DPPH法評價抗氧化活性研究進展

韋獻雅，殷麗琴，鐘 成，章明海，牛應澤,*

DPPH法評價抗氧化活性研究進展

韋獻雅1，殷麗琴1，鐘 成2，章明海1，牛應澤1,*

（1.四川農業大學油菜研究中心，四川 成都 611130；2.四川農業大學玉米研究所，四川 成都 611130）

植物化合物或植物提取物的抗氧化活性的體外評價是研究功能因子的一個重要方面。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法常用于評價化合物或植物提取物的抗氧化活性，但由于沒有一個標準化的方法，因而不同實驗的結果難于相互比較。本文從DPPH法的原理、測定方法、檢測波長、DPPH初濃度、反應時間、清除率計算公式、結果表達、評價指標等幾個方面對DPPH法做歸納總結，分析幾種外界因素對DPPH法的影響，有助于研究者提高認識，從而準確的開展研究工作。

DPPH法；自由基；抗氧化劑；抗氧化活性

近年來自由基生物學快速發展，廣泛觸及生命科學領域，其主要探究自由基的組成、清除和自由基對生物學系統的損害。目前已明確一系列由自由基造成的疾病機理，如動脈粥樣化、神經變性、慢性抑郁癥、癌癥和生理學衰老[1]。抗氧化劑具有清除自由基的作用，對人體健康有益，已廣泛用于食品工業中。體外評價和篩選物質抗氧化活性的方法有很多，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法、2,2’-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid） ammonium sal t，ABTS）法、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法、鐵離子還原法（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法[2]等。與其他相比，DPPH法有穩定性好、靈敏度高、操作簡單等優點[3-4]。DPPH法已在全世界范圍內被廣泛用于自由基清除能力的定量分析[2]。

Blois[5]最先報道了DPPH法，發現DPPH自由基能被硫代半胱氨酸和其他活性物質清除。此后，Brand-Williams 等[6]對DPPH法作了進一步修訂，使之成為評價體外抗氧化活性的重要途徑。然而到目前為止DPPH法并沒有一個標準化的實驗程序，尤其在反應時間、體積比、DPPH自由基初濃度、結果表達等方面，使得很難比較不同實驗室、不同操作程序的結果[2,7-8]。本文主要從DPPH法的原理、 測定方法、檢 測波長、DPPH自由基初濃度、反應時間、清除率計算公式、結果表達、評價指標等幾個方面做歸納總結，并介紹幾種外界因素對DPPH法的影響，以期為廣大研究者提供一定的參考。

1 DPPH法原理

DPPH自由基是一種人工合成的、穩定的有機自由基，分子式為C12H12N6O6（Mr=394.32），其結構中含有3個苯環，1個N原子上有一個孤對電子（圖1）[9]。其甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，并在515～520 nm范圍有最大吸收峰[5-6]。當向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對電子被配對，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數量成定量關系，因而可以通過吸光度的變化進行定量分析[10-11]。清除DPPH自由基是DPPH法的根據[12]。

圖1 DPPH自由基的化學結構Fig.1 Chemical structure of DPPH free radical

根據反應機制可將評價抗氧化能力的方法基本分為兩種：基于H原子轉移（H-atom transfer， HAT）的反應和基于電子轉移（electron transfer，ET）的反應[13-14]。以酚類物質（ArOH）為例，其清除DPPH自由基的反應有兩種機制：直接提供酚的氫離子給DPPH自由基（HAT反應），見式（1）；從酚（ArOH）或其酚陰離子（ArO·）轉移電子到DPPH自由基（ET反應），見式（2）[15]。具體是哪一種途徑取決于溶劑的特性和/或待測物質的氧化還原能力。一般在非極性溶液中HAT機制占優越性，但在極性溶液中，如乙醇、甲醇，DPPH自由基能和酚（ArOH）形成較強的氫鍵，從而ET機制占主要[16]，二者也可同時發生[14]。

2 DPPH自由基清除率測定方法

測定DPPH自由基清除率的方法很多，使用最早、最頻繁的是分光光度計法[5-6]。另外，針對不同的實驗目的和材料，人們利用高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）[17-20]、電子順磁共振技術（electron paramagnanetic resonance，EPR）[21-22]、薄層層析技術（thin layer chromatography，TLC）[23-24]等開發了一些測定物質清除DPPH自由基活性的新型方法。

2.1 分光光度計法

DPPH自由基在517 nm波長附近有最大吸收峰，當DPPH自由基與抗氧化劑反應后，517 nm波長處的吸收值降低，其降低的程度與接收的電子（抗氧化劑清除自由基活性）呈定量關系，反應進程很容易通過分光光度計監測[5-6,25]。由于該方法簡單、靈敏、快速，因此使用最廣泛。DPPH自由基清除計算公式一般為：

式中：A對照為未加樣品的DPPH自由基吸光度；A樣品為加入樣品反應后的DPPH自由基吸光度。

2.2 HPLC

HPLC法是基于DPPH自由基吸收峰（PAs）的減少，來檢測待測物質的DPPH自由基清除活性。通過比較反應前后DPPH自由基吸收峰（PAs）的變化，可靈敏地區分DPPH自由基吸收值的微小變化[17]。另外，通過HPLC法比較反應前后待測物中各組分的吸收峰變化，可以判斷哪種組分的DPPH自由基清除活性高[20]。DPPH-HPLC法及DPPH-HPLC-MS法已成功用于篩選和鑒定復雜混合物質中的抗氧化成分[20,26]。但是對于批量實驗，該方法可能會耗費大量時間。DPPH自由基清除率計算公式為：

式中：PA空白為未加樣品的DPPH自由基吸收峰面積；PA樣品為加入樣品反應后的DPPH自由基吸收峰面積。

2.3 EPR

運用映照的修辭修辭格，將年幼時的“我們”與現在經歷事件而走向不同的“我們”進行對照，展現歲月終使“我們”走向分離的殘酷。

EPR是直接檢 測和研究含有未成對電子的順磁性物質的現代分析方法，具有簡單、靈敏度高、樣品不受破壞和無干擾等優點，是目前檢測自由基最直接、有效的方法之一[22]。由于DPPH自由基是穩定的順磁化合物，適合EPR檢測。DPPH-EPR法直接測定自由基的濃度，顯著提高了分析的準確性[21]。但由于成本較高，該方法使用并不常見。

3 DPPH法注意事項

3.1 檢測波長

同一物質在不同波長下的吸收程度不一樣，檢測波長的選擇關系到吸光度的準確性，影響實驗結果的準確性。DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液最大吸收波長在500～520 nm。統計大量文獻后發現，使用頻率最高的是515 nm[16,27-29]和517 nm[8,10,18,30-31]，二者受青睞程度相當。也有使用516 nm[32]和518 nm[23]的。若對波長要求特別嚴格，可用掃描型分光光度計掃描DPPH自由基醇溶液的吸收光譜，確定最大吸收波長。

3.2 DPPH自由基初濃度的選擇

關于DPPH自由基初濃度報道有很多（表1），沒有統一的規定。有些研究者使用的DPPH自由基初濃度很高，導致反應體系中DPPH自由基吸光度超出了分光光度法的準確范圍[33-34]。根據比爾定律，分光光度計的靈敏度范圍在0.221～0.698，相當于透光率在20%～60%[33]，對應的適宜DPPH自由基濃度應在25～70 μmol/L附近[8]。然而有很多人使用的DPPH自由基溶液濃度遠超出了分光光度計的范圍，甚至達到了300 μmol/L[23]和500 μmol/L[35]。Scherer等[2]在實驗中使用的DPPH溶液吸光度在2～3之間，超出了分光光度計的準確范圍，因而其數據結果被人質疑[36]。因此DPPH自由基初濃度不應超出分光光度計的準確范圍[36]。

表1 DPPH自由基溶液的初始濃度Table 1 Initial DPPH radical concentrations from literature

3.3 反應時間

表2 DPPH法反應時間Table 2 Reaction time for DPPH assay

不同文獻報道的DPPH法反應時間不同（表2）。有調查表明，大部分的DPPH法研究都是基于20～30 min的固定反應時間，而不是氧化還原反應達到平衡的總時間[42]。DPPH法看似簡單，許多抗氧化劑與DPPH自由基的反應動力學不同，或者甚至不反應[29]，反應達到平衡所需的時間也有所不同。如抗壞血酸與DPPH自由基的反應迅速，幾乎在瞬間完成；而苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）與DPPH自由基反應很緩慢，其吸光度在90 min的時間內持續降低[8]，甚至需長達6h達到反應達平衡[29]。根據與DPPH自由基反應時間的長短，可將抗氧化物劃分為快速（＜30 min）、中速（0.5～1 h）和慢速（＞1 h）3類[29]。如抗壞血酸、β-胡蘿卜素、水溶性VE（Trolox）、沒食子酸丙酯[8,43]、芝麻酚、α-生育酚[29]與DPPH自由基反應迅速，達平衡時間在30 min以內；阿魏酸、沒食子酸、BHT[29]、(+)-兒茶素、(－)-表兒茶素[16]與DPPH反應緩慢，平衡時間在0.5～3 h。另外，大部分的天然植物提取物成分復雜，與DPPH自由基反應機制復雜，反應緩 慢[16]。

然而很多研究者并沒有注意到反應時間的重要性，使用較短的時間，往往不足以使反應達到穩定狀態[32]，使得許多抗氧化劑的活性被錯誤估計。因此，在運用DPPH法前，很有必要進行混合體系的吸光度隨時間變化的實驗，以準確評估反應時間[8,43]。Teow等[44]發現反應液的吸光度在3 h左右才達到平衡，故將反應時間定為3 h。Azevedo等[38]每隔10 min測一次混合體系的吸光度，至30 min，從而確定反應達到平衡的時間。

DPPH法自1958年被Blois[5]提出后，在Brand-Williams等[6]的不斷改進下，確定DPPH自由基清除率計算見公式（5）。

式中：A對照為未加樣品的DPPH自由基吸光度，即DPPH自由基溶液＋溶劑；A樣品為加入樣品反應平衡后的吸光度[5-6,20,29-30,36]，即DPPH自由基溶液+樣品溶液。

該計算公式適用于絕大多數情況，然而對于那些和DPPH在515 nm或517 nm處吸收光譜重疊的樣品來說，樣品本身的吸收對結果有一定影響，應該消除樣品的影響，于是將上面公式中的A樣品換成（A樣品－A空白），A空白為樣品的空白對照，即樣品本身的吸光度[23,28,43,48]，即樣品溶液＋溶劑。

因此，在使用DPPH法時應根據樣品的吸收光譜，選擇對應的清除率計算公式，確保實驗結果的準確性。

4 DPPH自由基清除活性的評價指標

為了表示DPPH法的結果，并比較不同物質的抗氧化活性，人們開發了多種DPPH自由基清除活性指標，如半數抑制濃度IC50、自由基清除能力AE、Trolox當量等。常見指標及其計算公式、優缺點如下。

4.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率（I）[28,49]是評價物質清除DPPH自由基活性的重要指標之一，其計算見公式（7）。

式中：A對照為對照組吸光度；A樣品為樣品與DPPH自由基反應平衡后的吸光度。自由基清除率越高，表明物質的抗氧化活性越強。該指標簡單、方便，使用頻率較高，但其易受樣品顏色和純度、DPPH自由基濃度、溶劑等因素影響；往往與半數效應濃度EC50或半數抑制濃度IC50聯用。

4.2 DPPH自由基剩余率

DPPH自由基剩余率[32]表示反應體系中某一時刻剩余的DPPH自由基濃度與初始DPPH自由基濃度之比，其計算見公式（8）。

式中：c（DPPH自由基）t=0和c（DPPH自由基）t分別為t=0和反應過程中某一時刻t的DPPH自由基濃度。DPPH自由基剩余率越高，表明物質清除的DPPH自由基越少，抗氧化活性越弱。該指標要求準確測量反應時間和DPPH自由基濃度。

4.3 EC50或IC50

EC50為使DPPH自由基濃度降低50%的抗氧化劑濃度；IC50為DPPH濃度降到50%時的抗氧化劑濃度，二者的表達的意義相同。通過設置5～6個抗氧化劑濃度，制作濃度-清除率曲線，由于很多抗氧化劑濃度與DPPH自由基清除活性呈非線性關系，可通過GraphPad Prism?version 5.01、BleSq、OriginPro?8.5.1、SigmaPlot?12、BioDataFit?1.02和IBM SPSS Statistics?、Desktop 19.0等計算機程序中的回歸模型，計算得到EC50/IC50值。EC50/IC50值越大，抗氧化活性越小。EC50/IC50被使用頻率最高，但是其值隨著DPPH初濃度變化[30-31,50]。

4.4 自由基清除能力

自由基清除能力（ antiradical efficiency，AE）的計算見公式（9）。

式中：TEC50為抗氧化劑濃度在EC50時，反應達平衡所需的時間。

AE值越大，自由基清除能力越強。AE同時考慮了EC50和反應時間，被廣泛用于DPPH法結果的表達。AE同時考慮了EC50和反應時間，被廣泛用于DPPH法結果的表達。但是測量TEC50耗費時間，且反應平衡是一個緩慢的動態過程，判斷平衡時間存在困難[9,16,28,50]。

4.5 Trolox當量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）

TEAC將給定物質的抗氧化能力與標準抗氧化物質Trolox比較。以Trolox為標準品，繪制Trolox濃度與DPPH自由基清除率的標準曲線；再將待測物質與DPPH反應，得到清除率值，計算得到與該清除率相當的Trolox濃度，進而得到TEAC值，單位為μmol TE/g。

TEAC值越大，抗氧化能力越強。是DPPH法最常用的指標之一[27,38]。

4.6 抗氧化劑活性指數（antioxidant activity index，AAI）AAI[2]的計算見公式（10）。

式中：IC50為半抑制濃度，結果不受DPPH濃度的影響，但是受抗氧化劑的濃度影響。使用較少。

4.7 抗氧化劑活性因子（antioxidant activity unit，AAU）

AAU[36]為完全清除1mol DPPH自由基所消耗的抗氧化劑摩爾數。計算見公式（11）。

式中：R為樣品溶液與DPPH溶液的體積比；B為擬合方程的斜率；c為DPPH自由基的初始濃度；Mr為樣品的相對分子質量。

AAU值越小，抗氧化劑清除自由基能力越強。AAU值不受樣品和DPPH自由基濃度影響，但 是推到得到的公式中B為線性方程的斜率，公式本身有局限性；且還需知道樣品的相 對分子質量，不適合測混合物和某些天然提取物的抗氧化活性。使用較少。

4.8 抗壞血酸當量（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity，AEAC）

AEAC[30,51]表示100 g樣品的抗氧化能力相當于多少mg抗壞血酸的。計算見公式（12）。

式中：Ac為對照組吸光度；As為反應液吸光度；AAA為抗壞血酸吸光度；ρAA為抗壞血酸（AA）質量濃度/（mg/mL）；V提取液為提取液體積/mL。AEAC的另一個計算見公式（13）。

5 影響DPPH法結果的外界因素

DPPH法除了受到反應時間、DPPH初濃度、樣品性質、計算公式、結果表達方式的影響[52]，還受到光照、氧氣、pH值、有機離子、無機離子等外界因素的影響[4]。

5.1 無機離子

Blois[5]1958年曾報道無機離子影響了DPPH自由基清除活性的準確測量。Al-Dabbas等[39]發現Na2S2O3和FeCl2能顯著降低DPPH自由基的顏色強度，即具有清除DPPH自由基的活性。MgCl2、CaCl2、K2SO3和K2SO4輕微增加了DPPH自由基的顏色強度。K2HPO4、KH2PO4、KCl、KF、KBr、KSCN、KNO3、CaCO3、K2CO3、K2CrO4、MnCl2和NaCl在質量濃度為400 μg/mL時不影響DPPH自由基的顏色強度。另外，很多自由基清除劑如黃酮類物質容易螯合鐵離子，以至不能準確評估其DPPH自由基清除活性[39]。Dawid owicz等[39]發現溶解抗氧化劑的溶液中，金屬離子顯著影響著未反應的DPPH自由基數量[32]。低價態的無機離子可能會干涉結果的準確性，在測定時需剔除或分別測定。為了得到植物提取物的真實DPPH自由基清除活性，應對其脫鹽化。

5.2 有機化合物

Roberto[53]發現，純的有機酸（乙酸、檸檬酸、蘋果酸）沒有DPPH自由基清除活性，但是當VC混合后，能顯著增加VC的自由基清除效果，且呈現劑量效應。Dawidowicz等[32]發現系統中的乙酸乙酯、二惡烷降低了DPPH與BTH的反應動力學。

5.3 緩沖溶液

Al-Dabbas等[39]發現醋酸緩沖液在0.01～0.2 mmol/L范圍內沒有降低DPPH自由基的顏色，而磷酸緩沖液在超過0.05 mmol/L的濃度下，增強了DPPH自由基顏色。其認為醋酸緩沖液可用于任何提取物，而磷酸緩沖液使用則有所限制。

5.4 光照、氧氣、pH值

Ozcelik等[4]發現，DPPH自由基甲醇溶液和DPPH自由基丙酮溶液在25℃的光照條件下放置120 min吸光度分別降低20%和35%，而在黑暗條件下放置150 min吸光度變化不明顯。分別在21%含氧量和1%含氧量的條件下放置90 min，前者的DPPH自由基降解程度顯著高于后者。在光下反應120 min，pH 4的甲醇緩沖液中的DPPH自由基吸光度降低了55%，pH 10丙酮緩沖液中的DPPH自由基吸光度降低了80%。因此光照、氧氣、pH值會降低DPPH自由基的吸光度。

6 結 語

DPPH法是一種重要的檢測天然植物提取物或化合物抗氧化活性的方法，操作簡單，重復性好，受到廣泛的歡迎。但是，DPPH法的結果容易受到多種因素的影響，為了準確評價某物質的清除DPPH自由基活性，應選擇準確的反應時間、DPPH自由基初濃度、對應的計算公式和可靠的結果表達方式等。對于檢測植物提取物的抗氧化活性，為排除提取液中各種離子及化合物等其他成分的影響，應對其進行脫鹽化處理或純化處理。DPPH法還受到溫度、光照、氧氣等自然因素影響，實驗操作時要避光反應，DPPH自由基溶液現配現用。另外，反應體系中的H2O、H+含量，DPPH自由基與抗氧化劑溶液的體積比等也會影響著DPPH法的結果，但是其機理和規律研究還不夠深入，值得進一步探索。DPPH自由基與抗氧化劑的反應過程和原理也值得進一步探究。到目前為止，還沒有一個標準化的DPPH法，使得不同實驗室的結果比較存在限制性。因此，DPPH法需要進一步完善和標準化，測定的抗氧化活性指標也需要統一。

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Advances in the DPPH Radical Scavenging Assay for Antioxidant Activity Evaluation

WEI Xian-ya1, YIN Li-qin1, ZHONG Cheng2, ZHANG Ming-hai1, NIU Ying-ze1,*
(1. Rapeseed Research Center, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

in vitro evaluation of the antioxidant activity of plant compounds or plant extracts is an important aspect of functional factor research. The DPPH (1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging assay is widely used for antioxidant activity evaluation of plant compounds and extracts. However, this method lacks a standardized program so that results from different experiments may be difficult to compare with each other. The present review presents a comprehensive overview of the principle, measurement procedure and wavelength, initial DPPH free radical concentration, reaction time, calculation of the scavenging rate, expression of results and evaluation indices. Several external factors influencing the DPPH assay are also discussed.

DPPH method; free radical; antioxidant; antioxidant activity

TS207.3

A

1002-6630（2014）09-0317-06

10.7506/spkx1002-6630-201409062

2013-06-25

四川省科技計劃項目（12CGZHZX0712）；四川省教育廳重點科技項目（11LD018）

韋獻雅（1980—），女，博士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：442891531@qq.com

*通信作者：牛應澤（1955—），男，教授，博士，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：niuyz01@126.com