無細胞核的卵細胞，也稱為受體細胞。

然后，研究人員利用電脈沖方法讓供體細胞和受體細胞融合，在這個過程中A細胞的細胞核融入B細胞中并像受精卵一樣產(chǎn)生細胞分裂、分化，從而形成胚胎。最后將這個胚胎移植到另一只蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱C）的子宮內，胚胎正常發(fā)育，足月孕育后綿羊C娩出小綿羊多利。

從這個過程可以看出，多利的主要遺傳物（細胞核DNA）來自多塞特雌性白面綿羊（A），當然，多利身上還有來自蘇格蘭黑面雌性綿羊（B）的線粒體DNA，因為B細胞盡管去除了細胞核，在其細胞質中還有多種細胞器，其中就含有線粒體，線粒體也是一種遺傳物質。所以，多利有3位母親，一是基因母親多塞特白面母綿羊（A）；第二個是借卵母親，也稱線粒體母親，即剔除了細胞核的蘇格蘭黑面綿羊（B），胚胎是在B的卵子中借殼融合、分裂、發(fā)育而成的；第三個是代孕母親，即另一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（C），多利是在綿羊C的子宮中孕育并分娩的。

從這個意義上看，這樣的轉基因實際上轉移了多塞特雌性白面綿羊（A）的全部細胞核的基因組。由于多利沒有父親，是通過無性繁殖即克隆而來，因此這樣的轉基因方法也稱為體細胞克隆介導法。

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