RNA干擾抑制EZH2基因表達對人膠質瘤細胞凋亡及對卡莫司汀敏感性的影響

周章明，楚勝華

(1成都大學附屬都江堰醫療中心，四川都江堰611830;2上海交通大學附屬第三醫院)

放化療是目前常見的腫瘤術后治療手段。逃避凋亡是腫瘤發生、發展和產生藥物抵抗的重要機制［1］。誘導腫瘤細胞凋亡并增強其對化療藥物的敏感性是目前腫瘤治療的研究熱點。果蠅zeste基因增強子人類同源物2(EZH2)是多疏基因(PcG)蛋白家族的重要成員，與腫瘤細胞凋亡并在促進癌細胞生長、侵襲、轉移中起重要作用［2］。卡莫司汀可以通過血腦屏障，該藥物及其代謝物可通過烷化作用與核酸交鏈，并有可能因改變蛋白質而產生抗腫瘤作用，為膠質瘤化療的重要藥物之一［3-5］。2012年5月～2013年6月，我們用RNA干擾技術抑制人膠質瘤U251細胞中EZH2基因的表達，并檢測干擾后U251細胞對卡莫司汀的敏感性?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組 人膠質瘤U251細胞購于中國科學院細胞所。細胞培養于含有10%新生小牛血清的RPMI-1640培養基中，內加青霉素1×105U/mL，鏈霉素 100 mg/mL，置于 5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱內培養。分為空白對照組、脂質體組、陰性對照組和pRNAT-EZH2組。

1.2 小干擾RNA(siRNA)真核表達載體的構建具有互補序列的能夠編碼短發卡RNA(shRNA)的雙鏈寡核苷酸模板DNA由上海康成公司合成。其轉錄產物所形成的siRNA的作用靶點為人EZH2 mRNA。干擾序列為:AAGACTCTGAATGCAGTTGCT;在兩端分別懸垂Sal I、Xba I的酶切位點，3'端酶切位點之前加入終止信號TTTT;陰性對照是雙鏈寡核苷酸轉錄產物所形成的siRNA，此序列不與任何人類基因序列同源。

1.3 細胞轉染 用Lipofectin-2000TM(美國Invitrogene公司)介導進行轉染?？瞻讓φ战M不轉染。脂質體組轉染液中僅含脂質體無siRNA。陰性對照組轉染液加入空質粒pRNAT-Negative。pRNAT-EZH2組轉染液加入重組pRNAT-EZH2質粒。

1.4 U251細胞中EZH2 mRNA檢測方法 收集轉染24、48、72 h各組細胞，用 Trizol(美國 Invitrogene公司)提取細胞總RNA，采用RT-PCR法檢測EZH2 mRNA，操作按試劑盒說明書進行。EZH2引物序列:上游 5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3'，下游3'-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-5'，產物大小為86 bp。β-actin引物序列:上游 5'-ATCTGGCACCAAACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'，下游5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'，產物為167 bp。以EZH2與β-actin條帶的積分吸光度比值表示EZH2 mRNA的相對表達量。

1.5 卡莫司汀處理后各組細胞凋亡檢測方法 將轉染后48 h的細胞以2×105個/mL的密度接種在6孔培養板中，分別加入含卡莫司汀 10、25、50 μmol/L的完全培養基，每組設3個復孔，培養24、48 h后小心吸去培養液，加入0.5 mL細胞固定液，室溫下固定10 min。吸去固定液，用PBS洗兩遍，洗滌時用搖床晃動，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免汽泡，使細胞接觸封片液。用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況，激發波長352 nm，發射波長461 nm。

1.6 卡莫司汀處理后各組細胞增殖抑制情況檢測方法 采用MTT法。取pRNAT-EZH2組、陰性對照組、空白對照組的對數生長期細胞接種于96孔培養板內，每孔加入細胞1×104個，24 h后加入含卡莫司汀10、25、50 μmol/L 的完全培養基，每組設3 個復孔，繼續作用24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續培養4 h，吸棄去培養液，加入DMSO 150 μL，酶標儀測定570 nm處吸光度(A)值。取3孔平均A值。計算細胞增殖抑制率。

1.7 Caspase-3檢測方法 取 pRNAT-EZH2組、陰性對照組、空白對照組的對數生長期細胞，24 h后加入含卡莫司汀 0、10、25、50μmol/L 的完全培養基，加入細胞裂解液裂解，用分光光度計檢測Caspase-3水平。操作按試劑盒說明進行。

1.8 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以±s表示，組間比采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EZH2 mRNA 轉染72 h，空白對照組、脂質體組、陰性對照組、pRNAT-EZH2組 U251細胞EZH2 mRNA相對表達量分別為 0.597±0.046、0.603 ±0.031、0.428 ± 0.047、0.151 ± 0.008。pRNAT-EZH2組與空白對照組相比，P＜0.05，空白對照組與陰性對照組及脂質體組相比，P均＞0.05。pRNAT-EZH2組轉染24、48、72h時 EZH2 mRNA 表達抑制率分別為58.19%、73.37%和74.58%。

2.2 細胞凋亡情況 空白對照組及陰性對照組細胞經Hoechst 33258染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察見細胞均勻藍染，脂質體組和pRNAT-EZH2組細胞則檢測出明顯的細胞凋亡，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒狀藍色熒光及明顯的熒光碎片，pRNAT-EZH2組凋亡細胞最多。

圖1 各組細胞凋亡情況激光共聚焦顯微鏡觀察結果

2.3 細胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達量pRNAT-EZH2轉染后，U251細胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達量明顯高于空白對照組和陰性對照組(P均＜0.01)，而空白對照組和陰性對照組的生長抑制率差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 不同濃度卡莫司汀處理后各組U251細胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達量(±s)

表1 不同濃度卡莫司汀處理后各組U251細胞增殖抑制率和Caspase-3相對表達量(±s)

注:與空白對照組和陰性對照組相比，*P＜0.05

組別 n 細胞增殖抑制率(%)Caspase-3相對表達量空白對照組3 0 μmol/L 1.00 ±0.05 10 μmol/L 2.21 ±0.32 1.59 ±0.27 25 μmol/L 17.43 ±3.51 3.97 ±0.36 50 μmol/L 42.32 ±4.27 7.85 ±0.17陰性對照組 3 0 μmol/L 1.01 ±0.06 10 μmol/L 2.39 ±1.01 1.48 ±0.32 25 μmol/L 19.28 ±3.59 3.89 ±0.14 50 μmol/L 45.12 ±4.39 7.64 ±0.27 pRNAT-EZH2組 3 0 μmol/L 1.93 ±0.04*10 μmol/L 15.34 ±1.72* 2.17 ±0.03*25 μmol/L 36.49 ±4.13* 4.91 ±0.06*50 μmol/L 67.16 ±4.57* 10.12 ±0.03*

3 討論

膠質瘤具有高侵襲性，局部復發轉移快，并對已知的化療藥物基本耐藥。術后化療在膠質瘤的綜合治療中占有重要地位，多藥耐藥是影響治療效果的重要原因［6，7］?；瘜W藥物所致細胞毒作用的終末效應均為誘導細胞凋亡［8］，激活細胞凋亡的能力是抗腫瘤藥物療效的主要檢測標準［9］，由于腫瘤細胞常存在凋亡信號轉導途徑缺陷，導致許多腫瘤對化療藥物產生耐受［10］。因此通過沉默癌基因及活化凋亡信號關鍵分子而促進細胞凋亡，為提高腫瘤化療敏感性提供了新思路。

EZH2是凋亡抑制蛋白家族中一類抑制凋亡、調節細胞分化的細胞因子［2］。目前已有研究發現在前列腺癌、胃腺、直腸癌等高度惡性轉移性腫瘤中EZH2 過度表達［2，11～14］。RNA 干擾技術是通過小的雙鏈RNA阻斷體內特定基因的表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失表達的技術，是目前沉默某些致病基因功能的高效及特異性手段。本研究構建了針對EZH2基因的siRNA真核表達載體，并用其轉染人膠質瘤U251細胞，結果顯示pRNAT-EZH2轉染U251細胞后顯著抑制了EZH2 mRNA表達，提示本研究構建的siRNA真核表達載體的確能夠在細胞內持續地表達siRNA，高效、特異的抑制EZH2基因的表達。

進一步研究發現空白對照組及陰性對照組細胞經Hoechst 33258染色后，激光共聚焦顯微鏡下呈現的細胞均勻藍染，而卡莫司汀組及卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細胞則檢測出明顯的細胞凋亡，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒狀藍色熒光及明顯的熒光碎片，其中可見卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細胞凋亡最多。可以證實轉染EZH2 siRNA促進了膠質瘤細胞凋亡，在與卡莫司汀聯合作用下，凋亡更加明顯。

本研究結果顯示，穩定轉染EZH2 siRNA真核表達載體后卡莫司汀對細胞生長抑制作用增加，pRNAT-EZH2轉染U251細胞后增殖抑制率明顯高于空白對照組和陰性對照組，卡莫司汀加pRNATEZH2組細胞增殖抑制尤為明顯。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能［15］。穩定轉染 EZH2 siRNA載體后Caspase-3活性明顯升高，以卡莫司汀加pRNAT-EZH2組細胞升高最為顯著，表明用RNA干擾技術抑制EZH2表達造成腫瘤細胞對卡莫司汀的耐受性降低。

過多表達EZH2可能并非激活腫瘤細胞化療藥物的耐受性和抗凋亡能力所必需的因素，但抑制EZH2表達可能作為有效的調控信號，提高腫瘤細胞對卡莫司汀化療敏感性，導致腫瘤細胞凋亡。本研究中筆者通過應用RNA干擾技術成功增加了人膠質瘤細胞對卡莫司汀的敏感性，應引起重視。

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