牦牛酸 乳分離發酵乳桿菌發酵豆漿的胃潰瘍預防效果研究

趙 欣，騫 宇

牦牛酸 乳分離發酵乳桿菌發酵豆漿的胃潰瘍預防效果研究

趙 欣，騫 宇*

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067 ）

以采自川西青藏高原的自然發 酵牦牛酸乳樣 品中分離純化得到的1株發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum Zhao，LFZ）作為研究對象，探索比較其與商業用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）發酵豆漿的胃潰瘍預防效果。通過利血平誘導胃潰瘍小鼠模型，LFZ組小鼠的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子低于ST組小鼠；血清生長抑素和血管活性腸肽水平高于ST組，胃動素和P物質水平低于ST組，且LFZ組小鼠胃潰瘍面積也低于ST組小鼠。由此可知，Lactobacillus fermentum Zhao發酵豆漿的品質優于標準嗜熱鏈球菌發酵豆漿，且其對胃潰瘍有很好的預防效果。

豆漿；乳酸菌；氨基酸態氮；大豆異黃酮；胃潰瘍

青藏高原自然發酵牦牛酸乳是藏區的一種極具地方特色的傳統發酵乳制品，具有豐富的營養、獨特的風味和抗氧化、降低膽固醇、調節機體免疫能力等保健功能，受到了越來越多的關注[1]。研究發現牦牛酸乳的保健功能很可能與其中豐富的乳酸菌菌群有極大關系，而牦牛酸乳中的乳酸菌群種類主要受各地區牧民生活習慣、擠奶及發酵的器具、發酵溫度、時間等因素的影響，故從牧區的牦牛酸乳分離出的乳酸菌與常用的商業乳酸菌有很大區別[2]。

目前因為大量的研究表明[3-5]，乳酸菌具有抑菌、增強機體免疫力、抗衰老和抗癌等生理功能，現已被廣泛應用在食品發酵工業，但我國工業中生產發酵乳制品所用的絕大部分乳酸菌均來自于國外，因此國內學者已經開始對青海、西藏和甘肅等地區牦牛發酵乳中含有的微生物進行了分離、鑒定，旨在發現具有我國自主知識產權的、保健功能顯著的乳酸菌[6-7]。

研究表明，豆漿經過發酵后，大豆中的大分子被分解成更易被人體吸收的小分子化合物，部分抗營養因子也被分解，使大豆中的營養能被人體充分利用，從而體現出比新鮮豆漿更高的營養價值[8]。因為發酵微生物中的蛋白酶使大豆中的蛋白質部分水解，使得低分子質量的多肽、游離氨基酸含量大大增加，易于腸黏膜的吸收，提高了人體對豆漿的消化吸收率，并具有一定的保健功能，對于減輕胃潰瘍患者胃部負擔有很好的幫助。同時發酵豆漿中的乳酸菌能調節腸道功能正常活動[9]。

本實驗選用來自四川阿壩藏族羌族自治州的紅原縣牧民家庭的自然發酵牦牛酸乳中分離鑒定的一株發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum Zhao，LFZ）為對象，同時選取酸乳制造工業上常用的嗜熱鏈球菌作為對照菌株，這兩種菌均為革蘭氏陽性菌，且都是酸乳制品中存在的重要菌株。利用兩種菌種生產發酵豆漿，初步分析兩種菌發酵豆漿的理化特性和預防胃潰瘍的保健功效，為將牦牛酸乳中分離到的保健功能顯著的乳酸菌運用到食品發酵工業生產和利用優質乳酸菌生產高品質保健豆漿提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商用嗜熱鏈球菌購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；乳酸菌分離自四川阿壩藏族羌族自治州的紅原縣自然發酵牦牛酸乳中分離鑒定的一株發酵乳桿菌，命名為Lactobacillus fermentum Zhao（LFZ），中國典型培養物保藏中心編號CCTCC M2013513。

發酵豆漿選用黑龍江農墾總局2012年產優質黃豆用涼水浸泡12 h打漿后用紗布過濾后得發酵前豆漿原汁，然后按105個/mL分別接種牦牛酸乳中分離的乳酸菌與商業用嗜熱鏈球菌在37 ℃條件下發酵12 h，得到發酵豆漿。

甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）、甲醛（分析純） 重慶市品譽化工有限公司；MRS培養基 上海艾研生物科技有限公司；大豆黃素、染料木素和利血平美國Sigma公司；胃動素（motillin，MOT）、生長抑素（somatostatin，SS）、P物質（substance P，SP）和血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）血清因子試劑盒 北京普爾偉業生物科技有限公司；細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ試劑盒 美國Biolegend公司。

1.2 儀器與設備

Waters 2487型高效液相色譜儀 美國Waters公司；UV-1750型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌耐受人工胃液的測定

將氯化鈉（0.2 g/100 mL）和胃蛋白酶（0.35 g/100 mL）溶解后用1 mol/L的鹽酸后調節pH值到3.0配制成人工胃液，滅菌后備用。將菌株培養液3 000 r/min離心10 min后收集菌體，再加入滅菌生理鹽水配制成為106個/mL的菌懸液，取配制好的菌懸液與的人工胃液按1∶9比例混合，搖勻后置于恒溫培養箱中37 ℃培養3 h，取培養后的菌液1 mL均勻涂抹在MRS瓊脂培養基上37 ℃培養48 h[10]。用平板計數法測定活菌數，按公式（1）計算其存活率。

1.3.2 乳酸菌耐受膽鹽的測定

將菌種5 mL按2%的接種量分別接種于含0.0、l.0 g/100 mL的牛膽汁粉（oxgall）的MRS-THIO培養基（MRS培養基中加0.2 g/100 mL的巰基乙酸鈉），在恒溫培養箱中37 ℃培養24 h后，以空白培養基（未接種的MRSTHIO培養基）為對照，分別測定上述不同質量濃度培養基的OD600nm值[10]，按照公式（2）計算菌株對膽鹽的耐受力。

1.3.3 活性異黃酮含量的測定

采用高效液相色譜法分別將大豆黃素和金雀異黃素標準品用80%乙醇溶解，配制成質量濃度為0.002～0.020 g/L的標準溶液。取標準溶液20 μL注入六通閥中，用高效液相色譜儀測定峰面積。求得回歸方程為Y大豆黃素=148 338+1.70×108X（R2=0.999）；Y金雀異黃素= -316 706+4.20×108X（R2=0.995），式中Y為異黃酮含量，X為峰面積，由此得到標準曲線。分別在發酵6、12 h時吸取2 種發酵豆漿樣品各100 mL，4 000 r/min離心得到上清，在80 ℃烘箱中干燥。干燥物用200 mL的80%乙醇80 ℃恒溫水浴中回流提取2 h，回流提取兩次。合并提取液減壓蒸干，用無水乙醇定容10 mL作為待測液，根據標準曲線得到質量濃度。

1.3.4 昆明小鼠誘導胃潰瘍實驗

SPF級昆明小鼠50 只，雄性，體質量20～25 g，適應基礎飼料1 周后，按照體質量將大鼠隨機分為5 組，分別為：正常組、胃潰瘍對照組、牦牛酸乳分離乳酸菌發酵豆漿組（LFZ組）、商業用嗜熱鏈球菌發酵豆漿組（ST組）和雷尼替丁組（陽性對照組），每組10 只，在相對濕度（50±10）%，室溫保持（24±2） ℃，12 h明暗輪換（8：00—20：00照明）條件下飼養。實驗期間，正常組和胃潰瘍對照組小鼠每日灌胃0.2 mL生理鹽水，LFZ組和ST組小鼠每日灌胃0.2 mL對應的發酵豆漿，雷尼替丁陽性對照組每日按50 mg/kg灌胃0.2 mL雷尼替丁稀釋液，在實驗過程中，未出現小鼠對灌胃物質不適出現死亡的情況。實驗期間各組小鼠自由攝食和飲水，實驗期4 周。4 周后，除正常組小鼠外，其余4 組小鼠均實施腹腔皮下注射0.2 mL利血平懸濁液（10 mg/kg）。注射24 h后，將5 組小鼠全部處死解剖，摘取小鼠全胃，浸泡入福爾馬林中，10 min后用數碼相機拍照，并使用ImageJ軟件分析胃潰瘍面積，計算胃潰瘍指數。

1.3.5 小鼠血清因子水平的測定

脫頸椎處死小鼠，取小鼠動脈血漿0.2 mL，在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清。按測試劑盒說明書的方法測定胃動素（MOL）、生長抑素（SS）、P物質（SP）和血管活性腸肽（VIP）因子在血清中的水平。

1.3.6 酶聯免疫法測定血清中細胞因子水平

脫頸椎處死小鼠，取小鼠動脈血漿0.2 mL，在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用定量酶聯檢測試劑盒，按酶聯免疫法用紫外分光光度計，在450 nm波長處檢測血清中細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平。

1.4 數據分析

使用SAS統計軟件對所得到重復3 次實驗的數據采用One-Way ANOVA法分析各組數據結果之間是否存在統計學差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

量。由圖1可知，在最初發酵的6 h兩菌種發酵豆漿中的大豆黃素和金雀異黃素質量濃度的增加較為迅速，6 h后含量基本沒有增加，整個發酵過程中牦牛酸乳中分離的LFZ發酵豆漿的大豆黃素和金雀異黃素質量濃度均高于商業嗜熱鏈球菌發酵豆漿。大豆異黃酮具有降低膽固醇、預防心血管疾病和癌癥的作用，其中大豆黃素和金雀異黃素屬于大豆異黃酮中游離型苷元類型，可以直接被人體吸收利用，是大豆異黃酮中最主要的功能性成分類型[13]。本實驗中牦牛酸乳中分離的LFZ菌發酵豆漿具有較高的游離型苷元大豆異黃酮，其功能性成分質量濃度高于商業嗜熱鏈球菌發酵豆漿。

圖1 不同菌種發酵豆漿的大豆異黃酮含量Fig.1 The contents of isoflavones in soybean milk fermented by different strains

2.1 不同菌種耐胃酸、膽鹽能力的比較

表1 乳酸菌耐胃酸、耐膽鹽的能力測定結果Table 1 Resistance of lactic acid bacteria to gastric acid and bile salt

由表1可知，牦牛酸乳分離出的LFZ乳酸菌能很明顯地耐受pH 3.0的環境，存活率達到84.33%，遠高于嗜熱鏈球菌5.63%的存活率。乳酸菌作為益生菌經過胃部存活的菌體進入小腸后將與膽鹽接觸，所以把乳酸菌對膽鹽的抵抗能力作為判斷益生菌活力的一個標準[11]。LFZ乳酸菌對不同質量濃度膽鹽有一定的耐受力，隨著膽鹽質量濃度的增加生長率略微下降，在不同質量濃度下的生長率也明顯高于嗜熱鏈球菌。酸乳菌發酵產品中的乳酸菌活菌進入人體后對人體胃液和膽鹽的抵受能力越強，其在腸道內定殖能力就越強，對人體起到的功效，特別是對人體胃腸道起到的功能性作用就越好[12]。

2.2 不同菌種發酵豆漿的大豆異黃酮含量

樣品處理后，使用高效液相色譜儀進行測定，對照標準曲線得到待測樣品中大豆黃素和金雀異黃素的含

2.3 不同菌種發酵豆漿對小鼠胃潰瘍指數的影響

圖2 不同菌種發酵豆漿對小鼠胃潰瘍的觀察Fig.2 Effect of soybean milk fermented by different strains on gastric ulcer in mice

對灌胃發酵豆漿的小鼠用利血平誘導胃潰瘍后觀察小鼠胃部潰瘍程度，由圖2可知，對照組的潰瘍最為嚴重，潰瘍面積達到（6.58±1.77）mm2，灌食LFZ發酵豆漿和ST發酵豆漿的小鼠胃潰瘍面積分別下降到（2.41±1.13）mm2和（3.84±1.55）mm2，通過計算可得知LFZ發酵豆漿組的胃潰瘍指數（胃潰瘍抑制率）為63.4%，ST發酵豆漿組為41.6%。雷尼替丁是一種具有良好藥效的治療胃潰瘍藥物，灌胃雷尼替丁小鼠的胃潰瘍面積和指數大大下降，為（1.31±0.24）mm2和80.1%。

發酵豆漿不僅能提供易于消化營養和能量給胃潰瘍患者，其含有的部分功能性物質還能對胃潰瘍起到預防作用，其中重要的一個功能性成分就是大豆異黃酮。大豆黃素和金雀異黃素是最易被人體利用的大豆異黃酮，大豆異黃酮是一種有效的抗氧化劑，同時也是一種對炎癥有預防和抑制效果物質[14]。胃潰瘍表現為胃黏膜組織損傷，也引發組織出現炎癥，出現胃潰瘍的情況下由于胃部不適，患者進食困難，慢性胃潰瘍患者長期進食困難，還會引起營養不良、免疫力下降等問題[15]。豆漿既能在一定程度上滿足患者的營養需要，其含有的功效成分還有利于緩解胃潰瘍，而發酵后的豆漿，由于生產了更多的發酵產物，營養更為均衡[16]，更有利于患者補充營養，增強自身抵抗力和修復組織損傷的能力，同時發酵后豆漿中的不宜被人體吸收的部分大豆異黃酮中轉化為更易吸收的大豆黃素和金雀異黃素這兩種大豆異黃酮物質[13]，能更好的起到對炎癥的抑制作用。有研究[17]也表明，金雀異黃素及其苷元是大豆異黃酮中含量最高的成分，是大豆異黃酮產品中最有效的功能成分，具有多種生理功能，包括抗潰瘍作用。金雀異黃素分子與功能性生物大分子相互之間的作用不理想，使得其在人體中的作用減弱，加之金雀異黃素親水性弱，進入體內迅速被代謝，金雀異黃素含量低的食品起到功能性效果不明顯[18]。大豆制品經過發酵后其功能性大分子化合物許多被分解為小分子化合物[8]，與金雀異黃素的相互作用可能得到了加強，同時采用更好的發酵菌種發酵增加了金雀異黃素的生成，使發酵豆漿中的金雀異黃素含量增加，可以增強營養價值、改善功效。牦牛酸乳中分離的LFZ發酵的豆漿比商業嗜熱鏈球菌發酵的豆漿產生了更多的大豆黃素和金雀異黃素，LFZ發酵豆漿的保健功能也更優越，表現出的對胃潰瘍的預防效果也更為明顯。

2.4 不同菌種發酵豆漿的對小鼠細胞因子的影響

由圖3可知，相對于正常組，胃潰瘍對照組的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平明顯著增加（P＜0.05）；而LFZ發酵豆漿和ST發酵豆漿組均能不同程度降低IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平，LFZ發酵豆漿組表現更為明顯，雷尼替丁組的細胞因子水平較對照組大幅度降低，最為接近正常組。胃潰瘍發生后引發胃部組織炎癥，血液中的炎癥相關細胞因子發生改變，IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ是最為典型的炎癥相關因子，出現炎癥時，這4種因子在血液中的含量會明顯升高[19]，由此可以看出LFZ發酵豆漿對胃潰瘍的預防作用較商業嗜熱鏈球菌發酵的豆漿更為明顯。發酵豆漿中最重要的功能性成分是大豆異黃酮，經過發酵后大豆黃素和金雀異黃素這兩種大豆異黃酮中主要成分的質量濃度顯著升高，大豆異黃酮則可能是抗胃潰瘍作用的主要成分。

圖3 不同菌種發酵豆漿對小鼠細胞因子的效果Fig.3 Effect of soybean milk fermented by different strains on cytokine levels in mice

2.5 不同菌種發酵豆漿對小鼠血清因子的影響

由圖4可知，相對于正常組，胃潰瘍對照組小鼠表現出最高的MOT和SP因子水平和最低的SS和VIP因子水平；而正常組小鼠表現出相反的趨勢。LFZ發酵豆漿和ST發酵豆漿組均能顯著降低血清MOT和SP因子水平，增加SS和VIP因子水平（P＜0.05）。LFZ發酵豆漿組小鼠的各血清因子水平最接近正常組和陽性對照雷尼替丁組，表現出最好的胃潰瘍預防效果。MOT和SP是興奮性胃腸激素，被刺激后含量升高，MOT被刺激后能引起胃酸大量分泌[20]，大量胃酸會加劇胃潰瘍程度[21]。SS和VIP是抑制性胃腸激素，可以抑制胃酸的分泌[22]。LFZ發酵豆漿灌胃小鼠的胃酸分泌被更好地抑制，胃潰瘍引起的血清因子變化減弱，表現出更好的胃潰瘍預防效果。

圖4 不同菌種發酵豆漿對小鼠血清因子的效果Fig.4 Effect of soybean milk fermented by different strains on serum factor levels in mice

3 結 論

從本實驗結果可以看出，LFZ發酵豆漿的抗人工胃液和膽鹽能力均與一般商業嗜熱鏈球菌有明顯差異，LFZ較商業嗜熱鏈球菌具有更強的耐受人工胃液和膽鹽能力。通過成分測定也可以看出LFZ發酵豆漿中的大豆黃素和金雀異黃素明顯高于嗜熱鏈球菌發酵豆漿。結合利血平誘導胃潰瘍動物實驗，從對胃功能性效果方面對兩種菌株發酵的豆漿進行動物實驗后，通過對小鼠胃組織損傷面積血漿中因子水平進行比較，得出LFZ發酵豆漿能更好地緩解胃組織因為利血平造成的損害，具有更好的胃保護功能。綜合本實驗中各項結果可以看出牦牛酸乳中分離的乳酸菌LFZ發酵豆漿中的功能性成分大豆異黃酮含量升高，發酵豆漿具有更好的品質和保健功效，充分利用牦牛酸乳中分離得到的乳酸菌可以開發生產出品質更優的發酵制品。

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Gastric Ulcer-Preventive Activity of Lactobacillus fermentum Zhao Isolated from Yak Yogurt

ZHAO Xin, QIAN Yu*
(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Lactobacillus fermentum Zhao (LFZ), a novel strain of Lactobacillus isolated from naturally fermented yak yogurt in the Qinghai-Tibet Plateau in western Sichuan, has been found to have good viability in simulated gastric fluid and stronger cholate resistance than Streptococcus thermophilus (ST). This study aimed to compare the gastric ulcer-preventive activity of LFZ-fermented soybean milk with the commercial ST-fermented sample when orally administered to mice. By using reserpine-induced gastric ulcer mice model as a control group, IL-6, IL-12, TNF-α and IFN-γ cytokine levels of the mice in LFZ group were lower than those of the mice in ST group. The serum SS (somatostatin) and VIP (vasoactive intestinal peptide) levels of LFZ mice were higher than those of ST mice, and the MOT (motillin) and SP (substance P) levels were lower than those of ST mice. The gastric ulcer area of LFZ mice was also smaller than that of ST mice. These results suggest that LFZ-fermented soybean milk shows better quality and gastric ulcer-preventive activity than the ST-fermented one.

soybean milk; Lactobacillus; amino nitrogen; isoflavone; gastric ulcer

TS201.1

A

1002-6630（2014）17-0236-05

10.7506/spkx1002-6630-201417045

2013-09-02

重慶市教委科學技術研究項目（KJ131501）

趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：foods@live.cn

*通信作者：騫宇（1976—），女，講師，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：foodmed@live.com