馬奶及其制品中腸球菌屬乳酸菌的安全性評價

王夢姣，李少英,*，李淑芬，賀文英，宋曉敏，馬春艷，李 貞，駱 袁

馬奶及其制品中腸球菌屬乳酸菌的安全性評價

王夢姣1，李少英1,*，李淑芬2，賀文英3，宋曉敏1，馬春艷1，李 貞1，駱 袁4

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；3.內蒙古農業大學理學院，內蒙古 呼和浩特 010018；4.呼和浩特鐵路局，內蒙古 呼和浩特 010057）

目的：為使具有民族特色和特殊功效的馬奶及其制品中的有益乳酸菌應用于食品發酵工業，確保分離自內蒙古牧區靠自然發酵制作的馬奶及其制品中的乳酸菌的安全性，對分離自馬奶及其制品中的乳酸菌進行安全性評價。方法：通過吲哚實驗、硝酸鹽還原酶實驗、氨基脫羧酶實驗、溶血實驗、D-乳酸檢測及質粒提取實驗，確定菌株是否含有有害代謝產物及有無耐藥性。結果：菌株的吲哚實驗、硝酸鹽還原酶實驗、氨基脫羧酶實驗、溶血實驗均為陰性，在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1中檢出了少量的D-乳酸，菌株對實驗所選藥品無耐藥性且未檢測到可轉移的耐藥質粒。結論：7 株腸球菌屬的乳酸菌在代謝活動中不產生有害代謝產物，不存在可轉移的耐藥質粒。

乳酸菌；安全性；有害代謝產物；耐藥性；質粒

酸馬奶是一種傳統的發酵奶產品，起源于中亞草原，其生產和消費在東歐和中亞國家有著悠久的歷史[1]。酸馬奶又稱熟馬奶[2]，可改善人體消化功能、降血壓、降血脂、提高免疫力、改善心血管類疾病等[3-4]。馬奶較其他畜類奶含有豐富的蛋白質、乳糖、維生素和礦物質，且馬奶中的馬乳蛋白易被人體消化[5]，馬奶中還含有豐富的牛磺酸、乳糖和必需脂肪酸。馬奶及酸馬奶的功效、獨特的風味口感與其中的微生物有必然聯系，因此對從中分離出的乳酸菌的研究十分必要。

內蒙古牧區的酸馬奶采用家庭手工制作、自然發酵的方式獲取，其產品風味獨特，倍受人們的青睞。其中的有益乳酸菌更是研究者關注的焦點，目前對乳酸菌的研究主要集中在產品的開發上，而這其中乳酸菌的安全性研究就顯得尤為重要。乳酸菌的安全性評價從受試對象上分類包括：體外實驗、動物實驗、臨床實驗[6]。體外實驗主要是關于乳酸菌代謝活動和細胞特性的研究。代謝活動研究主要是確定乳酸菌是否含有胺、氨、吲哚、苯酚、致癌亞膽酸和降解黏膜的酶，細胞特性要確定乳酸菌株有沒有耐藥性[6]。本實驗在課題組前期對馬奶及其制品酸馬奶中的乳酸菌進行了分離鑒定及初步的生化特性、抗菌特性的研究的基礎上[7-10]，對從馬奶及其制品中分離出來的7 株腸球菌屬乳酸菌進行體外安全性實驗，包括有害代謝產物實驗和菌株耐藥性實驗，確定7 株腸球菌屬的乳酸菌在發酵過程中是否會產生有害代謝產物、是否帶有耐藥基因、耐藥基因是否存在于質粒，從而對其安全性進行評價。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

腸球菌JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28均來源于內蒙古錫林郭勒牧區酸馬奶中，腸球菌JNN1來源于內蒙古錫林郭勒牧區馬奶中，大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922，均由國家自然基金課題組（No.31060014）提供。標準菌株為糞腸球菌（E. faecalis）CICC23658，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基、脫脂乳培養基、蛋白胨水培養基、硝酸鹽培養基、Taylor氏脫羧酶實驗培養基等培養基按照文獻[6,11-12]進行配制。

血瓊脂平板 廣東環凱微生物科技有限公司；D-/L-乳酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer 寶生物工程（大連）有限公司；質粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；瓊脂糖、Tris-Base 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸、硼酸天津市北方天醫化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DYY-6D型電泳儀電源、DYCP-31DN型電泳儀 北京市六一儀器廠；圖像記錄分析儀 普洛麥格（北京）生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將菌株接種于MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養22 h，活化3 代。

1.3.2 產乳酸實驗

1.3.2.1 凝乳實驗

將活化好的第3代菌液3 000 r/min離心10 min，棄掉上清液。加入與培養液等體積的無菌生理鹽水，3 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，如此重復離心洗滌3 次后加入與培養液等體積的生理鹽水制成供試菌液，將供試菌液按3%的接菌量接入無菌脫脂乳中，37 ℃培養7 d，期間觀察記錄。

1.3.2.2 酸度滴定

將上述培養7 d的乳酸菌，按照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》進行酸度測定。

1.3.3 有害代謝產物評價實驗

1.3.3.1 吲哚實驗

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入到蛋白胨水培養基中。37 ℃培養72 h，加入吲哚試劑8～10 滴，觀察實驗結果。同時做空白實驗。

1.3.3.2 硝酸鹽還原酶活性檢測

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入到硝酸鹽培養基中37 ℃培養5 d后，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液各10 滴，觀察實驗結果。同時做空白實驗[12]。

1.3.3.3 溶血實驗

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株用滅菌的接菌環劃線和穿刺于血瓊脂平板中，37 ℃培養48 h，觀察有無溶血圈出現。同時做空白實驗[13-14]。

1.3.3.4 氨基脫羧酶活性檢測

在無菌條件下，將活化好的8 株菌株按3%的接菌量分別接入Taylor氏脫羧酶實驗培養基（鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸），37 ℃培養72 h，觀察記錄結果。同時做空白實驗[11]。

1.3.3.5 乳酸旋光性檢測

使用愛爾蘭Megazyme公司的D-/L-乳酸檢測試劑盒對D-乳酸進行檢測。

1.4 耐藥性檢測

1.4.1 藥敏實驗

利用紙片法進行藥敏實驗，藥敏紙片：諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、紅霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素[15]。

1.4.2 質粒提取

取0.2 g瓊脂糖加1×TBE（Tris-硼酸）電泳緩沖液20 mL溶解降溫至60 ℃，加入1 μL核酸染料，混勻，倒入電泳槽制膠。

取1.5 mL培養好的菌液，使用質粒小提試劑盒提取質粒。取提取的液體5 μL，加入1 μL 6×Loading buffer，點樣于制備好的瓊脂糖凝膠，電泳液為1×TBE溶液，電壓設定110 V，工作30 min。用圖像記錄分析系統對瓊脂糖凝膠進行分析。

以大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 產乳酸實驗

2.1.1 凝乳實驗

實驗結果顯示8 株菌株37 ℃恒溫培養3 d，除標準菌株CICC23658外，接入其他7 株菌株的脫脂乳均凝乳。牛乳中的酪蛋白遇胃酸后結成的凝塊較硬，而乳酸菌發酵產生乳酸使蛋白質形成微細的凝乳，使凝塊變軟，更利于人體消化[6]。實驗結果表明，7 株菌株凝乳效果均較好。

2.1.2 酸度滴定

標定后NaOH溶液濃度為0.104 7 mol/L，8 株菌株酸度滴定結果如表1所示。

表1 菌株酸度滴定結果Table 1 Titratable acidity produced by eight tested strains

由表1可知，菌株JHZ9、JHZ15、JHZ22經發酵后的酸度均≥70°T，菌株JHZ17、JHZ25、JHZ28酸度略低于70°T，但接近70°T，菌株JNN1和CICC23658酸度較低。

乳酸菌的產酸能力是其能否用于發酵制品的重要指標。GB 19301—2010《食品安全國家標準 生乳》規定，發酵乳的理化指標中酸度≥70°T。結果說明菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28發酵能力較好，其發酵乳的酸度基本符合國家發酵乳標準要求。

2.2 有害代謝產物評價實驗

2.2.1 吲哚實驗

8 株菌株吲哚實驗結果均為陰性，向培養好的菌液中滴加指示劑，均未出現紅色圓環，說明未產生吲哚類物質。

吲哚實驗可以檢測菌株是否能分解蛋白質中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質合成、調節免疫功能和促進消化。色氨酸代謝過程發生障礙會引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[16]。吲哚實驗結果表明菌株不會分解色氨酸產生吲哚。

2.2.2 硝酸鹽還原酶活性檢測

細菌如果產生硝酸鹽還原酶，會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，與碘化鉀溶液反應會置換出碘單質，滴加淀粉溶液培養基會變為藍色。實驗結果顯示所有菌液均未變藍，為陰性反應。

硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是強致癌物亞硝胺的前體物質，與食品中蛋白質分解中間產物仲胺反應形成亞硝胺，后者可誘發多種癌癥如肝癌、胃癌、食道癌和咽癌等[17]。結果說明菌株代謝產物中不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無活性。

2.2.3 氨基脫羧酶活性檢測

具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培養基變堿性，滴加指示劑（溴甲酚紫），呈黃色為陰性，呈紫色為陽性。實驗結果顯示測定管呈黃色，為陰性。

一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，能夠將食品中的氨基酸脫羧還原成生物胺類物質，若胺類在體內聚積過多，則會引起中毒癥狀[18]。檢測結果說明乳酸菌代謝產物中不含有氨基脫羧酶。

2.2.4 溶血實驗

圖1 溶血實驗結果Fig.1 The results of hemolysis test

如圖1所示，在培養的生長物周圍的瓊脂未顯示綠色，說明沒有產生α-溶血；在穿刺物和劃線瓊脂的周圍未出現透明圈，說明沒有產生β-溶血。實驗結果均為γ-溶血，即對溶血無作用或不溶血[13]。

溶血是指紅細胞破裂溶解現象，可由多種理化因素和毒素引起。如某些溶血性鏈球菌和產氣莢膜桿菌可導致敗血癥，瘧原蟲破壞紅細胞和某些溶血性蛇毒含卵磷脂酶，使血漿或紅細胞的卵磷脂轉變為溶血卵磷脂，使紅細胞膜分解[19]。本實驗7 株菌株均無溶血現象發生（圖1只列出其中3 株），說明菌株不是溶血細菌。

2.2.5 乳酸旋光性檢測

表2 菌株D-/ -乳酸含量檢測結果Table 2 D-/ - lactic acid contents produced by eight tested strains

在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢出了少量的D-乳酸，結果如表2所示。乳酸菌發酵后產生的乳酸分為D-乳酸和L-乳酸兩種。人體只具有代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，因此只有L-乳酸能被人體完全代謝利用。而D-乳酸和DL-乳酸過量攝入則有可能引起代謝紊亂甚至導致中毒。世界衛生組織明確規定，成人每天攝入D-乳酸的量不得超過100 mg/kg體質量，對于3 個月以下的嬰兒食品中不應加入D-乳酸，而對于L-乳酸則未加限制[20]。在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢測出了含量很少的D-乳酸，但長期食用是否會對人體產生不良影響還有待進一步研究。

2.3 耐藥性檢測

2.3.1 藥敏實驗

表3 菌株對7 種抗菌藥的敏感性結果[20]Table 3 Antimicrobial resistance of the seven strains isolated in this study to seven antimicrobial drugs[20]

由表3可知，7株菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1對紅霉素（大環內酯類藥物）敏感，對氨芐西林、阿莫西林（青霉素類藥物）敏感，除JHZ15對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星（喹諾酮類藥物）中度敏感，JHZ17對環丙沙星中度敏感外，其余菌株對喹諾酮類藥物敏感。JNN1對鏈霉素敏感，JHZ15、JHZ17對鏈霉素有抗性，其余菌株對鏈霉素（氨基糖苷類藥物）中度敏感[15]。

2.3.2 質粒提取實驗

圖2 質粒提取結果Fig.2 The results of plasmid extraction test

由圖2可知，通過瓊脂糖凝膠電泳對菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1做質粒檢測，在任何泳道上均未出現條帶，說明在此檢測方法下未檢測到7 株菌株含有質粒。

近年來倍受關注的腸球菌攜帶的耐藥基因，例如紅霉素、萬古霉素、四環素、氯霉素和慶大霉素耐藥相關的基因都位于質粒和轉座子這些可轉移性遺傳物質上[21]。Perreten等[22]在乳酸乳球菌K214中檢測到了可轉移的耐藥質粒（pK214）。但實驗中7 株菌株均未提取到耐藥質粒，這種情況可能是由于7 株菌株本身并不帶有耐藥質粒，也可能是耐藥基因存在于細菌DNA上，即不攜帶有可轉移的耐藥基因。

3 結論與討論

近年來，乳酸菌安全性問題得到廣泛關注，大量文獻證明，多數乳酸菌菌株或使用乳酸菌進行發酵是安全可行的，但也有少量研究結果表明能夠從一些患者體內分離出乳酸菌[23]，可能與菌血癥、心內膜炎、尿道感染等疾病有關[24]。因此，對新篩選出的擬作為益生菌的乳酸菌進行安全性評價是十分必要的，尤其是用于食品的菌株[25]。盡管我國目前還沒有制定乳酸菌安全性評價的相關準則，但檢測乳酸菌菌株的毒性、耐藥性、是否產生有害代謝產物以及在體內對機體的影響等變化情況同樣必不可少。

2002年，聯合國糧農組織/世界衛生組織聯合專家委員會提出了用于食品的益生菌安全性評價指導原則[26]，建議為確保所使用益生菌菌株的安全性，至少需要進行下列實驗以驗證其安全性：1） 對其耐藥性進行評價；2）評估某些代謝活性；3）對人體實驗中出現的副作用進行評估；4）商品在市場上銷售后，要對其出現的相關副作用病例進行流行病學調查；5）如果所使用的益生菌菌株所隸屬的菌種對哺乳動物是一種已知的產毒素菌種，則被評價的該益生菌菌株必須進行產毒實驗；6）如果所使用的益生菌菌株所隸屬的菌種具潛在的溶血活性，則被評價的該益生菌菌株必須進行溶血實驗。

有些乳酸菌可能攜帶有可轉移的耐藥基因引起了人們的廣泛關注。乳酸菌自身出現耐藥性沒有危險，可以使其更好地適應環境生存下來，發揮功效，但若耐藥基因可以在乳酸菌和病原菌之間進行轉移，使某些病原菌產生耐藥性，后果將不堪設想。目前已經明確乳酸菌存在天然耐藥和獲得性耐藥[27]，天然耐藥為細菌固有耐藥，一般不具有傳遞性，乳酸菌對氨基糖苷類藥物的耐受就屬于天然耐藥[28]。而獲得性耐藥多數來自抗生素的選擇性壓力，這種抗性基因一般存在于菌體的質粒或轉座子上，腸球菌中結合轉座子和接合性質粒的存在對抗性基因在細菌之間的轉移起著重要作用[29]。Flórez等[30]研究發現抗四環素的乳酸乳球菌中含有編碼tetM的可轉移因子，使得抗性基因在不含質粒的菌株之間轉移。2007年 Hummel等[31]在沒有氯霉素耐藥表型的乳酸菌中檢測到氯霉素耐藥基因（cat），證明無耐藥表型的細菌可能攜帶耐藥基因。秦宇軒等[32]對市售酸奶進行乳酸菌分離，在對紅霉素和四環素敏感的乳酸菌中檢測到了紅霉素耐藥基因（ermB）和四環素耐藥基因（tetM）。這一結果說明對乳酸菌耐藥基因的研究不應只局限于對抗生素有抗性的乳酸菌。本實驗對7 種抗生素敏感或耐藥的菌株進行質粒提取，均未提取到耐藥質粒，不存在抗性基因轉移危險。

本實驗結果表明腸球菌屬乳酸菌JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1均具有良好的凝乳特性，菌株JHZ17、JHZ25、JHZ28、JNN1酸度低于70°T，其余菌株均≥70°T。吲哚實驗、硝酸鹽還原酶實驗、氨基脫羧酶實驗、溶血實驗均為陰性。在菌株JHZ9、JHZ15、JHZ25、JNN1和CICC23658中檢出了少量的D-乳酸。菌株JHZ9、JHZ15、JHZ17、JHZ22、JHZ25、JHZ28、JNN1對喹諾酮類（氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星）、大環內酯類（紅霉素）、青霉素類（氨芐西林、阿莫西林）藥物敏感，除JNN1對鏈霉素敏感，其他菌株對氨基糖苷類藥物（鏈霉素）有抗性或呈中度敏感，未檢測到7 株菌株含有質粒。通過體外安全性實驗中有害代謝產物和耐藥性的檢測，初步證明7 株乳酸菌安全，可為今后菌株應用于發酵生產提供部分安全性理論依據，但仍需進一步結合動物實驗和臨床實驗等安全性實驗，對其進行綜合評價。

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Safety Assessment of Enterococcus Isolated from Mare’s Milk and Its Products

WANG Meng-jiao1, LI Shao-ying1,*, LI Shu-fen2, HE Wen-ying3, SONG Xiao-min1, MA Chun-yan1, LI Zhen1, LUO Yuan4
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 3. College of Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 4. Huhhot Railway Administration, Ho hhot 010057, China)

Objective: This study aimed to isolate lactic acid bacteria (LAB) from mare’s milk and its products, which have nationality characteristics and special functions. The mare’s milk and its products were made by natural fermentation in pastoral areas of Inner Mongolia. In order to ensure their safe application in the food fermentation industry, it is necessary to assess the safety of LAB isolated from mare’s milk and koumiss. Methods: Indole test, nitrate redu ctase assay, amino decarboxylase test, hemolysis test, D-lact ic acid assay and plasmid extraction were performed to identify whether harmful metabolites or drug resistance exists in the tested strains. Results: Negative results were observed in all tests except for D-lactic acid, which was detected in small amounts in strains JHZ9, JHZ15, JHZ25 and JNN1. Neither resistance to the tested drugs nor transferable resistant plasmid was detected in seven tested strains. Conclusion: Neither harmful metabolites nor drug resistant plasmids has been detected in the seven strains, which belong to En terococcus.

lactic acid bacteria; safety; harmful metabolites; drug resistance; plasmids

Q935

A

1002-6630（2014）17-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201417039

2013-11-14

國家自然科學基金地區科學基金項目（31060014）

王夢姣（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：wmj603320463@sina.com

*通信作者：李少英（1961—），女，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：nmglshy@126.com