膠質細胞源性神經營養因子對帕金森病大鼠多巴胺能神經元的修復作用

許加軍，楊洪安，王國棟

(山東大學附屬省立醫院，濟南250021)

膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)有保護多巴胺能神經元和修復其損傷的作用［1～3］，保護作用通常發生在損傷即刻，持續數小時，而修復作用通常在傷后數天至數周才表現出來，并持續較長時間。如在神經元損傷后數小時內或損傷前預防給藥，以保護作用為主;如給藥覆蓋帕金森病整個病程，則以修復作用為主。2013年10～12月，我們向帕金森病模型大鼠腦室或殼核內直接注射GDNF，觀察其對大鼠黑質紋狀體系統多巴胺能神經元的修復作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 健康雄性SD70大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。常規飼養，自由進食水。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立體定向儀。以前囟為標準參考點，參照大鼠腦立體定位圖譜，于右側前腦內側束(MFB，A/P:－ 3.6 mm;L:+2.0 mm;V:－ 9.0 mm)及腹側被蓋區(VTA，A/P:－6.0 mm;L:+0.5 mm;V:－8.0 mm)分別立體定向注入12 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，注射速度為 1 μL/min，經 2周的跟蹤監測，獲得39只穩定對側旋轉的帕金森病模型［4］。腹腔麻醉下應用立體定向技術分別在20只大鼠右側腦室近紋狀體側和19只大鼠雙側殼核中央部放置微型導管(外徑0.5 mm)。導管通過一段軟管接于埋于側腹部皮下的緩釋泵［5］。無論是單側腦室置管還是雙側殼核置管，GDNF均能作用于雙側腦區。

1.2 GDNF給藥方法 術后1周內所有造模成功大鼠每日通過導管輸注賦形劑(10 mmol/L枸櫞酸鹽、150 mmmol/L NaCl緩沖液)。術后2～3周，15只大鼠(觀察A組)腦室內注射人重組GDNF，7.5 μg/d;14只(觀察B組)殼核內注射人重組GDNF，7.5 μg/d;5只(對照 A 組)腦室內注射賦形劑，5只(對照B組)殼核內注射賦形劑至實驗結束。

1.3 黑質酪氨酸羥化酶陽性(TH+)多巴胺能神經元大小、數量及紋狀體TH+神經纖維密度測算 所有動物麻醉后，心內注射肝素化冰生理鹽水，然后取其腦組織置于冰腦模上行冠狀切片，層厚為1 mm。在包含尾狀核、殼核、伏隔核的層面行雙側腦組織打孔取標本。將該層面每側紋狀體按照距離腦室遠近分為內側部、中間部和外側部三個區域分別進行標本采集。

4℃下，把紋狀體冠狀切片標本以及整個中腦組織均放在4%的甲醛中固定，然后用滑動切片機切片，取包含黑質、紋狀體層面行TH免疫組化染色，光鏡下觀察。操作按試劑盒說明書進行。采用光學分餾方法對中腦組織多巴胺能神經元進行無偏立體細胞計數，獲得TH+神經元數目以及大小(被蓋腹側區域不計入興趣區域)。計數雙側紋狀體TH+神經纖維密度，以側腦室作為參考點，用1.2 mm×1.2 mm柵格從背到腹計數。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。數據用±s表示。組間比較采用t檢驗和方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目見表1，紋狀體內側部TH+神經纖維密度見表2。由表1、表2可見，對照A、B組大鼠右側中腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目及紋狀體內側部TH+神經纖維密度均較左側降低，P均＜0.05。觀察A組與對照A組相比、觀察B組與對照B組相比，雙側中腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目及紋狀體內側部TH+神經纖維密度均明顯升高，P均＜0.05。

表1 各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目比較(±s)

表1 各組大鼠中腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目比較(±s)

注:與對照 A組相比，*P ＜0.05;與對照 B 組相比，#P ＜0.05

組別 n 神經元數目(個/HP)左側 右側神經元大小(μm2)左側 右側觀察A組 15 242 325±11 053*51 300±13 862* 392±47* 309±33*觀察B組 14 270 675±10 126 67 500±11 622 472±25 302±22對照A組 5 194 400±11 086 32 400±1788 303±25 231±9對照B組 5 204 930±12 367#35 370±1 986# 309±40# 232±14#

表2 各組大鼠紋狀體內側部TH+神經纖維密度比較(±s)

表2 各組大鼠紋狀體內側部TH+神經纖維密度比較(±s)

注:與對照 A 組相比，*P ＜0.05;與對照 B 組相比，#P ＜0.05

組別 n TH+神經纖維密度(條/HP)左側 右側觀察 A 組 15 93.4 ±1.1* 6.4 ±7.3*觀察 B 組 14 91.7 ±0.2# 14.6 ±3.6#對照 A 組 5 91.5 ±1.8 2.8 ±0.6對照B組5 79.0 ±2.0 6.8 ±0.9

3 討論

本研究結果顯示向帕金森大鼠腦室或紋狀體內輸注GNDF對黑質紋狀體系統多巴胺能神經元具有顯著性修復作用，可增加腦組織黑質TH+多巴胺能神經元大小和數目及紋狀體內側部TH+神經纖維密度，改善黑質紋狀體系統功能。金美芳等［1］采用慢病毒作載體，使GDNF基因在PD模型黑質紋狀體部位持續表達，結果與本研究大體相同，但其轉染GDNF基因是實驗損毀1周后進行，主要強調GDNF對黑質紋狀體的保護功能。另外在其研究中，腦內GDNF給藥劑量無法控制，不能長期監測。本研究中GDNF給藥始于損毀后2周，避開了GDNF保護作用有效期［6］，明確觀察GDNF對多巴胺能神經元顯著修復作用。

本研究結果顯示殼核或者腦室內注射均可以收到良好的神經元修復效果，這與既往研究［7］結論一致。GDNF對殘存多巴胺神經纖維具有顯著修復作用，這與文獻［8］結論一致。對照組近腦室側紋狀體TH+神經纖維密度最高，說明殘存纖維主要集中在近腦室紋狀體，而在實驗組，纖維再生和修復最明顯也發生在近腦室紋狀體，說明GDNF神經修復作用主要作用對象為損毀后殘存神經纖維，這正是GDNF能夠上調黑質紋狀體系統多巴胺能神經元活性主要機制。

本研究結果顯示，腦室內或殼核內輸注GDNF不但能修復損毀側黑質神經元，還能顯著增加健側黑質神經元數目，這與文獻［9］結果相同。故認為腦室內或殼核內注射GDNF可以通過擴散逆向運輸在黑質等鄰近腦區廣泛分布［10］。目前有證據表明帕金森動物模型中黑質神經元調亡前會出現多巴胺表型丟失，從而造成這些神經元活性喪失［11］(即這些細胞并不表達TH)，這可以作為GDNF發揮作用的靶細胞。目前有證據表明在成年動物新皮層、紋狀體和黑質等部分腦區均存在神經再生［12］。所以GDNF也可能通過促進神經再生途徑對黑質紋狀體細胞進行修復。

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