石斛多糖對人Burkitt淋巴瘤Raji細胞增殖、凋亡的影響及機制

任志國

(山東醫學高等?？茖W校附屬醫院，山東臨沂276004)

鐵皮石斛是蘭科石斛蘭屬多年生草本植物［1］?！渡褶r本草經》記載其有主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃的功效［2，3］。多項研究已證實，鐵皮石斛中的石斛多糖具有明顯抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、促消化、抗疲勞和抑菌等［4］作用。B細胞性非霍奇金淋巴瘤占全部淋巴瘤病例的68%［1］。近年來，多種治療方法和藥物，如化療、自體造血干細胞移植、放療、干擾素等，被用于治療B細胞性非霍奇金淋巴瘤［2］，但腫瘤緩解率及患者生存率都不理想。2013年6～12月，我們觀察了石斛多糖對人Burkitt淋巴瘤Raji細胞增殖的影響，并探討其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 鐵皮石斛由連城鐵皮石斛生物制藥組培基地惠贈，人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株購自中科院上海細胞庫，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海七海生物科技有限公司;RNA提取試劑盒購自北京TIANGEN公司;MTT購自Sigma公司，RPMI1640、胎牛血清等購自Gbico公司。引物由上海賽百盛生物公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 石斛多糖的提取與制備 鐵皮石斛充分干燥后打成細粉，稱取200 g鐵皮石斛細粉，60℃石油醚回流脫脂，取殘渣揮干溶劑后，80%乙醇回流后揮干溶劑。布氏漏斗抽濾提取液和洗滌液得到濃縮液，Sevag法脫蛋白［5］。取上層液體，以1:4比例加入乙醇沉淀后，抽濾干燥，即得石斛多糖。硫酸蒽酮比色法測定糖含量為82.34%。稱取石斛多糖，溶于生理鹽水配成適當濃度，過濾除菌備用。

1.2.2 細胞培養及分組 10%胎牛血清1640培養液(含1%青鏈霉素)，37℃，5%CO2培養人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株，每2～3天傳代1次。取對數生長期細胞接種于 96孔板(90 μL/孔，1×105個/mL)。設對照組和A、B、C、D組共5組，每組設8個復孔及調零孔。培養12 h后分別加入0、100、200、400、800 mg/L 的石斛多糖溶液，10 μL/孔。

1.2.3 Raji細胞增殖抑制率的測算 采用 MTT法。各組Raji細胞培養24、48、72 h后各觀察細胞形態1次，培養72 h后加入 MTT(5 mg/mL，20 μL/孔)，4 h后每孔加入酸化的 SDS溶液100 μL，12 h后測定 OD490。用下列公式計算 A、B、C、D組 Raji細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照組OD490－實驗組OD490)/對照組OD490×100%。

1.2.4 Raji細胞凋亡率的檢測 采用流式細胞術。各組Raji細胞培養48 h和72 h后1 200轉/min離心5 min 收集細胞，Binding Buffer(400 μL/孔)重懸細胞，加入 Annexin V-FITC(5 μL/孔)，避光 15 min后加入10 μL PI染液0℃作用5 min，30 min內測量對照組及A、B、C、D組Raji細胞凋亡率。

1.2.5 Raji細胞中Caspase-3 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。各組 Raji細胞培養48 h后提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA。設計引物:Caspase-3(365 bp)上 游:5'-TGACCGAGGCTACATTCAGATGA-CACC-3';下 游:5'-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3'。β-actin(243 bp):上游:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'， 下 游:5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。50 μL 反應 體 系，擴增條件:94℃ 10 min，30個循環(94℃ 50 s，53℃45 s，72 ℃ 1 min)，72℃ 8 min。擴增產物經 1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，通過凝膠成像系統計算相對表達量(與β-actin光密度值比值)。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計數資料以±s表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 石斛多糖對Raji細胞增殖的影響 各組Raji細胞增殖抑制率見表1。由表1可見，隨著石斛多糖濃度的提高和作用時間延長，各組Raji細胞增殖抑制率也升高，P均＜0.05。

表1 各組Raji細胞生長抑制率比較(±s)

表1 各組Raji細胞生長抑制率比較(±s)

組別 n Raji細胞增殖抑制率(%)A組8培養24 h 9.81 ±1.67培養48 h 49.52 ±7.37培養72 h 58.80 ±2.71 B組 8培養24 h 12.78 ±3.32培養48 h 63.43 ±3.29培養72 h 72.51 ±1.64 C組 8培養24 h 14.96 ±1.28培養48 h 73.34 ±1.36培養72 h 79.86 ±5.63 D組 8培養24 h 21.11 ±5.66培養48 h 79.51 ±3.56培養72 h 90.60 ±7.10

2.2 各組Raji細胞凋亡率 各組Raji細胞凋亡率見表2。由表2可見，隨著石斛多糖濃度的提高和作用時間延長，各組Raji細胞凋亡率也升高，P均＜0.05。

2.3 Raji細胞中Caspase-3 mRNA表達情況 石斛多糖作用Raji細胞48 h后各組細胞Caspase-3相對表達量分別為對照組0.498±0.054、A 組0.717 ±0.074、B 組 0.837 ±0.048、C 組0.985 ±0.087、D 組1.121±0.058。隨著石斛多糖濃度增加，Caspase-3 mRNA表達量逐漸增高，P均＜0.05。

3 討論

多糖是一類分子結構復雜的糖類大分子物質，是生命物質的重要組成成分之一，并且廣泛的參與各種生命活動［6］。研究表明，多糖類物質在提高機體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、降低血糖血脂和抗衰老等方面具有重要作用，且越來越多的生物活性多糖已被提取且用于臨床［7］。鄧鵬等［8］報道多糖具有人鼻咽癌細胞和誘導凋亡的作用。金樂紅等［9］在研究中發現，石斛多糖可以有效抑制小鼠肉瘤和離體肝腫瘤細胞的生長。在血液系統腫瘤治療方面，鄭斯卓等［10］指出石斛多糖可通過抑制BCR-ABL融合基因的表達，誘導K562細胞的凋亡。但石斛多糖對人Burkitt淋巴瘤Raji細胞的作用及其機制的研究尚未見報道。

表2 各組Raji細胞后細胞凋亡率比較 (±s)

表2 各組Raji細胞后細胞凋亡率比較 (±s)

組別 n Raji細胞凋亡抑制率(%)對照組8培養48 h 14.12 ±0.57培養72 h 13.97 ±0.37 A組 8培養48 h 15.87 ±0.74培養72 h 19.78 ±0.47 B組 8培養48 h 27.45 ±1.12培養72 h 48.50 ±1.04 C組 8培養48 h 37.87 ±1.45培養72 h 54.75 ±1.54 D組 8培養48 h 43.57 ±1.47培養72 h 53.87 ±0.97

本研究通過水提醇沉淀法從鐵皮石斛中提取石斛多糖，體外培養人Burkitt淋巴瘤Raji細胞，將不同濃度石斛多糖作用于 Raji細胞24、48、72 h，MTT法檢測石斛多糖對Raji細胞增殖的影響，在100、200、400、800mg/L濃度時石斛多糖對Raji細胞均具有抑制作用，隨著石斛多糖濃度的提高，細胞生長抑制率也升高(P＜0.05)。同時對石斛多糖濃度為100、200、400、800mg/L 時，3 個時間段的細胞生長抑制率進行單因素方差分析，結果顯示石斛多糖可以抑制Raji細胞增殖并誘導其凋亡，且效果隨著作用劑量和時間的增加而增強。

Caspase家族在介導細胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3參與細胞生理及病理性死亡過程，被認為是凋亡的執行者［11］，其表達下調可導致腫瘤細胞凋亡受阻［12］。已有文獻報道許多抗腫瘤藥物誘導淋巴瘤細胞凋亡的機制可能與Caspase-3的表達有關［13］。本研究采用RT-PCR檢測各組細胞Caspase-3 mRNA的表達量，結果顯示隨著石斛多糖濃度升高，Caspase-3 mRNA表達量逐漸升高，表明石斛多糖可促進Caspase-3蛋白的表達，從而使Raji細胞發生凋亡，是其誘導細胞凋亡的可能機制之一。

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